木瓜蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶的活力用分解出來(lái)的酪氨酸來(lái)表示。目前國(guó)內(nèi)通用的蛋白酶的活力單位定義為:1min水解出1g酪氨酸的酶量稱(chēng)為1個(gè)單位。因此，在測(cè)定酶活力之前，先用福林酚試劑與已知的不同濃度的酪氨酸反應(yīng)，作出藍(lán)色深淺程度（用0D值來(lái)表示）與酪氨酸濃度關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將酶和底物反應(yīng)的產(chǎn)物與福林酚試劑作用，在分光光度計(jì)上讀出光密度，再在標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出相當(dāng)于多少g的酪氨酸，計(jì)算出酶活力單位木瓜蛋白酶是天然復(fù)合蛋白酶，通常，測(cè)定其酶活力時(shí)間長(zhǎng)，操作復(fù)雜，且需要瑪瑙研缽等昂貴儀器。由于木瓜蛋白酶中的各種酶與酪蛋白作用生成的產(chǎn)物是一致的，即酶催化蛋白質(zhì)的肽鍵水解，生成游離的氨基酸或多肽。因此可以利用福林酚試劑與水解出來(lái)的酪氨酸作用，生成藍(lán)色物質(zhì)，通過(guò)分光光度比色法可以計(jì)算出酶活力的大小（1） 福林酚試劑：稱(chēng)取鎢酸鈉（Na2wo4?2H20）25g、鉬酸鈉Na2MnO4?2H20）25g放入2000m1圓底燒瓶中，加入175ml蒸餾水，再加入50ml85%的磷酸及100ml濃鹽酸。裝好回流冷凝管（接口處包有鋁薄或玻璃紙的軟木塞），加熱到沸騰，然后用/1、火保持緩和的沸騰狀態(tài)，回流10h，回流結(jié)束后加入150g硫酸鋰Li2SO4和50ml水，并在沸騰（不必裝冷凝管）時(shí)立即加入幾滴漠液（應(yīng)趁熱加漠，否則沒(méi)有充分作用就揮發(fā)完了），待作用數(shù)分鐘后再煮沸15min以除去過(guò)量的漠。加漠的作用是除掉溶液中的綠色。如果溶液仍呈綠色，可再加入幾滴漠液，再煮沸除去多余的漠直至試劑呈黃色。冷卻后稀釋至1000ml（原液），過(guò)濾，貯于棕色瓶，f臨用前將此原液加入2倍蒸餾水稀釋而成。（2） 標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液稱(chēng)取100mg酪氨酸（預(yù)先在105°C烘箱內(nèi)烘至匣重），以0.2NHC1溶解后定容到100ml再用水稀釋5倍，即得到2001,zg/L的酪氨酸溶液.（3） 酪蛋白溶液稱(chēng)取酪蛋白2g，置于100ml三角瓶中，加入0.2mol/LNazHPO61ml置水浴上攪動(dòng)使其溶解，然后傾出上清液（可能有少量蛋白質(zhì)顆粒不能完全溶解），加入39ml0.2mol/LNaH2PO，得到pH7.0的酪蛋白溶液，其余幾種pH的酪蛋白液可照此法制備，pH5.8酪蛋白液用H3PO調(diào)節(jié)，pH8.5酪蛋白液可全部用Na2HPO配制，再用NaOH調(diào)節(jié)至8.5。表1是不同pH的緩沖液配制表。

表1不同pH的緩沖液配制表PH6.57.07.55.80.2mol/LNaH2PO468.5ml39ml16ml92ml0.2mol/LNa2l1PO43L5ml61mlK4ml8nil酶溶液：稱(chēng)取1.Og酶粉加入500mlpH7.0的緩沖液中，在室溫中放置lh,攪拌。把酶浸出液過(guò)濾，取濾液lml用緩沖液稀釋至100ml,即為稀釋5x104倍的酶液。做pH影響的試驗(yàn)中，酶液應(yīng)該用所需的pH緩沖液稀釋。O.4mol/LNa2CO3O.4mol/L三氯醋酸(TCA)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作取6支小試管按表2加入酪氨酸及蒸餾水，得到一系列不同濃度的酪氨酸溶液表2 不同濃度酪氨酸溶液配制表管號(hào)標(biāo)準(zhǔn)酪氮酸(200|xg/mg)加入量(ml)IbO加入量(ml)酪氮酸最終濃度(|Ag/ml)105.0020+54.5203LO4.04041.53.56052.03.08。62.52.5100將不同濃度酪氨酸溶液吸取lml于6支試管中。按表3次序逐個(gè)加入試劑，并混合均勻，然后置于40?C恒溫水浴中保溫20rain,在721型分光光度計(jì)上讀取光密度(取680nm)。表3 不同濃度酷氨酸溶液對(duì)應(yīng)光密度表管號(hào)酪氨酸量3g)0,4iik>1/LGnl)福林酚試劑(ml)680nm下OD值105102如510.215340510.48()4605J0.660580510.8606100511.15()以表3酪氨酸濃度為橫座標(biāo)，光密度為縱座標(biāo)，繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.2蛋白酶活力測(cè)定蛋白酶活力測(cè)定的操作包括：a酶和底物混合保溫；b停止酶的作用；c過(guò)濾；d顯色等4個(gè)步驟。⑴取4支試管，每管中加入酶液lml第一管作為對(duì)照(在同樣條件下，由于酶以外的種種因素所引起的變化，例如底物、試劑等本身所產(chǎn)生的顏色稱(chēng)為空白，在此色時(shí)用管調(diào)節(jié)分光光度計(jì)的光密度為o’，使其它3管在分光光度計(jì)上讀得的光密度值，直接代表酶的活力)。加入o.4mol/LTCA2ml使酶在沒(méi)有遇到底物時(shí)已經(jīng)失去活性。在另外3支試管內(nèi)加入lml酪蛋溶液(pH7)，將4支試管同時(shí)放人40%z?浴準(zhǔn)確保溫10min向第2、3、4管內(nèi)加入2ml0.4mol/LTCA，停止酶作用，對(duì)照管內(nèi)加入lml酪蛋白溶液，在40?C7J?中保溫10min,使蛋白質(zhì)沉淀完全。過(guò)濾，除去沉淀的酶蛋白和酪蛋白。從每一管中取濾液lml分別注入4支試管中，然后各加入0.4mol/LNaCO5ml、福林酚試劑lml，在40qEA~浴保溫20min顯色，在分光光度計(jì)

Az用680nm讀取光密度（表4）。1.2.3酶活力任算將酶活力測(cè)定中所得DD值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得酪氨酸微克數(shù)，按下式H-曾號(hào)隘液gift赍白H-曾號(hào)隘液gift赍白40^fl/4tr>41TCA￡唯骼旌白AMam憤漁OAwl/IAHiCU,福林恥￡利4jOY：uaaTEM位ImlIcnl2ro]IralZrnlImlImJE5nilImlTriJ03203ImlImDInJInd2ia12mJ,IfJirjinIiitlInd(P.31I4算景4at白酪商力剃定時(shí)加研濯曜，TCA?、NhXX虹毋、福林酚誠(chéng)刑■及68?iun下的茹值在生產(chǎn)和科研工作中常常需要測(cè)定酶活力，可在標(biāo)準(zhǔn)曲線制作好了以后，求出k值，再按下式計(jì)算：木瓜蛋白酶活力單位=OD?K?4/10?N式中：DD一光密度讀數(shù)，計(jì)算時(shí)可用平均值K一光密度為1時(shí)酪氨酸微克數(shù)即在酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上取1O0b?g的D.D值，用100除以O(shè)D值，即得K值。本次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線上相當(dāng)于1O01?g酪氨酸的OD為1.15，