現(xiàn)代分子診斷技術(shù)2

利用核酸雙鏈的堿基互補(bǔ)、變性和復(fù)性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測(cè)樣本中的單鏈核酸互補(bǔ)配對(duì)，以判斷有無(wú)互補(bǔ)的同源核酸序列的存在

核酸探針

是指帶有標(biāo)記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測(cè)樣本中單鏈核酸分子互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而檢測(cè)同源序列

探針標(biāo)記物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類(lèi)目前一頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)分離雜交探針的方法：提取某一病原微生物株系的染色體DNA限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶解得到的酶解片段克隆進(jìn)一質(zhì)粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫(kù)文庫(kù)中重組質(zhì)粒的插入片段即可用來(lái)分別同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA進(jìn)行雜交、篩選目前二頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)核酸雜交的靈敏度和可靠性極高用探針直接同糞便樣品、尿樣、血樣、喉洗液和組織樣品中的目標(biāo)DNA進(jìn)行雜交，且無(wú)需預(yù)先純化DNA若樣品中的目標(biāo)分子非常少，則需通過(guò)PCR將目的序列擴(kuò)增，再進(jìn)行雜交檢測(cè)

從理論上講，用DNA雜交來(lái)診斷疾病可用于對(duì)所有的致病微生物的檢測(cè)目前三頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)4、非同位素標(biāo)記探針32P的缺點(diǎn)：⑴半衰期短，僅13天⑵操作起來(lái)比較危險(xiǎn)⑶必須要有特殊的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備進(jìn)行操作⑷放射性垃圾的處理繁瑣目前四頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)非放射性雜交檢測(cè)系統(tǒng)：通過(guò)酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達(dá)到放大信號(hào)的目的采用將生物素（biotin）標(biāo)記的核苷酸摻入DNA的方法制備探針生物素標(biāo)記的DNA在室溫下至少可保存一年檢測(cè)發(fā)光和顏色變化可在幾小時(shí)內(nèi)完成目前五頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)BBBBAPBBAP生物素加入鏈霉素抗生物蛋白加入生物素標(biāo)記的堿性磷酸酶探針目的DNA加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光底物目前六頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)熒光標(biāo)記的引物直接進(jìn)行PCR檢測(cè)DNA引物1引物2熒光染料PCR層析熒光檢測(cè)游離引物目前七頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)分子夾心探針檢測(cè)發(fā)出熒光分子夾心探針(沒(méi)有熒光)熒光團(tuán)猝滅劑目的DNA與目的DNA雜交目前八頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)TaqMan探針技術(shù)原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號(hào)，由于探針與模板特異性結(jié)合，熒光的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量目前九頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)3′5′5′3′QR上游引物下游引物5

′3′3′5

′QRTaqMan探針的熒光信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制目前十頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)瘧疾的分子診斷：檢測(cè)是否存在瘧原蟲(chóng)抽取血樣進(jìn)行鏡檢免疫診斷:ELISA檢測(cè)瘧原蟲(chóng)蛋白或抗體

無(wú)法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染DNA雜交診斷例一：目前十一頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)DNA的雜交探針是一段瘧原蟲(chóng)的高度重復(fù)的DNA序列具體的分離過(guò)程：構(gòu)建一個(gè)瘧原蟲(chóng)的核基因文庫(kù)用標(biāo)記的瘧原蟲(chóng)核DNA作探針去篩選核基因文庫(kù)選出那些雜交信號(hào)最強(qiáng)的克隆用這些選出來(lái)的片段作探針，與瘧原蟲(chóng)及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為DNA探針的可靠性目前十二頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)錐蟲(chóng)的檢測(cè)

錐蟲(chóng)在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細(xì)胞顯微鏡檢新鮮血液取新鮮血液感染未攜帶錐蟲(chóng)的寄生蟲(chóng),30-40天后殺死昆蟲(chóng),鏡檢昆蟲(chóng)的腸道免疫檢測(cè):假陽(yáng)性高例二：目前十三頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)PCR檢測(cè)針對(duì)錐蟲(chóng)特有的一段188bp的DNA序列設(shè)計(jì)引物，特異地從錐蟲(chóng)基因組中擴(kuò)增得到188bp的條帶目前十四頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)二、細(xì)菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù)抗生素的不合理使用DNA雜交PCR檢測(cè)噬菌體介導(dǎo)目前十五頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)DNA雜交設(shè)計(jì)16SrRNA為探針16SrRNA在細(xì)菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性特異性不是很好必須結(jié)合PCR技術(shù)目前十六頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)PCR檢測(cè)nestedPCR針對(duì)目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計(jì)多對(duì)引物每對(duì)引物都能特異的擴(kuò)增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加目前十七頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)模板使用外引物，進(jìn)行第一次PCR擴(kuò)增使用內(nèi)引物，進(jìn)行第二次PCR擴(kuò)增第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物巢式PCR原理示意圖目前十八頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)PCR技術(shù)也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性新擴(kuò)增的目的DNA特異性不強(qiáng)退火溫度過(guò)低模板中雜質(zhì)的污染假陰性存在Taq酶的抑制劑模板量過(guò)少模板DNA純度不夠目前十九頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)原位PCR(insituPCR,ISPCR)在細(xì)胞或細(xì)胞切片上對(duì)待測(cè)的低拷貝數(shù)基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過(guò)原位雜交進(jìn)行檢測(cè)不僅能檢測(cè)出病原微生物的存在，且能夠在組織細(xì)胞中定位目前二十頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）

將標(biāo)記探針與細(xì)胞或組織切片中的核酸進(jìn)行雜交，進(jìn)而檢測(cè)特異的DNA或RNA序列

細(xì)胞原位雜交組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類(lèi)雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點(diǎn)：不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)有目前二十一頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)噬菌體介導(dǎo)細(xì)菌檢測(cè)將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測(cè)樣品噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會(huì)有熒光產(chǎn)生結(jié)核菌的檢測(cè)抗藥性菌株的檢測(cè)目前二十二頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)熒光素酶熒光素＋ATP熒光利用宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、翻譯噬菌體基因熒光素酶基因宿主細(xì)菌噬菌體介導(dǎo)的細(xì)菌檢測(cè)目前二十三頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)第三節(jié)DNA指紋每個(gè)人體細(xì)胞內(nèi)都含有23對(duì)染色體，每條染色體中部含有一個(gè)DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在DNA分子中存在三種類(lèi)型：?jiǎn)慰截愋蛄?、中等程度重?fù)序列、高度重復(fù)序目前二十四頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)每個(gè)重復(fù)序列在300個(gè)核苷酸長(zhǎng)度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過(guò)超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要DNA帶的附近，所以也稱(chēng)衛(wèi)星DNA，其中的重復(fù)序列單元?jiǎng)t稱(chēng)為“小衛(wèi)星DNA”“小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星DNA“中有一小段序列則在所有個(gè)體中都一樣，稱(chēng)為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來(lái)作為分子探針與不同個(gè)體的DNA進(jìn)行分子雜交，就會(huì)出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專(zhuān)一性和特異性，因此稱(chēng)作“DNA指紋”通過(guò)對(duì)人類(lèi)基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間99．99％的堿基序列都相同，而剩下的0.01%的堿基特征序列則來(lái)自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定”目前二十五頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)所羅門(mén)的審判：

大家都聽(tīng)說(shuō)過(guò)所羅門(mén)的審判這樣一件故事：兩位婦人都聲稱(chēng)自己是孩子的母親，于是所羅門(mén)就命令一名侍衛(wèi)把那個(gè)孩子帶來(lái)，要用劍將其辟成兩半分給他們兩，結(jié)果假母親同意所羅門(mén)的判決，而孩子真正的母親卻懇求侍衛(wèi)饒了孩子的性命，她解釋說(shuō)：“把孩子給了假母親，總比讓孩子慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了。目前二十六頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)滴骨驗(yàn)親法：

以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認(rèn)為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。三國(guó)時(shí)代（公園220—280年）謝承著《會(huì)稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時(shí)一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴(yán)重腐敗而無(wú)法辨認(rèn)死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認(rèn)其兄的尸骨。目前二十七頁(yè)\總數(shù)三十頁(yè)\編于十三點(diǎn)合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”來(lái)識(shí)別親權(quán)。明末清初的檢驗(yàn)書(shū)籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認(rèn)識(shí)。難辨真?zhèn)巍Ｃ鞔坛鲅?，滴一器?nèi)