生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制

關(guān)于生物技術(shù)藥物質(zhì)量控制第1頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月概述利用人體內(nèi)的天然物質(zhì)治療人類的疾病或達(dá)到某種醫(yī)學(xué)效果一直是醫(yī)學(xué)上的一個重要研究領(lǐng)域。20世紀(jì)70年代以來產(chǎn)生了DNA重組技術(shù)，這種新技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的主體，近年來首先在醫(yī)藥領(lǐng)域獲得了飛速發(fā)展。生物技術(shù)的應(yīng)用2/3用于醫(yī)藥，生物技術(shù)新型藥物和疫苗已有50多種產(chǎn)品投放市場，400多種正在進(jìn)行臨床試驗，2000多種在臨床前研究。據(jù)報道，國外6500萬人接受重組乙肝疫苗、100萬人接受t-PA治療，超過50萬人使用EPO，每天約有1000萬人接受重組人胰島素的治療。第2頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)產(chǎn)品的生產(chǎn)和管理按生物制品的要求進(jìn)行，不僅對最終產(chǎn)品的質(zhì)量實施有效控制，而且特別重視對生產(chǎn)工藝的全過程進(jìn)行質(zhì)量控制,其中包括對每個生產(chǎn)步驟的驗證、質(zhì)量檢定（QC）、質(zhì)量保證部（QA）對生產(chǎn)和質(zhì)量檢定的全過程進(jìn)行嚴(yán)格的管理。第3頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月1、概念：2、分類｛生物技術(shù)藥物重組DNA藥物重組蛋白質(zhì)藥物采用DNA重組技術(shù)或其他新生物技術(shù)生產(chǎn)的治療和預(yù)防藥物。第4頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

1、重組蛋白質(zhì)或重組多肽藥物包括：

細(xì)胞因子類：rIFN、IL-2、EPO等；抗細(xì)胞素治療：CD4可溶性受體等；重組溶血栓類：rSK、rSAK等；人源化單克隆抗體制劑；重組疫苗和菌苗制劑。第5頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月2、重組DNA藥物包括：寡核苷酸藥物：反義核酸等；基因藥物：腺病毒-IL-2、腺相關(guān)病毒-凝血Ⅸ因子；腺病毒-P53細(xì)胞治療制劑：抗原致敏的人樹突狀細(xì)胞DNA疫苗：治療乙型肝炎、愛滋病的核酸疫苗等。第6頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月我國生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究現(xiàn)狀現(xiàn)代醫(yī)藥生物技術(shù)的發(fā)展以及人類基因組計劃的完成和遺傳病基因的不斷發(fā)現(xiàn)，對醫(yī)藥領(lǐng)域產(chǎn)生了巨大影響。自1982年第一個基因重組藥物—重組胰島素上市以來，全世界約有60余種重組產(chǎn)品開發(fā)成功，包括基因工程藥物、基因工程抗體，重組疫苗、反義核苷酸藥物、基因治療藥物、DNA疫苗。我國在“七五”、“八五”、“九五”期間國家“863”高技術(shù)項目支持下，先后建立一系列基因重組制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控方法，共完成國家一類、二類新藥20余種產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。第7頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的依據(jù)一、主要依照《重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量控制要點》、《中國生物制品規(guī)程》、《中國藥典》等要求進(jìn)行。二、參考世界衛(wèi)生組織（WHO）和美國FDA頒布的指南、ICH文件和《歐洲藥典》。檢定標(biāo)準(zhǔn)、檢定方法：準(zhǔn)確可靠、切實可行；保證產(chǎn)品安全、有效。第8頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的內(nèi)容1、目標(biāo)產(chǎn)品的均一性2、建立目標(biāo)產(chǎn)品生物學(xué)活性或免疫學(xué)效價測定方法3、研究建立目標(biāo)產(chǎn)品的免疫學(xué)活性的測定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)4、研究建立國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考品5、建立目標(biāo)產(chǎn)品生產(chǎn)相關(guān)雜質(zhì)的限量分析方法和標(biāo)準(zhǔn)6、制定出保證上述生物技術(shù)產(chǎn)品臨床安全、有效、與WHO標(biāo)準(zhǔn)相一致的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范化的檢定方法第9頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

研究建立靈敏、穩(wěn)定的理化性質(zhì)、純度、含量的測定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

第10頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

研究建立目標(biāo)產(chǎn)品的生物學(xué)功效的測定方法及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)；建立用于藥物生物學(xué)功效檢定用的細(xì)胞系和動物模型。第11頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

運用生化標(biāo)準(zhǔn)化原則，以WHO國際標(biāo)準(zhǔn)品為對照，研制出國家標(biāo)準(zhǔn)品或參考對照品。在效價定義上要求與國際單位一致；沒有國際標(biāo)準(zhǔn)品的新藥，則根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品要求自行研制國家參比品。第12頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

外源DNA、菌體蛋白質(zhì)、細(xì)菌內(nèi)毒素以及病毒、支原體、細(xì)菌等在工藝中加入有害物質(zhì)的檢測。第13頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月重組產(chǎn)品質(zhì)量控制上存在的難點建立重組藥物的生物學(xué)活性測定方法；理化測定標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性；人源化單抗中的人源化程度檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)研究；重組人白蛋白等大劑量重組產(chǎn)品安全性評價問題；反義核酸藥物理化特性測定和效力測定，即如何評價反義核酸的體內(nèi)及體外活力；基因治療藥物的安全性評價包括反轉(zhuǎn)錄病毒、生物分布和效力測定；DNA疫苗的安全性和效力檢測方法研究；干細(xì)胞治療產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立（干細(xì)胞鑒定及活力測定）。第14頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月我國基因工程產(chǎn)品安全管理

法規(guī)和技術(shù)指南《傳代細(xì)胞系生產(chǎn)生物制品的規(guī)程》《人用鼠源性單克隆抗體質(zhì)量控制要點》《預(yù)防用新生物制品臨床研究的技術(shù)要求》《人用重組DNA制品質(zhì)量控制要點》《人的體細(xì)胞治療申報臨床試驗指導(dǎo)原則》《人基因治療申報臨床試驗指導(dǎo)原則》《藥理毒理檢查指導(dǎo)原則》《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理辦法》《藥品注冊管理辦法》第15頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制生物技術(shù)藥物的特點：1、來源：活的生物體（細(xì)菌或細(xì)胞）；2、結(jié)構(gòu)：復(fù)雜（包括組成、空間結(jié)構(gòu)）；3、生產(chǎn)：涉及生物材料和生物學(xué)過程（發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)，分離純化等），有其固有的易變性。第16頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)藥物的質(zhì)量控制質(zhì)量控制包括兩個方面：1、生產(chǎn)過程中質(zhì)量控制GMP（硬件、軟件）2、最終目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制（方法學(xué)研究）第17頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月質(zhì)量控制方法學(xué)研究具體內(nèi)容一、生物學(xué)活性測定和比活性二、蛋白質(zhì)純度檢查三、蛋白質(zhì)含量測定四、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定五、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析六、對糖蛋白的特殊要求七、殘余雜質(zhì)檢查八、安全性及其他檢測項目九、生物技術(shù)藥物待測樣品保存第18頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月一、生物學(xué)活性測定和比活性

1、意義：1）基因工程產(chǎn)品的化學(xué)本質(zhì)為蛋白質(zhì)、多肽，其活性由產(chǎn)品的氨基酸序列或其空間結(jié)構(gòu)所形成的活性中心所決定的，與其絕對質(zhì)量不一致。2）基因工程產(chǎn)品的生物學(xué)活性與藥效學(xué)基本相一致。3）利用生物學(xué)活性建立的測定效價體系，是給藥品定量的依據(jù)，保證產(chǎn)品藥效的重要手段。第19頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月效價測定一般原則1、國際通用方法；2、測定結(jié)果須用國際或國家標(biāo)準(zhǔn)品校正，以國際單位表示。第20頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)活性測定方法分類1）體外細(xì)胞培養(yǎng)測定法

a、促進(jìn)細(xì)胞生長作用（G-CSF:NFS-60）

b、抑制細(xì)胞生長作用(TNF:L929)

c、間接保護(hù)細(xì)胞作用(IFN:VISH;VSV)2）離體動物器官測定法采用家兔主動脈條測定重組腦利鈉肽生物活性。3）體內(nèi)測定法4）生化酶促反應(yīng)測定法5）免疫學(xué)活性測定法第21頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月取兔離體動脈條剪成約1.5cm長、2～3mm寬的螺旋環(huán)，懸掛于含10mL通氧的37℃臺氏液(取NaC18.0g、KC10.2g、CaCl20.2g、NaH2PO40.05g、MgSO4·7H2O0.1g、NaHCO31.0g、Glucose1.0g用蒸餾水配成1000mL的溶液，置于玻璃或塑料瓶中，用1mol·L-1NaOH溶液調(diào)pH至7.4)的麥?zhǔn)显〔壑?，加?fù)荷1g，穩(wěn)定1h，期間每20min換1次臺氏液：連接多導(dǎo)記錄儀，調(diào)節(jié)靈敏度，記錄血管的張力變化。第22頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月待張力曲線基線穩(wěn)定后，加入1.25mg·mL-1鹽酸去氧腎上腺素溶液0.05mL于麥?zhǔn)显〔壑惺蛊浣K濃度為6.25×10-5mg·mL-1

，曲線升高至最高并穩(wěn)定后，開始按累計濃度給藥法(曲線穩(wěn)定后對倍增加樣品濃度為：6.25×10-5～8.0×10-2RU·mL)加入重組人腦利鈉肽對照品，記錄血管的張力變化。完成上述給藥后，洗脫并穩(wěn)定1h，期問每20min換1次臺氏液。待基線穩(wěn)定后，按測定對照品的方法測定待測樣品，記錄測定結(jié)果。計算對照品和各實驗樣品的半效稀釋倍數(shù)，按下式計算樣品效價：樣品效價=對照品效價×樣品半效稀釋倍數(shù)／對照品半效稀釋倍數(shù)第23頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用動物體內(nèi)某些指標(biāo)變化，定出產(chǎn)品的單位，如EPO活性測定，體內(nèi)注射EPO后，計算小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞增加的數(shù)量與標(biāo)準(zhǔn)品比較，確定其活性單位。第24頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

基于產(chǎn)品與某種物質(zhì)的結(jié)合或產(chǎn)品本身的化學(xué)反應(yīng)為原理設(shè)計，具有簡便、精確、穩(wěn)定等特點，如重組鏈激酶、葡激酶生物活性測定，鏈激酶、葡激酶和纖溶酶原（h-plg）結(jié)合形成復(fù)合物激活游離h-plg原為有活性的纖溶酶。第25頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

利用制品免疫原性，制備相應(yīng)單克隆抗體或多克隆抗體，采取ELISA法測定其含量。第26頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)活性測定方法選擇體內(nèi)測定和體外測定方法

a、體內(nèi)測定：即整體動物測定，能為較大范圍的重組產(chǎn)品的效價提供有用信息，但費時、昂貴、難操作及同時存在倫理問題，大多數(shù)情況下傾向于選擇體外測定方法。

b、體外測定：可使用分離的器官或組織、原代細(xì)胞或傳代細(xì)胞系，目前最常用方法是連續(xù)生長、因子依賴的、克隆化的細(xì)胞系的方法，其測定結(jié)果比較準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、經(jīng)濟、容易使用和便于統(tǒng)計分析。第27頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)活性測定方法選擇2、定量、半定量、定性方法

a、通過研究首先選擇能夠定量評價的方法，最好的選擇是背景較低的反應(yīng)，并且對相關(guān)產(chǎn)品有陡峭的、可重復(fù)的劑量-反應(yīng)曲線；其次考慮半定量方法（如NGF），最后考慮定性（如BMP）方法。

b、對生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，生物學(xué)活性測定方法復(fù)雜，可采用其他替代方法（如重組人生長激素用HPLC定量方法代替復(fù)雜生物活性測定方法）。第28頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月細(xì)胞培養(yǎng)法中細(xì)胞染色標(biāo)記方法

3H-thymidine、BrdU是反映DNA合成、增殖細(xì)胞數(shù)的比例的。BrdU：首先用BrdU做標(biāo)記，固定細(xì)胞，用核苷酸酶處理后使過氧化物酶結(jié)合抗BrdU抗體發(fā)生反應(yīng)。MTT（四氮唑鹽）：其在活細(xì)胞的線粒體中可以定量地被琥珀酸脫氫酶還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物MTTformazan,二甲基亞砜（DMSO）和酸化的異丙醇或酸化的SDS均能溶解紫色結(jié)晶物，通過比色法測定MTTformazan的量可以反映線粒體電子傳遞系統(tǒng)機能，間接表示細(xì)胞的生長狀態(tài)。第29頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

AlamarBlue：氧化型AlamarBlue（600nm）可被活細(xì)胞中的線粒體酶還原，還原后染料（570nm）發(fā)生顏色和熒光改變，顏色和熒光的深淺與活細(xì)胞數(shù)成正比，可用分光光度計或熒光檢測儀檢測。

Crystalviolet：染活細(xì)胞后，在比色計中測定光吸收值（A），A值與著染色細(xì)胞數(shù)成正比。第30頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

幾種細(xì)胞培養(yǎng)測定方法比較

3H-thymidineBrdUMTT AlamarBlue 靶向物DNA合成系統(tǒng) 線粒體電子傳遞系統(tǒng)

檢出細(xì)胞的狀態(tài)增殖 增殖、生存檢出法 放射活性 色素、熒光 色素 色素、熒光抽出的必要性 + ++- 其他試劑的必要性+ ++ +- 成本（以MTT為1時） 6080-100（試劑盒）1 2缺點 使用同位素 不適合檢出大量未增殖檢出未增浮游細(xì)胞細(xì)胞，處理時費力殖活細(xì)胞

第31頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)活性測定分析方法

1、用能誘導(dǎo)50%最大反應(yīng)的待測樣品最高稀釋度作為參考效價（或滴度），或以此稀釋度中所含樣品的量為1單位，即以此稀釋度的倒數(shù)為待測樣品所含的單位數(shù)。

2、比較已知濃度或活性單位樣品標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品的實驗結(jié)果。活性標(biāo)準(zhǔn)品待測樣品稀釋度abA值生物學(xué)測定基本模式圖第32頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月蛋白質(zhì)藥物的比活性測定的意義1、比活性：每毫克蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性單位。2、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)不能常規(guī)測定，而它的改變（如二硫鍵的錯誤配對）可影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，從而影響藥效，比活性可以反映此種情況。3、比活性可反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定情況，可比較不同表達(dá)體系、不同生產(chǎn)廠家生產(chǎn)同一產(chǎn)品時的質(zhì)量情況。4、比活性是重組蛋白質(zhì)藥物不同于化學(xué)藥的一項重要指標(biāo)，也是進(jìn)行成品分裝的重要定量依據(jù)。第33頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物活性測定標(biāo)準(zhǔn)范圍確定1、使用驗證過的測定和分析方法，并提供用此方法的效價測定平均值和單測定一批誤差的可信限范圍。2、對于成品的生物活性測定標(biāo)準(zhǔn)，要根據(jù)不同方法的特點規(guī)定相當(dāng)標(biāo)示量的范圍，目前，生物活性的測定方法有四類：動物基礎(chǔ)、細(xì)胞基礎(chǔ)、生化（酶）法、特異（免疫、受體）結(jié)合法。第34頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月不同生物活性測定方法的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)表測定方法規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)動物基礎(chǔ)的生物活性測定70%～130%標(biāo)示量細(xì)胞基礎(chǔ)的生物活性測定80%～120%標(biāo)示量體外酶法的生物活性測定85%～115%標(biāo)示量受體結(jié)合的生物活性測定85%～115%標(biāo)示量第35頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物學(xué)活性效價測定過程中

標(biāo)準(zhǔn)品的作用1、生物學(xué)活性測定變異范圍大，同樣制品在不同實驗室測定結(jié)果差異很大，必須有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。2、標(biāo)準(zhǔn)品的使用，最大限度地減少實驗室之間和各種影響測定因素地干擾。第36頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月二、蛋白質(zhì)純度檢查1、蛋白質(zhì)純度檢查是重組蛋白質(zhì)藥物地重要指標(biāo)之一。2、按WHO規(guī)定必須用HPLC和非還原SDS兩種方法測定，其純度都應(yīng)達(dá)到95%以上，有的甚至要求達(dá)到99%以上。3、純度的檢查通常是在原液中進(jìn)行。4、方法：非還原SDS電泳法、HPLC法、毛細(xì)管電泳。第37頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月非還原SDS電泳法：

1、銀染加樣量≥5ug（1～10ng）

2、考馬斯亮藍(lán)R-250

加樣量≥10ug（100ng）結(jié)果：無明顯雜蛋白帶出現(xiàn)；目標(biāo)蛋白量應(yīng)不低于總蛋白量的95%或98%。蛋白質(zhì)樣品在荷質(zhì)比均一。第38頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

HPLC法：分子篩、反相層析，離子交換層析，盡量采用與SDS原理不同的反相或離子交換層析，不主張用分子篩分析。毛細(xì)管電泳：簡便、快速、靈敏度和分辨率高；價格高、重現(xiàn)性差。第39頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

幾種檢定重組蛋白純度方法的比較特性HPLCSDS、IEFCE分離機制極性、非極性分配，電荷、等電點電荷等分子大小、離子交換分析所需時間10～120min幾小時10～30min

分辨力好好好樣品體積10～50ul1～50ul1～50nl靈敏度范圍ng～ugng～ugpg定量準(zhǔn)確性+±+分析方式紫外、熒光、折射紫外（可見、熒光）同HPLC

電化學(xué)、放射性銀染、放射自顯影儀器價格中～高低中～高日常消耗低高低自動化中～高低中～高人力操作低高低制備級中中微量級制備收集樣品可以可以較困難第40頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

用于研究蛋白質(zhì)純度的方法和機制

方法分析機制反相HPLC疏水性疏水性相互作用HPLC疏水性毛細(xì)管電泳荷質(zhì)比離子交換HPLC電荷等電聚焦電荷聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷比

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電荷，分子大小分子排阻HPLC分子大小質(zhì)譜測量法分子大小第41頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月三、蛋白質(zhì)含量測定1、此項目主要用于原液比活性計算和成品規(guī)格的控制。2、可根據(jù)物理化學(xué)性質(zhì)采用Folin-酚試劑法（Lowry法）、染色法（Bradford法）、雙縮脲法、紫外吸收法、HPLC法和凱氏定氮等方法。第42頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月靈敏范圍：5～100ug/ml；優(yōu)點：簡便、靈敏度較高；不同蛋白質(zhì)間的變異少；缺點：受多種物質(zhì)干擾，反應(yīng)速度慢，某些試劑不穩(wěn)定。第43頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

Bradford法是采用考馬斯亮藍(lán)-G250與蛋白質(zhì)結(jié)合的原理，迅速、靈敏的定量測定蛋白質(zhì)的方法；靈敏范圍：25～200ug/ul，需要時間：10min。第44頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月靈敏范圍：0.2～2mg/ml簡單、省時受光吸收物質(zhì)影響蛋白濃度（mg/ml）﹦1.55A280-0.76A260第45頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

蛋白質(zhì)常用的定量方法的比較方法所需蛋白質(zhì)破壞蛋白質(zhì)/蛋白技術(shù)方法的變異的量（mg/ml）與否質(zhì)變化情況復(fù)雜性系數(shù)（%）雙縮脲0.5～5是少簡單、快速5Lowry0.05～5是中等顯色慢、試劑多5凱氏定氮0.05～3是少干擾、復(fù)雜、慢0.154紫外吸收法0.05～2否大簡單、快速、0.439（280nm）干擾物質(zhì)多染料結(jié)合法0.01～0.05是中等簡單、快速3.75熒光法0.001～0.01否中等較易3.75第46頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月四、蛋白質(zhì)藥物理化性質(zhì)的鑒定特異性鑒別試驗相對分子質(zhì)量測定等電點測定肽圖分析吸收光譜氨基酸組成分析N末端和C末端氨基酸測序第47頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月特異性鑒別試驗主要確定蛋白質(zhì)的抗原性免疫學(xué)方法（免疫印跡、斑點免疫、免疫電泳、免疫擴散）：根據(jù)抗原抗體特異性反應(yīng)建立的方法?？贵w中和活性抑制法：此法可用于原液和成品的鑒別試驗，該方法簡便易行、要求抗體必須為中和抗體。第48頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月相對分子質(zhì)量測定還原型SDS：蛋白質(zhì)在SDS和β-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負(fù)電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其相對分子質(zhì)量相關(guān)。凝膠過濾（分子篩）法：根據(jù)蛋白分子大小和性狀進(jìn)行測定。第49頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月等電點測定重組蛋白質(zhì)藥物的等電點往往是不均一的，但在生產(chǎn)過程中批與批之間的電泳結(jié)果應(yīng)一致，以說明其生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。方法：等電聚焦電泳法(IEF)

毛細(xì)管電泳法。第50頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月肽圖分析肽圖分析可作為與天然產(chǎn)品或參考品的蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)做精密比較的手段。蛋白質(zhì)一般經(jīng)化學(xué)裂解法及蛋白酶裂解后用HPLC、SDS電泳法、質(zhì)譜法測定。同種產(chǎn)品不同批次的肽圖的一致性是工藝穩(wěn)定性的驗證指標(biāo)。第51頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月吸收光譜對某一重組蛋白質(zhì)來說，其最大吸收波長是固定的。在生產(chǎn)工程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應(yīng)當(dāng)一致。重組產(chǎn)品一級結(jié)構(gòu)不含芳香族氨基酸，可不做紫外吸收光譜測定。第52頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月氨基酸組成分析采用微量氨基酸自動分析儀測定，包括蛋白質(zhì)水解，自動進(jìn)樣、氨基酸分析、定量分析報告等。有柱前衍生法和柱后反應(yīng)法，前者是氨基酸先和熒光試劑作用生成衍生物，然后用色譜柱進(jìn)行分離，檢測氨基酸衍生物的熒光；后者是氨基酸先用色譜柱分離，再與茚三酮、熒胺等試劑顯色后進(jìn)行分析檢測。第53頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月N-末端和C-末端氨基酸測序作為重組蛋白質(zhì)和肽的重要鑒別指標(biāo)，一般要求至少測定N-末端15個氨基酸、C-末端1～3氨基酸。第54頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月五、蛋白質(zhì)的二硫鍵分析二硫鍵和巰基與蛋白質(zhì)的生物活性密切相關(guān)，發(fā)生錯誤配對，不但活性降低而且會引起抗原性增加。第55頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月六、對糖蛋白的特殊要求評價用生物技術(shù)方法生產(chǎn)的糖蛋白時，應(yīng)考慮糖基化位點的上調(diào)或下調(diào)及其對生物活性、代謝、穩(wěn)定性、溶解性的影響。每一種真核細(xì)胞具有其獨特的糖基化能力稱為它的糖類型，通過基因工程方法將一種糖蛋白在不同細(xì)胞中表達(dá)，可以導(dǎo)致生產(chǎn)不同類型的糖蛋白，即使在相同的細(xì)胞類型中，也可能會出現(xiàn)糖形成時由于一些寡糖的精細(xì)結(jié)構(gòu)不同等而產(chǎn)生截然不同的糖蛋白。第56頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月七、殘余雜質(zhì)檢測

1、對殘余雜質(zhì)進(jìn)行限制的意義

a、殘余雜質(zhì)可能具有毒性，引起安全性問題；

b、可能影響產(chǎn)品的生物學(xué)活性和藥理作用，或使產(chǎn)品變質(zhì)；

c、反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝的穩(wěn)定性。第57頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月殘余雜質(zhì)檢測

2、殘余雜質(zhì)分類

a、外來污染物：微生物、熱原、細(xì)胞成分（蛋白質(zhì)、DNA等）、培養(yǎng)基成分、純化步驟引入的成分（親和柱中的抗體、增溶用的SDS）等；

b、與產(chǎn)品相關(guān)的雜質(zhì)：突變物、錯誤裂解物，二硫化物異構(gòu)體、二聚體和多聚體；化學(xué)修飾形態(tài)（脫酰氨基或氧化形式、其他降解產(chǎn)物）第58頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月殘余雜質(zhì)檢測內(nèi)容宿主細(xì)胞蛋白含量宿主細(xì)胞DNA鼠源型IgG含量（10ng/劑量）蛋白A含量小牛血清殘留量殘余抗生素（氨芐西林）內(nèi)毒素含量（LAL）產(chǎn)品相關(guān)物質(zhì)其他雜質(zhì)（加入的離子、SDS、甲醛等）第59頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月宿主細(xì)胞蛋白含量以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用斑點免疫。常采用5種最常用的E.coli菌株混和作為ELISA測菌體蛋白含量的通用標(biāo)準(zhǔn)。不同表達(dá)體系對菌體蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)不同。來自E.coli菌株的產(chǎn)品為不大于0.1%；來自CHO細(xì)胞的產(chǎn)品為不大于0.05%。第60頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月宿主細(xì)胞DNA測定方法：采用DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法，以地高辛標(biāo)記檢測試劑盒或者用同位素標(biāo)記DNA探針進(jìn)行測定，必須提供相應(yīng)宿主細(xì)胞DNA標(biāo)準(zhǔn)品?，F(xiàn)行生物制品規(guī)程對宿主細(xì)胞DNA殘留量標(biāo)準(zhǔn)作了相應(yīng)調(diào)整：由小于100pg/劑量調(diào)整為小于10ng/劑量。宿主細(xì)胞DNA只作為一種細(xì)胞污染因素不作為一種危險因素。第61頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月 安全性及其他檢測項目無菌試驗熱源試驗異常毒性試驗免疫原性檢查水分、裝量、pH檢測第62頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月生物技術(shù)藥物待測樣品保存

生物技術(shù)藥物大多為具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽，易受環(huán)境條件的影響。根據(jù)不同產(chǎn)品原液與成品、凍干與液體制劑的不同要求，可選擇在－20℃、－80℃、4℃和常溫條件下保存。冷凍保存的原液樣品最好分成小包裝保存，避免反復(fù)凍溶。第63頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月檢定方法的驗證檢定方法的驗證就是根據(jù)方法的需要測定該方法的專屬性、準(zhǔn)確性、精密性、直線性、測定范圍、測定限度、測量限度、特異性和耐用性（或可靠性）等幾個指標(biāo)中的一個或幾個。對于理化測定方法已有了確定的要求和判定標(biāo)準(zhǔn)，而生物學(xué)測定的結(jié)果具有更大的可變性，一般要使用動物或細(xì)胞，這些有機體本身就具有較大的可變性，因此生物學(xué)測定的要求和合格標(biāo)準(zhǔn)要松一些。第64頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月驗證時應(yīng)考慮的問題首先要確定方法的適用性，該方法首先可以得到可重復(fù)的、可信的實驗結(jié)果，要考慮在以下幾個參數(shù)：準(zhǔn)確性、精確性、靈敏性、特異性和耐用性（可靠性）。第二，要與已知的方法進(jìn)行對比試驗，以考查二者間的相互關(guān)系。如果在該實驗室內(nèi)無可對比的老方法，則首先建立標(biāo)準(zhǔn)的方法，用含一定范圍濃度的樣品進(jìn)行測定，以標(biāo)準(zhǔn)方法所得結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，用統(tǒng)計學(xué)的方法進(jìn)行對比處理，得出二種方法間的相關(guān)系數(shù)。對于一個新建立的方法則需要進(jìn)行協(xié)作研究對其適用性進(jìn)行驗證。

第65頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月驗證中需測定的參數(shù)1、專屬性/特異性（selectivity/specificity）是指當(dāng)檢測方法對測試樣品中含有制品中應(yīng)有的其他化合物時，測定待測物的能力。本參數(shù)用于鑒別試驗、濃度或效力試驗和純度試驗的測定，以確定使用該檢測方法所測定的結(jié)果是否準(zhǔn)確地反映了制品的鑒別、效價或純度。特異性就象準(zhǔn)確性一樣，一般用偏差或測定值與已知值之間的錯誤率（%）來表示。

第66頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

2、直線性（linearity）是測定結(jié)果與樣品中測試物濃度的線性關(guān)系，該參數(shù)的測定將確定檢測方法的測量范圍，它可以表示為回歸直線的斜率和離散性，或者相關(guān)系數(shù)R和測定系數(shù)R2

。

第67頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

3、測量范圍（Range）

是指當(dāng)準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時所能測得的樣品中待檢物的最高和最低濃度范圍，它就是測定直線性的上下限，如果劑量和反應(yīng)間的關(guān)系不成直線，測量范圍可以通過校正曲線來測得。在《中華人民共和國藥典》中規(guī)定測量范圍是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確性和直線性，測定方法適用的高低限度或量的區(qū)間。第68頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

4、準(zhǔn)確性（accuracy）表示測定值與真實值之間的一致性或接近的程度。一般采用填加和回收試驗來測定準(zhǔn)確性，即將已知量的樣品加到空白中進(jìn)行測定，比較測定值與真實值之比。準(zhǔn)確性一般表示為偏差或測定值與真值之間的錯誤率（回收率）（即測定值/真實值×100%）。一般對于生物制品而言，因為沒有純的標(biāo)準(zhǔn)品，所以準(zhǔn)確性不太實用。生物制品測定時一般與同時進(jìn)行的參考品進(jìn)行比較而得，此時的合格標(biāo)準(zhǔn)一般是測定出的參考品值的合格范圍或樣品與參考品之間的比值。第69頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

5、精密性（precision）表示測定值之間的一致性或接近的程度，一般表示為變異系數(shù)(CV%)，變異系數(shù)即是測定值的標(biāo)準(zhǔn)差與測定值的比值。精密性分幾種：一種是實驗內(nèi)的精密性（即重復(fù)性），它是在同一次試驗內(nèi)同一個樣品多次測定結(jié)果間的變異系數(shù)。另一種是試驗間的精密性，它是在同一實驗室內(nèi)不同次試驗間對同一樣品多次測定結(jié)果間的變異系數(shù)。實驗室之間的精密性即重現(xiàn)性一般可通過協(xié)作研究得到，此參數(shù)不適合生產(chǎn)設(shè)施的驗證。第70頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

6、測定限度（LimitofDetection）是指能夠測定出的樣品中測試物的最低量。該量并不一定要定量測出其準(zhǔn)確的含量或濃度，LOD是檢查限度實驗中最重要的一個參數(shù)。

第71頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

7、測量限度（LimitofQuantitation）

是指在準(zhǔn)確性和精密性都能達(dá)到要求時能夠定量測定出的樣品中測試物的最低量。LOQ是檢查測定藥品中不純物方法的一個參數(shù)。第72頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月

8、耐用性（robustness/ruggedness）是通過有效地改變實驗方法的參數(shù)，來測定此改變對試驗結(jié)果的影響，即實驗結(jié)果不受影響的承受程度。參數(shù)的改變可以是室溫或培養(yǎng)溫度，或濕度、或改變培養(yǎng)時間，或?qū)υ噭┑膒H進(jìn)行較小范圍的調(diào)整等。在每種試驗條件下，對準(zhǔn)確性、精密性、或其他參數(shù)進(jìn)行測定，以確定試驗方法的耐受或承受能力。第73頁，課件共81頁，創(chuàng)作于2023年2月不同測定方法應(yīng)進(jìn)行的驗證的參數(shù)參數(shù)鑒別試驗雜質(zhì)檢查效價測定組成測定定量限度準(zhǔn)確性

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