病毒感染性疾病的實驗室診斷

關(guān)于病毒感染性疾病的實驗室診斷第1頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

病毒（Virus）是結(jié)構(gòu)最簡單、體積最小的微生物。病毒感染十分常見，約70%~80%的傳染病由病毒感染所引起。迄今已證實500多種病毒對人有致病性，其中不少病毒危害極大，如最近流行的SARS病毒。因此盡快獲得病毒的實驗診斷，對控制病毒的轉(zhuǎn)播、疾病的診斷和防治具有重要的意義。

第2頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

病毒性疾病實驗診斷的一般原則是特異、敏感、快速和簡便。首先根據(jù)流行病學(xué)和臨床特點，初步判斷可能感染的病毒；然后根據(jù)可疑病毒生物學(xué)特點、機體免疫應(yīng)答和臨床過程，以及病人當(dāng)前所處的時機，確定實驗診斷的方法。目前病毒感染的檢查主要依靠經(jīng)典的方法和近來發(fā)展起來的分子生物學(xué)等方法。前者主要包括病毒分離培養(yǎng)、鑒定及血清學(xué)實驗；后者主要是核酸雜交與PCR及現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)。

第3頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月病毒學(xué)檢驗

病毒分離培養(yǎng)病原學(xué)診斷形態(tài)學(xué)檢測分子生物學(xué)技術(shù)——病毒核酸補體結(jié)合試驗中和試驗血清學(xué)診斷血凝抑制試驗間接免疫熒光檢測酶聯(lián)免疫吸附試驗

第4頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

一、標(biāo)本采集與運送（一）標(biāo)本的采集

要從臨床標(biāo)本中成功地分離出病毒，很大程度上取決于標(biāo)本的恰當(dāng)采樣和處理，為了保證標(biāo)本質(zhì)量，應(yīng)注意以下問題：

1．采樣時間

盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者入院的當(dāng)天進行，越早越好，最好在治療之前。疾病后期體內(nèi)產(chǎn)生免疫力，病毒量減少或消失。第5頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2．標(biāo)本種類的選擇

根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料，判斷可能感染病毒的種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本，處理標(biāo)本時要考慮病毒的生物學(xué)特性。常見分離病毒標(biāo)本的選擇見書P64表4-2。

（1）

心臟疾病

（2）

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染

（3）

先天或新生兒感染

（4）

胃腸道疾病

（5）

呼吸道感染

第6頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

3．常見標(biāo)本的采集方法

（1）

血液：以無菌手續(xù)抽取抗凝10ml，抗凝劑可選用100u/ml肝素鈉。為了血清學(xué)檢查的需要，應(yīng)抽取另一管5ml血液，不抗凝送檢。

（2）

腦脊液：以無菌手續(xù)抽取腦脊液

1~2ml，置無菌試管內(nèi)，在冰浴中第7頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

應(yīng)立即送檢。4℃可存放72h。

（3）宮頸或陰道拭子：采取病灶部位分泌物，將拭子置運送液中；如無病損部位，則清理宮頸口粘液，將拭子伸入宮頸約1cm停留5秒以上取出，置運送液中4℃冰浴立即送檢。第8頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（4）

糞便標(biāo)本：取2~4g糞便標(biāo)本在無菌的容器中，加8~10ml運送液立即送檢。

（5）

含漱液：可用無菌生理鹽水，讓患者含漱幾次取得，與運送液等量混合。

第9頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（6）

喉拭子：用生理鹽水濕潤的拭子采取咽喉部表面，置運送液中，注意避免唾液污染。

（7）尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸入尿道4cm輕輕轉(zhuǎn)動2~3次，以獲得較多的上皮細(xì)胞，取出后置運送液中。

（8）尸檢標(biāo)本：應(yīng)在死亡后盡早采取，采集各種器官時要分開使用器械和容器。

第10頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（二）標(biāo)本的運送和保存

標(biāo)本采集后注意無菌、冷凍、保濕、立即送檢。

分離培養(yǎng)病毒的標(biāo)本要盡快送到實驗室處理和接種。如不能及時送檢，可在4℃冷藏數(shù)小時，如需較長時間保存則應(yīng)置-70℃。放置在-20℃，病毒容易滅活，凍存液中需加入甘油或二甲亞砜等作保護，避免反復(fù)凍融使病毒滅活。第11頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

為了抑制細(xì)菌生長通常在病毒傳送培養(yǎng)基（VTM）中加入抗生素如青霉素100U/l和鏈霉素100μg/ml，為了抑制真菌的生長加入2.5μg/ml二性霉素B或40μg/ml制霉菌素。第12頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

二、病毒的分離與鑒定

（一）病毒分離和鑒定的一般程序

病毒分離和鑒定的一般程序見書P66

圖4-1（二）病毒的分離

病毒是專性細(xì)胞寄生，需要在活細(xì)胞或動物體內(nèi)才能得到分離。選擇何種動物或細(xì)胞來分離，應(yīng)根據(jù)臨床感染的癥狀和流行病學(xué)資料，推測可能的病毒種類，選擇相對敏感的動物和細(xì)胞來分離標(biāo)本中的病毒。

第13頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

1.組織培養(yǎng)（1）

概念

將人或動物離體的活組織或分散的活細(xì)胞，在實驗室的試管或培養(yǎng)基中，模擬體內(nèi)的生理條件使之生存和生長，稱之為組織培養(yǎng)。（2）

組織培養(yǎng)的類型

A器官培養(yǎng)：如氣管、腸段。器官保存了原功能，用于分離某些有器官特異性的病毒。

B組織塊培養(yǎng)：如肝組織塊培養(yǎng)肝炎病毒。

C細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）：現(xiàn)使用廣泛的組織培養(yǎng)技術(shù)。第14頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）細(xì)胞培養(yǎng)的種類和方法根據(jù)細(xì)胞的來源、染色體特性和傳代次數(shù)的不同可分為三類：

1．

原代和次代細(xì)胞培養(yǎng)

離體的新鮮組織或器官，機械處理

胰蛋白

洗滌

吹打酶消化

加入營養(yǎng)液單個細(xì)胞懸液

1-3次

細(xì)胞計數(shù)

、調(diào)整細(xì)胞濃度

分裝培養(yǎng)

生長

瓶內(nèi)培養(yǎng)形成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞培養(yǎng)

第15頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

胰酶消化轉(zhuǎn)種新的培養(yǎng)瓶形成單層細(xì)胞，稱為次代細(xì)胞培養(yǎng)

2．

二倍體細(xì)胞株原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（即含23對染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為40~50代，大多數(shù)為成纖維細(xì)胞,如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。第16頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月3．傳代細(xì)胞系來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。

（4）組織培養(yǎng)的特點優(yōu)點：A．來源廣；B．不受機體免疫因素影響，個體差異小，敏感范圍廣；C.易于觀察病變；D.可用于病毒的分離、鑒定、疫苗的制備；E.易管理，相對比較經(jīng)濟。缺點：條件要求高，必須要有細(xì)胞培養(yǎng)的條件。第17頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.

雞胚接種

雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。

（1）

常用接種部位和用途

38-39℃

新鮮受精卵

5-13天

卵黃囊接種羊水腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜接種第18頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

卵殼氣室尿囊絨毛尿囊膜卵黃囊卵白羊膜羊水囊第19頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月①

卵黃囊接種：用于流行性腦炎病毒分離②

羊水腔接種：用于流感病毒、副流感病毒的初次分離③尿囊腔接種：用于流感病毒、腺病毒、腮腺炎病毒分離④絨毛尿囊膜接種：用于痘病毒、皰疹病毒分離第20頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）

雞胚接種的特點

優(yōu)點：A.雞胚是一個整體，可有多種接種途徑；

B.可收獲大量病毒；

C.雞胚本是無菌無病毒的，對接種病毒不產(chǎn)生抗體；

D.來源廣，操作簡便。

缺點:A.易感病毒較少，應(yīng)用較局限

B.反復(fù)用雞胚傳代，病毒毒力可下降第21頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

3.

動物接種

（1）

常用動物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等

（2）

接種途徑：

呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接種3周齡新生小鼠

腸道病毒，如柯薩奇病毒，腹腔接種乳鼠（一日齡）

乙肝病毒，靜脈注射猩猩

嗜神經(jīng)病毒，如乙腦病毒（用3周齡小鼠）、狂犬病毒（用家兔），顱內(nèi)接種

第22頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）

接種后觀察應(yīng)每日至少兩次，必要時每隔2~4小時觀察一次。根據(jù)實驗?zāi)康牡牟煌^察不同的反應(yīng)情況。

（4）

動物接種特點

優(yōu)點：A.可以按照不同途徑分離鑒定病毒，可模擬人類感染途徑

B.可用于疫苗的篩選、制備

C.可用于制備抗血清

D.操作簡便，對環(huán)境要求低

第23頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

缺點：A.可自然帶毒或隱性感染，影響結(jié)果的觀察

B.存在個體差異

C.敏感病毒較少，或有些病毒感染后不出現(xiàn)明顯癥狀，不宜觀察

D.不經(jīng)濟，難管理

第24頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（三）病毒的鑒定

1.初步鑒定

根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點、標(biāo)本來源、易感動物范圍、細(xì)胞病變特征及生物學(xué)特性、理化性質(zhì)，可初步確定病毒屬于何科何屬。

（1）

動物感染范圍及潛伏期

病毒感染動物的范圍、發(fā)病的潛伏期有差異。如柯薩奇基B組病毒對新生乳鼠致病，對成年小鼠不致??；小鼠腦內(nèi)接種乙腦病毒，潛伏期一般為4天，少于4天發(fā)病則可能為非乙腦病毒引起。第25頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（2）對雞胚的敏感性

不同病毒對雞胚不同接種途徑敏感性不同。

直接法：如觀察絨毛尿囊膜是否有病灶

間接法：尿囊液、羊水做血凝抑制試驗等

第26頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（3）

病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn)

①細(xì)胞代謝類型改變：細(xì)胞代謝產(chǎn)酸可導(dǎo)致培養(yǎng)液pH指示劑呈黃色，病毒增殖抑制了細(xì)胞代謝，使培養(yǎng)液不變色或變紅。但腺病毒不抑制細(xì)胞代謝，反而促進糖酵解增加產(chǎn)酸。

②

細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

由病毒增殖所引起的細(xì)胞變化稱為細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathiceffect,CPE)。

第27頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

A.細(xì)胞溶解，細(xì)胞培養(yǎng)液中出現(xiàn)空斑,

如腸道病毒；

B.細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，如皰疹病毒；

C.細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，如腺病毒；

D.胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，如狂犬病毒：

E.不出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象。

第28頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

③空斑或蝕斑（plaque）形成試驗：空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個空斑是由一個感染性病毒顆粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同?？蛇M行病毒顆粒的計數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗可進行病毒的鑒定。

第29頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

④干擾現(xiàn)象：一種病毒感染細(xì)胞后，可以干擾以后進入的病毒的增殖。利用此現(xiàn)象鑒定不引起形態(tài)學(xué)變化的病毒。如某些型別的鼻病毒能干擾以后進入的副流感Ⅰ型病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。

第30頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

⑤

紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗：紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于病毒在細(xì)胞膜成熟時，將其血凝素插入細(xì)胞膜，使受染細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，是病毒增殖的指標(biāo)。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的病毒特異性抗體所抑制，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗，可用來鑒定病毒。

第31頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（4）

理化性質(zhì)的測定

①病毒的大小和形態(tài)：可用電鏡觀察病毒的大小和形態(tài)。

②核酸類型鑒別及序列測定：利用5-溴-2-脫氧尿苷（BUDR）抑制DNA復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制DNA病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對RNA病毒無抑制作用，以次判斷病毒核酸類型。也可對病毒特異序列或全序列的堿基排列測定或DNA

雜交、DNA-RNA雜交來鑒定病毒。第32頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月③

耐酸試驗：腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。④

乙醚敏感試驗：病毒外周如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞?？勺鳛椴《臼欠窬哂蓄愔さ囊罁?jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進行試驗。第33頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2最后鑒定——血清學(xué)試驗在初步鑒定的基礎(chǔ)上，對已分離出陽性結(jié)果需選擇適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)方法對病毒分離株作最后鑒定。血清學(xué)方法鑒定是將分離到的病毒和已知病毒的參考血清作中和試驗、補體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗等。由于分子病毒學(xué)的發(fā)展，病毒的最后鑒定還應(yīng)包括分子生物學(xué)方法的鑒定，它還能檢出不產(chǎn)生細(xì)胞病變的那些病毒。

第34頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（1）中和試驗：是將病毒與特異性抗體進行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗。常用細(xì)胞培養(yǎng)進行中和試驗。第35頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月方法：①固定病毒（100TCID50），稀釋血清，測Ab效價。兩次效價相差4倍以上有診斷意義。

TCID50：50%組織細(xì)胞感染的病毒劑量(50%TissuecellinfectivedoseTCID50)②固定血清（1：20或1：40），稀釋病毒，求中合指數(shù)。

第36頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月中和指數(shù)>50為陽性，有意義中和指數(shù)<9為陰性，無意義中和指數(shù)10~49，為可凝。中和試驗較復(fù)雜和費時，多用于V的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，對臨床診斷價值不大。（2）血凝與血凝抑制試驗?zāi)承┎《究膳c一定種類的哺乳動物或禽類的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，是為血凝抑制試驗?？勺鳛椴《拘蛣e確定的依據(jù)。（3）補體結(jié)合試驗第37頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

三、病毒感染的快速診斷（一）、病毒的形態(tài)學(xué)檢查

1.

光學(xué)顯微鏡

可以觀察到大型的病毒如痘病毒類。在光學(xué)顯微鏡下還可以觀察到病毒感染的宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性的包涵體（inclusionbody）。根據(jù)包涵體的特點，可以作出輔助診斷。包涵體可能是病毒增殖的場所或病毒顆粒的聚合體，也可能是宿主細(xì)胞對病毒作用的反應(yīng)產(chǎn)物，大致上產(chǎn)生核內(nèi)包涵體的是在細(xì)胞核內(nèi)裝配的病毒（通常為DNA病毒），產(chǎn)生胞質(zhì)包涵體的是在胞質(zhì)中裝配病毒（通常為RNA病毒）。第38頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.

電子顯微鏡檢查（1）電鏡直接檢查：某些病毒感染的早期在臨床標(biāo)本中就可出現(xiàn)病毒顆粒。經(jīng)粗提濃縮后用磷鎢酸鹽負(fù)染，電鏡下直接觀察，可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，獲得診斷。（2）免疫電鏡檢查：在含病毒的標(biāo)本中，加入特異抗體。經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，使標(biāo)本中的病毒顆粒聚集成塊，再經(jīng)負(fù)染觀察，比直接電鏡檢查更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。第39頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（二）、病毒抗原檢查病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過免疫學(xué)技術(shù)檢測標(biāo)本中的特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。用于病毒抗原檢查的抗體，最好是單克隆抗體。

1.

免疫熒光技術(shù)

有直接和間接熒光法。具有快速、實用的優(yōu)點。適合于病毒型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒。間接熒光技術(shù)具有放大作用，因而靈敏度比直接法高。免疫熒光技術(shù)易出現(xiàn)非特異性熒光，導(dǎo)致假陽性，需要嚴(yán)格對照和排除試驗。第40頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.

酶免疫技術(shù)有酶免組化和酶免吸附試驗法。酶免組化法與免疫熒光技術(shù)相同，不同的是將熒光標(biāo)記改為酶標(biāo)記。由于酶反應(yīng)的產(chǎn)物具有累積性，因而靈敏度比熒光技術(shù)高。

3.其它技術(shù)

如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。

第41頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

（四）、病毒核酸檢測

1.

斑點雜交法(dotblothybridization)：

將待測的DNA或RNA直接點在雜交濾膜上,變性后,用標(biāo)記的核酸探針進行雜交。

（三）、早期抗體檢測檢測病毒感染機體后產(chǎn)生的早期特異性抗體。第42頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

2.

固相雜交技術(shù)：將核酸探針進行修飾后，包被強力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待測的核酸序列和標(biāo)記的指示探針在微孔板的雜交液中，進行雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù)進行檢測。或?qū)⒑怂崽结槹挥谖⑿×４胖楸砻?，懸浮于雜交液中。與待測的核酸序列及標(biāo)記的指示探針進行雜交。用磁分離技術(shù)分離結(jié)合有雜交體的磁體，進行檢測。第43頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月3.原位分子雜交技術(shù)（insituhybridization）：是核酸雜交技術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)技術(shù)的一種特殊檢測技術(shù)。通過將細(xì)胞固定后，在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下，在細(xì)胞原位釋放暴露DNA或RNA，加入標(biāo)記的特異核酸探針，進行雜交。通過顯色技術(shù)，可以顯示特定的雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置，和核酸的數(shù)量。直接觀察待測核酸在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)與細(xì)胞染色體的關(guān)系。第44頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月

4.

Southern印跡和Northern印跡法：

Southern印跡法用于DNA的雜交。將DNA提取后，直接或經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后，在瓊脂糖電泳中使DNA按分子量大小分開，然后將瓊脂糖凝膠中的DNA移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進行雜交。可以檢測病毒DNA中的特異序列。

Northern印跡法用于RNA的雜交分析。利用RNA與DBM(diagobenloxymethyl)結(jié)合的特點，將瓊脂糖電泳后的RNA移至DBM膜上，用標(biāo)記探針進行雜交。RNA也可轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進行雜交分析。用于檢測RNA或mRNA。第45頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月5.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)：選擇病毒的特異、保守片段作為靶基因，進行引物設(shè)計和擴增，可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結(jié)合RFLP，測序等技術(shù)可以對病毒進行分析和突變的研究。（1）

DNA病毒：可直接進行PCR擴增其特異片段。第46頁，課件共54頁，創(chuàng)作于2023年2月（2）

RNA病毒：可通過RT-PCR技術(shù)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進行PCR擴增，常結(jié)合巢式PCR(nest-PCR)技術(shù)進行二次擴增，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。（3）

定量PCR技術(shù)：PCR技術(shù)是以指數(shù)方式對靶基因進行擴增。采