流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)的原理及應(yīng)用

臨床實驗診斷教研室施瓊1目前一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞術(shù)（FlowCytometry,FC/MFACS）是一種可以快速、準(zhǔn)確、客觀，并且同時檢測單個微粒（通常是細(xì)胞）的多項特性的技術(shù)，同時可以對特定群體加以分選研究對象為生物顆粒，如各種細(xì)胞、染色體、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多種物理及生物學(xué)特征，并加以定量流式細(xì)胞術(shù)的概念2目前二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀特點單細(xì)胞懸液或生物顆粒

分析速度高多參數(shù)精度高當(dāng)代最先進(jìn)的細(xì)胞定量分析技術(shù)3目前三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FACSCalibur特點：光路調(diào)節(jié)系統(tǒng)固定自動化程度高操作簡便使用壽命長配備1-2根激光細(xì)胞分選速度慢，主要用于細(xì)胞分析臨床型（臺式機）4目前四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點BDLSR5目前五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FACSVantageDiVa科研型（大型機）特點：多數(shù)字化適用于各類細(xì)胞分選4路分選6目前六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FACSAria科研型特點：分辨率高選配多種波長和類型激光器可把感興趣細(xì)胞分選到特定培養(yǎng)孔或板上（4路和24孔板）適用于高速分選和多色分析7目前七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀檢測范圍細(xì)胞大小細(xì)胞粒度細(xì)胞表面面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量細(xì)胞結(jié)構(gòu)特異性抗原（細(xì)胞表面/胞漿/核）細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子細(xì)胞活性酶活性激素結(jié)合位點細(xì)胞受體細(xì)胞功能8目前八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞術(shù)發(fā)展簡史1934年，Moldavan開創(chuàng)流式細(xì)胞自動計數(shù)的基礎(chǔ)。1950s，Coulter公司設(shè)計細(xì)胞自動計數(shù)器，初步解決了流動細(xì)胞的通路問題。1965年，在細(xì)胞分選中應(yīng)用了超聲震動器。1969年，Stanford、California大學(xué)的研究組發(fā)明了第一臺較滿意的流式細(xì)胞儀。1972年，F(xiàn)ACS-?型儀器試制成功，并在美國建國200周年紀(jì)念會上與人造衛(wèi)星并列展示。9目前九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀的工作原理10目前十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FCM的工作系統(tǒng)1.液流系統(tǒng)：細(xì)胞懸液被吸入檢測室后，在鞘液(sheath)的約束下，通過噴嘴，使其形成單細(xì)胞懸液。11目前十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點2.光學(xué)系統(tǒng)：激光是較常用的光源,穩(wěn)定性好、單色性好。散射光和熒光信號被收集、處理轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號。3.數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：對實驗數(shù)據(jù)分析、存儲、顯示。具有智能化、自動化特點。12目前十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀儀器結(jié)構(gòu)液流系統(tǒng)光學(xué)系統(tǒng)

激光光源光收集系統(tǒng)電子系統(tǒng)

光電轉(zhuǎn)換 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)細(xì)胞分選系統(tǒng)

13目前十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點液流系統(tǒng)：流動室、液流驅(qū)動系統(tǒng)InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid14目前十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點液流中心由單列勻速運動顆粒組成的液柱15目前十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點光學(xué)系統(tǒng)入射光系統(tǒng)：激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單一方向、同步的穩(wěn)定光照。發(fā)射光系統(tǒng)：散射光和熒光光收集系統(tǒng)是由若干組透鏡、濾波片和小孔組成,將產(chǎn)生的光信號引導(dǎo)至檢測器16目前十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點入射光—激光光源單波長、高強度、高穩(wěn)定性多采用氬離子激光器或氦氖激光器一般選配2-4根激光，488nm、633nm、355nm和407nmUV激光最多檢測13個熒光參數(shù)17目前十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點18目前十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點發(fā)射光散射光信號

前向散射光（fowordscatter,FS）：在激光束正前方的檢測器，用于檢測細(xì)胞或其他粒子物體的表面屬性，如大小、形狀等。

側(cè)向散射光（sidescatter，SS）：與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器，主要用于檢測細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)屬性，可獲得細(xì)胞內(nèi)超微結(jié)構(gòu)和顆粒性質(zhì)的參數(shù)。熒光信號19目前十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點散射光FSC（小角散射光)它反應(yīng)細(xì)胞的相對大小和截面積的大小SSC(90度角散射光)代表細(xì)胞的顆粒度和精細(xì)結(jié)構(gòu)的變化全血細(xì)胞流式FSC-SSC圖它反應(yīng)細(xì)胞的物理特性,根據(jù)前側(cè)向散射光，可以把不同類型的細(xì)胞群加以區(qū)分20目前二十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser21目前二十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser22目前二十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)PurdueUniversityCytometryLaboratories23目前二十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系統(tǒng)：濾光片24目前二十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點

電子系統(tǒng)：光電倍增管（PMT）25目前二十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FACSCalibur光路圖26目前二十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點細(xì)胞分選系統(tǒng)27目前二十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點

當(dāng)含細(xì)胞的液滴逐個通過激光束時，受到兩種檢測器的檢測:如果液滴中含有細(xì)胞就會激活干涉檢測器(interferencedetector)，只有帶有熒光標(biāo)記細(xì)胞的液滴才會激活熒光檢測器(fluorescencedetector)。當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的液滴通過激光束時，將兩種檢測器同時激活，引起液滴充電信號使鞘液帶上負(fù)電荷。由于液滴帶有負(fù)電荷，移動時就會向正極移動，進(jìn)入到熒光標(biāo)記細(xì)胞收集器中。細(xì)胞分選的原理28目前二十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FluorescenceActivatedCellSorting488

nm

laser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector29目前二十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點信號檢測--熒光信號自發(fā)熒光特異熒光特異熒光能量級激發(fā)激發(fā)態(tài)發(fā)射激光能量損失30目前三十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點31目前三十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點32目前三十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點33目前三十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點34目前三十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點光路——熒光信號每種熒光染料都有特定的激發(fā)波長和發(fā)射波長，流式細(xì)胞儀利用不同波長的光學(xué)濾片來檢測這些特定發(fā)射波長的光學(xué)信號。長通濾片——允許長于設(shè)定波長的光通過

短通濾片——允許短于設(shè)定波長的光通過

帶通濾片——允許一定帶寬—波長的光通過

二向色性濾片——當(dāng)以45o角放置濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光

35目前三十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點熒光信號熒光素吸收激光能量熒光素將吸收能量釋放，轉(zhuǎn)換為 振動能和熱能 釋放較入射光波長更長的光量子熒光素與特異抗體結(jié)合熒光抗體與細(xì)胞抗原結(jié)合越多，產(chǎn)生的熒光信號越強 36目前三十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點37目前三十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點38目前三十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點39目前三十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點40目前四十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀的電子系統(tǒng)

進(jìn)行信號檢測和分析當(dāng)細(xì)胞攜帶熒光素標(biāo)記物,通過激光照射區(qū)時受到激發(fā),產(chǎn)生不同波長的、代表細(xì)胞內(nèi)不同物質(zhì)的熒光信號熒光信號由光電接收器接收，轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，可分析電壓脈沖的高度、面積和寬度電脈沖信號經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號數(shù)字信號傳送到計算機，進(jìn)行儲存、作圖、統(tǒng)計分析41目前四十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點數(shù)據(jù)處理

檢測數(shù)據(jù)的顯示視測量參數(shù)的不同有多種形式可供選擇單參數(shù)數(shù)據(jù)以直方圖的形式表達(dá)，其X軸為測量強度，Y軸為細(xì)胞數(shù)目。雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)既可以單獨顯示每個參數(shù)的直方圖，也可以選擇二維的散點圖、等高線圖、灰度圖或三維立體視圖。42目前四十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（1）直方圖分析X軸：代表熒光信號或散射光信號的強度，用“通道數(shù)”表示，可以與光強度之間線性關(guān)系或?qū)?shù)關(guān)系Y軸：代表該通道內(nèi)所出現(xiàn)具有相同光信號特征性細(xì)胞的頻率單參數(shù)直方圖（Histogram）43目前四十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（2）點圖分析便于數(shù)據(jù)統(tǒng)計不同的細(xì)胞群可以用不同的顏色標(biāo)記主要表達(dá)方式

二維點圖DotPlot44目前四十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析（3）二維等高圖和密度圖45目前四十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點Pseudo3DPlot3DPlot46目前四十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞儀的應(yīng)用47目前四十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點臨床研究

淋巴細(xì)胞亞群測定、血小板分析、網(wǎng)織紅細(xì)胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、造血干細(xì)胞移植監(jiān)測、HLA-B27分析、PNH診斷、人類同種異體器官移植中應(yīng)用、細(xì)胞因子測定、AIDS診斷與治療和療效評價、flow-FISH法測定端粒長度48目前四十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點基礎(chǔ)研究

淋巴細(xì)胞功能、樹突狀細(xì)胞（DC）研究、造血干細(xì)胞研究、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡分析、凋亡相關(guān)蛋白分析、細(xì)胞功能研究、多藥耐藥基因研究（MDR）、腫瘤相關(guān)基因表達(dá)研究、RNA測定、DNA測定、總蛋白測定、癌基因和抑癌基因表達(dá)產(chǎn)物測定、血管內(nèi)皮細(xì)胞研究49目前四十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點50目前五十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點抗體的選擇首選直接標(biāo)記抗體根據(jù)儀器型號和抗原表達(dá)強弱合理選擇熒光抗體PE最強，適用于弱表達(dá)抗原FITC最便宜，適用于強表達(dá)抗原使用雙標(biāo)以上抗體必做熒光補償51目前五十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點光譜交叉Emissionwavelength(nm)530 580 630680730780FITCPEPE-TRPE-CY54colors-simultaneouscollection兩色以上熒光分析存在光譜交叉52目前五十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點熒光補償方法所有補償調(diào)為“0”調(diào)節(jié)電壓，用同型對照或陰性對照，使陰性群位于“左下角”依單陽群體調(diào)節(jié)熒光補償53目前五十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點流式細(xì)胞術(shù)樣品制備的要求制備單細(xì)胞懸液是流式細(xì)胞分析的基礎(chǔ)。標(biāo)本應(yīng)新鮮；采用密度梯度離心分離外周血淋巴細(xì)胞，在分離和洗滌過程中應(yīng)避免高速離心而致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞。常用溶血劑處理紅細(xì)胞。溫度和pH：25-370C，pH7.0-7.2。制備實體組織標(biāo)本的單細(xì)胞懸液時多采用機械法，而少用化學(xué)法或酶消化法。被檢細(xì)胞或顆粒大小0.2－80um樣品中至少20000個細(xì)胞，濃度105-107個/毫升54目前五十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點實驗對照的設(shè)計空白對照：陰性對照：

常用同型抗體對照單色分析：設(shè)同型抗體對照多色分析：同型對照，單陽性對照（用于儀器校正）陽性對照：檢測陰性時55目前五十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點實驗標(biāo)本的處理單細(xì)胞懸液的制備：胰酶消化抗體或標(biāo)記分子的染色：抗原抗體反應(yīng)非特異結(jié)合的去除：洗滌和封閉封閉：血清和同型抗體56目前五十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點特別提醒注意熒光染料濃度的控制：合適的熒光染料濃度是保證最佳信號產(chǎn)生的重要技術(shù)指標(biāo)。

1×106/ml細(xì)胞，用20μl熒光標(biāo)記的單克隆抗體（0.1-1μg/ml)。常用固定劑：細(xì)胞周期測定時應(yīng)將細(xì)胞用PBS洗滌三次后用70%冰乙醇固定，在40C保存數(shù)月；熒光染色后不能及時上機檢測，可用1-4%多聚甲醛固定，40C保存。57目前五十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點同型對照：為陰性對照；實驗中選用的大鼠或小鼠源性標(biāo)記單抗，就一定選用相同源性的標(biāo)記單抗作為同型對照來調(diào)整設(shè)置電流電壓。上機前一般需過目：200-300目全程質(zhì)控：從樣品制備和標(biāo)記、溶血、洗滌、儀器質(zhì)控和上機檢測，需全程質(zhì)控。58目前五十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點

樣品培養(yǎng)細(xì)胞新鮮組織石蠟包埋單細(xì)胞懸液

標(biāo)記熒光抗體檢測表型測定細(xì)胞分選流式細(xì)胞術(shù)操作流程統(tǒng)計學(xué)分析繼續(xù)培養(yǎng)59目前五十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點

細(xì)胞周期分析

（DNA 倍體分析）60目前六十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點細(xì)胞周期、DNA倍體分析原理PI（碘化丙啶）是一種DNA結(jié)合劑，能非特異性嵌入到死細(xì)胞的DNA、RNA上；細(xì)胞經(jīng)TritonX-100或NP-40打孔，把染料引入細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過一段時間染色后，用FCM檢測，可判斷DNA的相對含量。61目前六十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點樣品制備

1000rpm5分鐘收集2X106個細(xì)胞PBS漂洗兩次70%酒精4℃固定過夜收集固定的細(xì)胞PBS漂洗0.5mlPBS懸浮細(xì)胞2.5μl10μg/μlRNaseA37℃消化1小時過300目細(xì)胞篩50μl0.1mg/mlPI（含1%Triton)，1000rpm5分鐘離心兩次混勻，室溫靜止5分鐘上機62目前六十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點建立獲取模式，獲取數(shù)據(jù)

（PI單染分析細(xì)胞周期，同時看凋亡）去甲斑蟊素對肝癌細(xì)胞周期的作用63目前六十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點G0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEventsAtypicalDNAHistogramofcellproliferation64目前六十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點數(shù)據(jù)分析

圈門去除細(xì)胞碎片，分析細(xì)胞凋亡圈門去除粘連體，分析細(xì)胞周期65目前六十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點細(xì)胞凋亡分析

66目前六十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點凋亡細(xì)胞的特點在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變??；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC降低，SSC增加。細(xì)胞壞死時，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC增大，SSC也增大67目前六十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點FCM在細(xì)胞凋亡檢測中的應(yīng)用DNA含量分析Annexin-Ⅴ檢測法TUNEL檢測與凋亡相關(guān)的蛋白測定，如APO2.7，Bcl-2,Bax,Fas,FasL等檢測68目前六十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點DNA含量分析

凋亡的細(xì)胞因核酸內(nèi)切酶的活性增強，使DNA分裂成一些小片段，這些小片段因細(xì)胞膜的通透性的增加而漏出胞外，使凋亡細(xì)胞的DNA含量相對減少，因此在DNA的直方圖上出現(xiàn)一個位于G1峰左側(cè)的小峰（亞G1峰），稱為AP峰。FCM的DNA分析檢測細(xì)胞凋亡存在一定的局限性。比如，機械處理的腫瘤標(biāo)本常有許多碎片，在DNA直方圖上出現(xiàn)較寬的雜信號峰，使凋亡細(xì)胞被“淹沒”其中，不少文獻(xiàn)將G1峰前的所有信號均算為凋亡細(xì)胞，可能會過高計算凋亡細(xì)胞的數(shù)量；因此在評價細(xì)胞早期凋亡時，該指標(biāo)不夠靈敏。69目前六十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點70目前七十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點AnnexinⅤ磷脂結(jié)合蛋白作為探針識別細(xì)胞膜表面磷脂酰絲氨酸

細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞表面發(fā)生變化，細(xì)胞膜內(nèi)部的磷脂酰絲氨酸（PS）可以遷移到細(xì)胞外層表面。巨噬細(xì)胞就是通過識別凋亡細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸將凋亡細(xì)胞或凋亡小體吞噬，保護(hù)機體避免因細(xì)胞內(nèi)部暴露引起的炎癥反應(yīng)。AnnexinⅤ是一種Ca離子依賴的、對PS有高度親和力的磷脂結(jié)合蛋白，可作為探針識別細(xì)胞膜是否有PS而識別凋亡細(xì)胞，由于壞死細(xì)胞也可能在膜表面出現(xiàn)PS，故需要同時進(jìn)行染料（PI）排斥實驗，凋亡細(xì)胞膜完整，不能染色。Annexin-Ⅴ檢測71目前七十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點AnnexinV/PI雙染活細(xì)胞為（AnnexinV-/PI-）壞死細(xì)胞為（AnnexinV+/PI+）凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）72目前七十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點細(xì)胞周期

不能區(qū)分凋亡與死亡細(xì)胞

Sub-G0/G1peaks---PIstaining73目前七十三頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點74目前七十四頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點AnnexinVAssay

建議用于懸浮細(xì)胞75目前七十五頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點AnnexinVAssay

能夠區(qū)分死亡與凋亡76目前七十六頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點AnnexinV-PE/7-AAD雙染色法雙陰：活細(xì)胞AnnexinV-PE單陽：早期凋亡細(xì)胞雙陽：晚期凋亡細(xì)胞7-AADd單陽：壞死細(xì)胞77目前七十七頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點TUNEL檢測78目前七十八頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點注意：細(xì)胞凋亡FCM分析必須與形態(tài)學(xué)分析、DNA電泳等一系列常規(guī)檢測方法結(jié)合，綜合分析，才能給予正確的評價。79目前七十九頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點人外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測80目前八十頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點

(1)淋巴細(xì)胞亞群分析

T細(xì)胞：CD3+CD4+(Th)CD8+(Tc)B細(xì)胞：CD19+CD3-NK細(xì)胞：CD3-CD16+CD56+81目前八十一頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點82目前八十二頁\總數(shù)九十一頁\編于十二點根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同還可將CD4+、CD8+分為

CD4+:Th1:CD4+IFN-r+Th2:CD4+IL4+Th0:CD4+IFN-r+IL4+

CD8+: