現(xiàn)代分子診斷技術(shù)2

利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復(fù)性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在

核酸探針

是指帶有標記的某一特定DNA或RNA片斷，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結(jié)合，進而檢測同源序列

探針標記物有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、熒光素等）兩大類目前一頁\總數(shù)三十頁\編于十三點分離雜交探針的方法：提取某一病原微生物株系的染色體DNA限制性內(nèi)切酶進行酶解得到的酶解片段克隆進一質(zhì)粒載體，構(gòu)建質(zhì)粒文庫文庫中重組質(zhì)粒的插入片段即可用來分別同病原性微生物和非病原性微生物的核DNA進行雜交、篩選目前二頁\總數(shù)三十頁\編于十三點核酸雜交的靈敏度和可靠性極高用探針直接同糞便樣品、尿樣、血樣、喉洗液和組織樣品中的目標DNA進行雜交，且無需預(yù)先純化DNA若樣品中的目標分子非常少，則需通過PCR將目的序列擴增，再進行雜交檢測

從理論上講，用DNA雜交來診斷疾病可用于對所有的致病微生物的檢測目前三頁\總數(shù)三十頁\編于十三點4、非同位素標記探針32P的缺點：⑴半衰期短，僅13天⑵操作起來比較危險⑶必須要有特殊的實驗室設(shè)備進行操作⑷放射性垃圾的處理繁瑣目前四頁\總數(shù)三十頁\編于十三點非放射性雜交檢測系統(tǒng)：通過酶促反應(yīng)將某種底物轉(zhuǎn)變成生色物質(zhì)或化學(xué)發(fā)光物質(zhì)而達到放大信號的目的采用將生物素（biotin）標記的核苷酸摻入DNA的方法制備探針生物素標記的DNA在室溫下至少可保存一年檢測發(fā)光和顏色變化可在幾小時內(nèi)完成目前五頁\總數(shù)三十頁\編于十三點BBBBAPBBAP生物素加入鏈霉素抗生物蛋白加入生物素標記的堿性磷酸酶探針目的DNA加入不同的生色或化學(xué)發(fā)光底物目前六頁\總數(shù)三十頁\編于十三點熒光標記的引物直接進行PCR檢測DNA引物1引物2熒光染料PCR層析熒光檢測游離引物目前七頁\總數(shù)三十頁\編于十三點分子夾心探針檢測發(fā)出熒光分子夾心探針(沒有熒光)熒光團猝滅劑目的DNA與目的DNA雜交目前八頁\總數(shù)三十頁\編于十三點TaqMan探針技術(shù)原理：利用Taq酶的3′5′外切核酸酶活性，切斷探針，產(chǎn)生熒光信號，由于探針與模板特異性結(jié)合，熒光的強弱就代表了模板的數(shù)量目前九頁\總數(shù)三十頁\編于十三點3′5′5′3′QR上游引物下游引物5

′3′3′5

′QRTaqMan探針的熒光信號產(chǎn)生機制目前十頁\總數(shù)三十頁\編于十三點瘧疾的分子診斷：檢測是否存在瘧原蟲抽取血樣進行鏡檢免疫診斷:ELISA檢測瘧原蟲蛋白或抗體

無法區(qū)分是以前感染還是現(xiàn)在感染DNA雜交診斷例一：目前十一頁\總數(shù)三十頁\編于十三點DNA的雜交探針是一段瘧原蟲的高度重復(fù)的DNA序列具體的分離過程：構(gòu)建一個瘧原蟲的核基因文庫用標記的瘧原蟲核DNA作探針去篩選核基因文庫選出那些雜交信號最強的克隆用這些選出來的片段作探針，與瘧原蟲及其同屬中不導(dǎo)致瘧疾的種的核基因作雜交，以檢查該片段作為DNA探針的可靠性目前十二頁\總數(shù)三十頁\編于十三點錐蟲的檢測

錐蟲在人體中可侵入肝、脾、淋巴結(jié)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在其中大量繁殖并殺死寄主細胞顯微鏡檢新鮮血液取新鮮血液感染未攜帶錐蟲的寄生蟲,30-40天后殺死昆蟲,鏡檢昆蟲的腸道免疫檢測:假陽性高例二：目前十三頁\總數(shù)三十頁\編于十三點PCR檢測針對錐蟲特有的一段188bp的DNA序列設(shè)計引物，特異地從錐蟲基因組中擴增得到188bp的條帶目前十四頁\總數(shù)三十頁\編于十三點二、細菌性傳染病及病毒性疾病的分子診斷技術(shù)抗生素的不合理使用DNA雜交PCR檢測噬菌體介導(dǎo)目前十五頁\總數(shù)三十頁\編于十三點DNA雜交設(shè)計16SrRNA為探針16SrRNA在細菌中拷貝數(shù)極高，高度的保守性特異性不是很好必須結(jié)合PCR技術(shù)目前十六頁\總數(shù)三十頁\編于十三點PCR檢測nestedPCR針對目的病原菌的不同保守區(qū)段設(shè)計多對引物每對引物都能特異的擴增出一段目的片段，病原菌存在的可能性大大增加目前十七頁\總數(shù)三十頁\編于十三點模板使用外引物，進行第一次PCR擴增使用內(nèi)引物，進行第二次PCR擴增第一次PCR擴增產(chǎn)物第二次PCR擴增產(chǎn)物巢式PCR原理示意圖目前十八頁\總數(shù)三十頁\編于十三點PCR技術(shù)也會產(chǎn)生假陽性新擴增的目的DNA特異性不強退火溫度過低模板中雜質(zhì)的污染假陰性存在Taq酶的抑制劑模板量過少模板DNA純度不夠目前十九頁\總數(shù)三十頁\編于十三點原位PCR(insituPCR,ISPCR)在細胞或細胞切片上對待測的低拷貝數(shù)基因進行擴增，并通過原位雜交進行檢測不僅能檢測出病原微生物的存在，且能夠在組織細胞中定位目前二十頁\總數(shù)三十頁\編于十三點原位雜交（nucleicacidhybridizationinsitu）

將標記探針與細胞或組織切片中的核酸進行雜交，進而檢測特異的DNA或RNA序列

細胞原位雜交組織切片原位雜交

DNA-DNARNA-DNA

三類雜交

RNA-RNA

該法優(yōu)點：不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)有目前二十一頁\總數(shù)三十頁\編于十三點噬菌體介導(dǎo)細菌檢測將熒光素酶基因引入到噬菌體的基因組，然后用轉(zhuǎn)基因噬菌體去侵染待測樣品噬菌體侵染該宿主菌，大量合成包括熒光素酶在內(nèi)的由噬菌體基因編碼的蛋白，向體系中加入熒光素和ATP，就會有熒光產(chǎn)生結(jié)核菌的檢測抗藥性菌株的檢測目前二十二頁\總數(shù)三十頁\編于十三點熒光素酶熒光素＋ATP熒光利用宿主細胞轉(zhuǎn)錄、翻譯噬菌體基因熒光素酶基因宿主細菌噬菌體介導(dǎo)的細菌檢測目前二十三頁\總數(shù)三十頁\編于十三點第三節(jié)DNA指紋每個人體細胞內(nèi)都含有23對染色體，每條染色體中部含有一個DNA分子，DNA分子中的核苷酸序列包含著遺傳信息，在DNA分子中存在三種類型：單拷貝序列、中等程度重復(fù)序列、高度重復(fù)序目前二十四頁\總數(shù)三十頁\編于十三點每個重復(fù)序列在300個核苷酸長度之內(nèi)，由于高度重復(fù)，序列經(jīng)過超離心后以衛(wèi)星帶出現(xiàn)在主要DNA帶的附近，所以也稱衛(wèi)星DNA，其中的重復(fù)序列單元則稱為“小衛(wèi)星DNA”“小衛(wèi)星”具有高度的可變性，但在“小衛(wèi)星DNA“中有一小段序列則在所有個體中都一樣，稱為“核心序列”。如果把核心序列串聯(lián)起來作為分子探針與不同個體的DNA進行分子雜交，就會出現(xiàn)各自特有的雜交圖譜。它們與人的指紋一樣具有專一性和特異性，因此稱作“DNA指紋”通過對人類基因組的解析，發(fā)現(xiàn)人與人之間99．99％的堿基序列都相同，而剩下的0.01%的堿基特征序列則來自于雙親，據(jù)此可用于“親子鑒定”目前二十五頁\總數(shù)三十頁\編于十三點所羅門的審判：

大家都聽說過所羅門的審判這樣一件故事：兩位婦人都聲稱自己是孩子的母親，于是所羅門就命令一名侍衛(wèi)把那個孩子帶來，要用劍將其辟成兩半分給他們兩，結(jié)果假母親同意所羅門的判決，而孩子真正的母親卻懇求侍衛(wèi)饒了孩子的性命，她解釋說：“把孩子給了假母親，總比讓孩子慘死好?！碑?dāng)然，真假母親也就水落石出了。目前二十六頁\總數(shù)三十頁\編于十三點滴骨驗親法：

以生者的血滴在尸骨上，觀察血能否浸入骨內(nèi)，浸入的則被認為兩者有血緣關(guān)系，在各種古籍中有多種記錄。三國時代（公園220—280年）謝承著《會稽先賢傳》中的《以弟血滴兄骨》可能是記錄此法的最早的史料：陳業(yè)的哥哥因海難不幸殞命，當(dāng)時一同遇難的有五六十人，并且尸體都已嚴重腐敗而無法辨認死者的身份。陳業(yè)就用刀刺破自己的手臂將血分別滴在尸骨上，發(fā)現(xiàn)其血液只能浸入一具尸骨，其余皆不能。陳業(yè)就這樣確認其兄的尸骨。目前二十七頁\總數(shù)三十頁\編于十三點合血法：

等到了明代，更是采用了“合血法”來識別親權(quán)。明末清初的檢驗書籍中都有相同的記載：“親子兄弟或自幼分離，欲相認識。難辨真?zhèn)?。命各刺出血，滴一器?nèi)