植物組培室設(shè)備及培養(yǎng)條件

植物組培室設(shè)備及培養(yǎng)條件

組培室建設(shè)首要考慮的問(wèn)題就是組培室需要哪些設(shè)備條件和需要什么樣的培養(yǎng)條件。對(duì)這些有了全面了解以后，我們便可以因地制宜地新建或利用現(xiàn)有房屋建設(shè)實(shí)驗(yàn)室。在設(shè)計(jì)組培室時(shí)，一般情況應(yīng)按組培的流程來(lái)設(shè)計(jì)，同時(shí)考慮人物分流順暢，空間合理利用。植物組織培養(yǎng)要求嚴(yán)格的無(wú)菌的條件，需要一定專業(yè)儀器設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。第一、實(shí)驗(yàn)室一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)包括洗滌室、配置室、接種室、培養(yǎng)室、觀察室（冷卻室）、滅菌室、洗苗室等。在實(shí)際中可結(jié)合可行條件，合并一部分。（一）洗滌室洗滌室完成玻璃器皿和其它儀器的清洗、干燥和貯存。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，用于培養(yǎng)器皿的洗滌，最好是內(nèi)襯白瓷磚的水泥槽。為防止碰壞玻璃器皿，可鋪橡膠板，上下水道要暢通。備有大型塑料筐，用于放置培養(yǎng)器皿?？芍苯又糜跀R架上，以節(jié)約空間和便于運(yùn)輸工作。備有空干架，以空干涮凈的培養(yǎng)器皿。（二）配置室、滅菌室（可分開(kāi)）準(zhǔn)備室要求明亮、通風(fēng)。在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。如果房間較多，可將準(zhǔn)備室分為洗滌室和配置室兩部分。洗滌室專門(mén)負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。為完成培養(yǎng)基的制備工作，準(zhǔn)備室還應(yīng)配備以下儀器設(shè)備：1．工作臺(tái)。其高度應(yīng)方便配制工作。2．藥品柜。用以放置常用藥品。3．普通冰箱。。主要用于貯存母液、各種易變質(zhì)、易分解的化學(xué)藥品以及植物材料等。4．電子分析天平和托盤(pán)天平。電子分析天平精確度為0.001g，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品；托盤(pán)天平精確度為0.1g，用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。天平應(yīng)放置在干燥、不受振動(dòng)的固定操作臺(tái)上。5．純水儀或電蒸餾水器。純水儀提供純水，水質(zhì)好。電蒸餾水器，采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。蒸餾水用于配制母液或培養(yǎng)基，配培養(yǎng)基可用自來(lái)水來(lái)代替，若實(shí)驗(yàn)要求嚴(yán)格的話，則須用蒸餾水。6．磁力攪拌器磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等。磁力攪拌器還可加熱，使之更利于溶解。7．恒溫水浴鍋或恒溫振蕩水浴。水浴鍋用于難溶藥品的溶解、瓊脂的溶化等。若沒(méi)有水浴鍋，也可用1500或2000W電爐或電飯鍋代替。電爐應(yīng)配有鋁鍋。8．酸度計(jì)組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基pＨ值的準(zhǔn)確度是十分重要的，應(yīng)當(dāng)使用酸度計(jì)，若無(wú)酸度計(jì)，也可使用pH試紙進(jìn)行粗測(cè)。首次使用酸度計(jì)前，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位，然后固定。測(cè)量pＨ時(shí)，待測(cè)液必須充分?jǐn)嚢杈鶆颉Ｈ绻囵B(yǎng)基溫度過(guò)高，測(cè)量時(shí)要調(diào)整pＨ計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。注意保護(hù)好玻璃電極，用后電極應(yīng)用蒸餾水沖洗凈，蓋上電極帽。9．培養(yǎng)基分裝設(shè)備。小型組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可采用燒杯、漏斗等作為分裝培養(yǎng)基的工具。也可采用醫(yī)用“下口杯”作為分裝工具，在“下口杯”的下口管上套一段軟膠管，加一彈簧止水夾，使用時(shí)非常合用。更大規(guī)?；蛞蟾咝蕰r(shí)，可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。10．高壓滅菌鍋。用以進(jìn)行培養(yǎng)基和器械用具的滅菌。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。如果是連續(xù)的大規(guī)模生產(chǎn)，應(yīng)選用大型立式的或臥式的高壓滅菌鍋。通常以電作能源。11．烘箱。用于干燥洗凈的玻璃器皿，也可用于干熱滅菌和測(cè)定干物重。用于干燥需保持80～100℃；進(jìn)行干熱滅菌需保持150℃，達(dá)１～３小時(shí)；若測(cè)定干物重，則溫度應(yīng)控制在80℃烘干。12．恒溫培養(yǎng)箱。內(nèi)有溫度調(diào)節(jié)器，生化培養(yǎng)箱還配有光源，用于植物材料的培養(yǎng)。（三）接種室接種室是是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。其無(wú)菌條件的好壞對(duì)組織培養(yǎng)成功與否起重要作用。在工作方便的前提下，無(wú)菌操作室宜小不宜大，一般7～8m2；要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光潔，易于清潔和消毒。無(wú)菌操作室應(yīng)配置拉動(dòng)門(mén)，以減少開(kāi)關(guān)門(mén)時(shí)的空氣擾動(dòng)。無(wú)菌操作室要求干爽安靜，清潔明亮，在適當(dāng)位置吊裝1～2盞紫外線滅菌燈，用以經(jīng)常地照射滅菌。最好能安置一小型空調(diào)，使室溫可控，這樣可讓門(mén)窗緊閉，減少與外界空氣對(duì)流。無(wú)菌操作室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積2m2為宜。進(jìn)入無(wú)菌操作室前在此更衣?lián)Q鞋，以減少進(jìn)出時(shí)帶入雜菌。緩沖間最好也安一盞紫外滅菌燈，用以照射滅菌。。無(wú)菌操作室的主要設(shè)備及用具有：1．接種箱在投資少的情況下，可以用接種箱來(lái)代替超凈臺(tái)。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來(lái)保證內(nèi)部空間無(wú)菌。但操作活動(dòng)受限制，準(zhǔn)備時(shí)間長(zhǎng)，工作效率低。2．超凈工作臺(tái)超凈臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時(shí)間短。開(kāi)機(jī)10分鐘即可操作，可進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間使用。并可以保證無(wú)菌材料在轉(zhuǎn)移接種過(guò)程中不受污染。。3．無(wú)菌操作用的器具。按單人超凈臺(tái)上的用量計(jì)：酒精燈1個(gè)；20～25cm長(zhǎng)的醫(yī)用鑷子1把；4號(hào)解剖刀1把，解剖刀片若干；15cm醫(yī)用剪1把；500ml廣口瓶1只，內(nèi)放酒精，現(xiàn)代專業(yè)組培室多用接種器械滅菌器和容器口滅菌器，用于浸泡鑷子、刀、剪等；用于架放灼燒過(guò)的刀、鑷子的小架。4．?dāng)R架。貯放高壓滅菌后等待接種的培養(yǎng)基。（四）培養(yǎng)室是將接種的材料進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)的場(chǎng)所。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要的培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其它附屬設(shè)備而定。其設(shè)計(jì)以充分利用空間和節(jié)省能源為原則。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)架上培養(yǎng)。培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)５層，最低一層離地高約100厘米，其它每層間隔30厘米左右，培養(yǎng)架即高1.7米左右。培養(yǎng)架長(zhǎng)度，因一般在每層上端裝置日光燈,以供照明，所以都是根據(jù)日光燈的長(zhǎng)度而設(shè)計(jì)，如采用40W日光燈，則長(zhǎng)1.3m，30W的長(zhǎng)１米即可。寬度一般為60cm。培養(yǎng)室最重要的因子是溫度，一般保持在20～27℃左右，可安裝窗式或立式空調(diào)機(jī)。要求溫度因熱帶植物和寒帶植物等的種類不同而異，最好不同種類有不同的培養(yǎng)室。室內(nèi)濕度也要求恒定，相對(duì)濕度以保持在70～80%為好,可安裝加濕器。培養(yǎng)架上裝置日光燈時(shí)，可安裝定時(shí)開(kāi)關(guān)鐘控制照明時(shí)間，植物組織培養(yǎng)的光照強(qiáng)度一般在1000～4000勒克斯（lux），每天照明10～16小時(shí)，也有的需要連續(xù)照明。短日照植物需要短日照條件，長(zhǎng)日照植物需要長(zhǎng)日照條件。現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽(yáng)光照作為能源，這樣不但可以節(jié)省能源,而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。在陰雨天用燈光作補(bǔ)充。補(bǔ)光光源目前專業(yè)的組培室用全光譜冷光燈或LED組培專用燈。第二、設(shè)備和器材（一）玻璃器皿在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。要求由堿性溶解度小的硬質(zhì)玻璃制成，以保證長(zhǎng)期貯存藥品及培養(yǎng)的效果；培養(yǎng)用的還要求透光度好，能耐高壓高溫，能方便放入培養(yǎng)基和培養(yǎng)材料的器皿，根據(jù)培養(yǎng)的目的和要求，可以采用不同種類、規(guī)格的玻璃器皿.其中以試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等使用較多。最常使用的是三角瓶，規(guī)格有100、250、500毫升等，一般使用100毫升三角瓶，無(wú)論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。其培養(yǎng)面積大，利于組織生長(zhǎng)，受光也比試管好。由于瓶口較小，亦不易污染。培養(yǎng)皿常用9、12厘米直徑等規(guī)格，要求上、下能密切吻合。這在游離細(xì)胞、原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無(wú)菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。試管常用口徑18×180mm或20×200mm規(guī)格。可用于培養(yǎng)較高的試管苗，另外也不易污染。培養(yǎng)器皿還可就地取材，采用一些代用品。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的200ml罐頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時(shí)操作方便、工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷。但缺點(diǎn)是易引起污染。目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿漸被塑料器皿所代替。塑料容器具有質(zhì)輕、透明、不易破碎、成本低等優(yōu)點(diǎn)，如培養(yǎng)容器多為平底方盒形，可增加培養(yǎng)的植株數(shù)，并能一層層地疊摞起來(lái)，從而節(jié)約空間。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高溫，可進(jìn)行高壓滅菌。有些產(chǎn)品為一次性消耗品，不但可節(jié)省洗滌人工，還可節(jié)省時(shí)間，提高效率。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無(wú)須另外配蓋，使用時(shí)是非常方便的。瓶口封塞可用多種方法，要具有一定的通氣性和密閉性，以防止培養(yǎng)基干燥和雜菌污染。以前封口常用棉塞。不過(guò)這種封口辦法夏季極易污染，且不易保持培養(yǎng)基濕度?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。為了增加通氣性，可在里面襯一層硫酸紙或牛皮紙。這樣經(jīng)濟(jì)方便，且通氣好。也可采用專用的封口材料如封口膜。在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括100、250、1000毫升燒杯；100、1000毫升量筒；100、1000毫升試劑瓶（棕色）等等。（二）器械用具１．鑷子類主要采用醫(yī)療上用的鑷子。根據(jù)操作的需要有各種類型，若用１００毫升的三角瓶作為培養(yǎng)瓶，可用２０厘米長(zhǎng)的鑷子。鑷子過(guò)短.容易使手接觸瓶口，造成污染。鑷子太長(zhǎng)，使用起來(lái)不靈活。某些微小部分的精細(xì)操作則用鐘表鑷子，如在分離莖尖幼葉時(shí)，由于其尖端鋒利，所以幾乎可代替剪刀使用。２．剪刀類可采用五官科用的中型剪刀。主要用于切斷莖段、葉片等。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。3．解剖刀切割較小材料時(shí)可用解剖刀。分離莖尖分生組織，有時(shí)也用解剖刀。常用的解剖刀刀片可以經(jīng)常調(diào)換，刀口要保持鋒利狀態(tài)，否則切割時(shí)會(huì)造成擠壓，引起周圍細(xì)胞組織大量死亡，影響培養(yǎng)效果。４．解剖針解剖針用于深入到培養(yǎng)瓶中，轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。也可用于分離微莖尖的幼葉。第三、培養(yǎng)條件在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組成、ＰＨ值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。（一）溫度溫度是組織培養(yǎng)過(guò)程中的重要因素。組織培養(yǎng)在最適溫度下生長(zhǎng)分化表現(xiàn)良好，大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在23～27℃之間進(jìn)行，很多研究者采用了25±２℃的恒溫條件。低于15℃時(shí)培養(yǎng)，組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于35℃時(shí)對(duì)生長(zhǎng)不利。但是，不同植物培養(yǎng)的適溫不同。百合的最適溫度是20℃、月季是25～27℃、番茄是28℃。溫度不僅影響組培苗的生長(zhǎng)速度，也影響其分化增殖以及器官建成等發(fā)育進(jìn)程。如煙草芽的形成以28℃為最好，在12℃以下，33℃以上形成率皆最低。不同培養(yǎng)目標(biāo)采用的培養(yǎng)溫度也不同，百合鱗片在30℃下再生的小鱗莖的發(fā)葉速度和百分率都比在25℃下的高。桃胚在2～5℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理，有利于提高胚培養(yǎng)成活率。用35℃處理草莓的莖尖分生組織3～5天，可得到無(wú)病毒苗。（二）光照組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面：1．光照強(qiáng)度。光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響，從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。一般來(lái)說(shuō)，光照強(qiáng)度較強(qiáng)，幼苗生長(zhǎng)的粗壯，而光照強(qiáng)度較弱幼苗容易徒長(zhǎng)。2．光質(zhì)光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。如百合珠芽在紅光下培養(yǎng)，８周后，分化出愈傷組織。但在藍(lán)光下，幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種15天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。3．光周期試管苗培養(yǎng)時(shí)要選用一定的光暗周期來(lái)進(jìn)行組織培養(yǎng)，最常用的周期是16小時(shí)的光照，８小時(shí)的黑暗，研究表明，對(duì)短日照敏感的品種的器官組織，在短日照下易分化，而在長(zhǎng)日照下產(chǎn)生愈傷組織，有時(shí)需要暗培養(yǎng)，尤其是一些植物的愈傷組織在暗下比在光下更好。如紅花、烏桕樹(shù)的愈傷組織。（三）濕度濕度的影響包括培養(yǎng)容器和環(huán)境的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。前者又受瓊脂含量的影響。在冬季應(yīng)適當(dāng)減少瓊脂用量，否則，將使培養(yǎng)基干硬，以致不利于外植體接觸或插進(jìn)培養(yǎng)基，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受阻。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受影響。環(huán)境的相對(duì)濕度可以影響培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，一般要求７０～８０％的相對(duì)濕度，常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來(lái)調(diào)節(jié)濕度。濕度過(guò)低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高,進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行；過(guò)高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。三、滲透壓培養(yǎng)基中添加的鹽類、蔗糖、甘露醇及聚乙二醇類高分子化合物，影響到滲透壓的變化。１～２個(gè)大氣壓對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，２個(gè)大氣壓以上就對(duì)生長(zhǎng)有阻礙作用，５～６個(gè)大氣壓生長(zhǎng)就完全停止，６個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。四、pＨ值不同的植物對(duì)培養(yǎng)基最適pＨ值的要求也是不同的（表2-１），大多在５～６.５左右，一般培養(yǎng)基皆掌握在５.８，這基本能適應(yīng)大多植物培養(yǎng)的需要。表2-１不同植物的最適pＨ值種類最適PH值種類最適PH值杜鵑4．0月季5．8越桔4．5胡蘿卜、石刁柏6．0蠶豆5．5桃7．0馬鈴薯、番茄