分子生物學筆記第一節(jié)的含義

第一 緒所謂在分子水平上命的本質主要是指對遺傳、生殖、生長和發(fā)育等生。第二 分子生物學的主要研究內由于50年代以來的迅速發(fā)展，該領域已形成了比較完整的和研究技研究內容包括核酸/組的結構、遺傳信息的、轉錄與翻譯，核酸1PAGEPAGE7能關系方面取得了一些進展，但是對其基本規(guī)律的認識尚缺乏突破性的進展。細胞生物學：從細胞普通生物學（動物&植物）&微生物學：不同生物類型動（Biochemicalprocesses）1是什么（what，生物學重要性和具體過程），)不具有多樣性，不能攜帶的信息，當時對攜帶遺傳信息的分子的是足的進步。1944年，Avery等人發(fā)現(xiàn)從致病力強的光滑型（S型）鏈球菌提在對DNA結構的研究上，1950-52年Wilkins及Flanklin用X-線衍射技術測定這一階段是從50年代初到70年代初，以1953年ton和rik雙螺旋結構模型作為現(xiàn)代分子生物學誕生的里程碑開創(chuàng)了分子遺傳學基本理論建立和發(fā)展的黃金時代?；鋵κ呛怂?、遺傳信息傳遞的基本方式；從而最后確定了核酸是遺傳的物質在發(fā)現(xiàn)DNA雙螺旋結構同時，Watson和Crick就提出DNA的可能模.年代 特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質的遺傳，隨后研究表明這套遺傳在生物上述重要發(fā)現(xiàn)共同建立了以中心法則為基礎的分子遺傳學基本。1970年Temin和Baltimore又同時從雞肉瘤顆粒中發(fā)現(xiàn)以RNA為模板合成1958年Ingram證明正常的血紅蛋白與鐮刀狀細胞溶血癥的血紅蛋白1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內切酶為工DNA分子有效地插入到細菌細胞之中，產(chǎn)生了重組DNA的克隆。Berg是重組1977年Boyer等首先將人工合成的生長激素釋放抑制因子14肽的重1979年技術公司用人工合成的人胰島素重組轉入大腸桿菌1993年，Mullis由于發(fā)明PCR儀而與第一個設計定點突變的至今我國已有人干擾素、人2、人集落刺激因子、重組人乙型肝、工程幼畜腹瀉等多種工程藥物和進入生產(chǎn)或臨床試用，世界上還有幾百種工程藥物及其它工程產(chǎn)品在研制中，成為農業(yè)和轉動植物和剔除動植物的成功是工程技術發(fā)展的結果投放市場，1996年轉玉米、轉大豆相繼投入商品生產(chǎn)，最早研制得total:52600000USA:30300000Agentina:10000000Canada:300 500000診斷與治療是工程在醫(yī)學領域發(fā)展的一個重要方面。 缺陷我國也在1994年用導入人凝血因子Ⅸ的方法成功治療了乙型血友病的患者。在我國用作診斷的試劑盒已有近百種之多。診斷和治療正1977年Sanger測定了ΦX174-DNA全部5375個核苷酸的序列；他和齒類動物以及水稻、擬南芥和酵母等50多種生物的全組序列測定工作。提出、啟動的人類組計劃(HumanGenomeProject，HGP)，被譽為生命科學的“登月”計劃。年月日國家人類組研究項目斯博士隆重宣布，美、英、日、法、德和中國由30億個堿基對（3×109bp），組成的人類組，蘊藏著生命的奧秘?？茖W家發(fā)現(xiàn)人類數(shù)目約為3.4萬至3.5萬個，僅比果蠅多2萬個，遠小于原先10萬個的估計。2001年成立國際人類蛋白質組組織（HUPO），20031215啟動兩個首單克隆抗體 1975年Kohler和Milstein首次用B淋巴細胞雜交瘤技術出單克隆抗體80年代以后隨著工程抗體技術而相繼出現(xiàn)的單域抗體、單鏈抗體、嵌分子遺傳學基本理論建立者Jacob和Monod最早元學說打開了細菌代謝的分子機制而獲得了生理醫(yī)學獎。同時他們還了mRNA分子1977年最先發(fā)現(xiàn)猴SV40和腺中編碼蛋白質的序列是不連續(xù)的，這種內部的間隔區(qū)（內含子）在真核組中是普遍存在的，揭開了認識真核組結構和調控的序幕。70年代中期以后，癌和抑癌的發(fā)現(xiàn)、蛋白酪氨酸激酶的發(fā)現(xiàn)及其在免疫活性細胞對抗原的識別及其活化信號的傳遞途徑方面和細胞增殖控制方面等都形成了一些基本的概念，當然要達到最終目標還需相當長時間的努力。期 遺傳信息的傳遞與保持（replication轉錄與調控翻譯與調控 教加強溝通（師生、學生、與外界作業(yè) 能力、學習資源利用能力等、表述能力小組學習（克 、一起進步（多元化人才培養(yǎng)、重能力培養(yǎng)平時小考期末考試平時相互幫助（2分TurnerP.C.etal.MolecularBiology.科學WeaverR.MolecularBiology.科學BenjaminLewin.GenesVI,OxfordUni.Press,。《分子生物學》，中國，1997?！冬F(xiàn)代分子生物學》，高等教育，1997?！斗肿舆z傳學》，科學中國生物信息：分子生物學信息網(wǎng) 生物軟件 中華網(wǎng)：大學分子生物學教學：/fzjx/fzswx/classguide/ Ergito(GenesVII）:TutorialsinMolecularBiology: .分子生物學習題及解答.大學，2002王金發(fā)等.分子生物學與工程習題集.科學第2DNA第1節(jié)細胞的遺傳物質第2節(jié)核酸的化學組成第3節(jié)核酸的結構第4節(jié)核酸的物理化學性質第5節(jié)超螺旋和拓撲異構第1編碼氨基酸的61個子具有簡并性、通用性b、編碼選擇性表達的信原核生物的結構占Genome的比例很大，Φx174phage5386bp，結構15RNA：傳染媒介是顆粒（組RNA、蛋白質外殼Tobacco 類（viroid）:使高等植物產(chǎn)生疾病的傳染性因子，只由RNA組成Prion(proteinaccousinfectionsparticle)朊－－－蛋白質樣的因人類庫魯（kuru）均由傳染原蛋白顆粒引起，統(tǒng)稱Prion(朊朊毒體的致病過程是：首先經(jīng)一定途徑（如進食患病動物和內臟）侵入機體并進普利學說公布之初，在學術界曾遭到猛烈，多數(shù)人持否定態(tài)度。因為分子生物學發(fā)現(xiàn)的重大科學價值，普利榮獲1997年度生理學或醫(yī)學獎。第2DNAisanucleotidepolymerwithcovalentbondsbetweenthesugarandPhosphateAlongmolecularchaincontainingasugar,aphosphateandoneoffourdifferentnucleotidebases.ChemicalComposition（化學組成 -phosphodiester (G) (C) (T)名稱與縮寫 cytosinethymine guanine名稱與縮寫 adenosine(Ado) guanosine(Guo) cytidine(Cyd) thymidine(Thd) （帶磷酸adenosine5’-mono(di,tri)AMP,ADP, (dAdo) dAMP,dADP,主鏈的脫氧核糖的羥基能與水形成氫鍵，而磷酸基團在生理條件下離解為負離子第3.1938...Atry 首次用－射線分析b150 hgf A+G/T+C=1A+T G+192 Aldr d &Rosalind 直徑

螺距為34?(任一條鏈繞軸一周所升降的距離每圈有10個核苷酸(堿基力（Vandewaals疏水作用力(Hydrophobic 堿基內能增加(溫度),圖反向重復序列（invertedrepeatitivesequenceorinvertedrepeats,IR）,又稱回三螺旋DNA(TribleHelix T.S1953年，Watson&CrickD.SDNAmodel潛在的專一與 (蛋白質)結合的能形成T.SDNA1957年Felsenfeld等發(fā)現(xiàn)一股為嘌呤，另一股為嘧啶的核苷酸雙鏈能夠形成三鏈如：polyA/polyU polyd(AG)/polyd(CT)——三螺旋DNA的概念提出1987年Mirkin.S.M證明smidDNA在pH=4.3的溶液中,有T.SDNA的存在，這些發(fā)現(xiàn)促進了三螺旋DNA的研究a、D.SDNAD.S.DNA→T.SDNAS.S☆ (偏堿性介質中穩(wěn)定 G＊G、A＊A、☆PY/PU +PY(偏酸性介質中穩(wěn)定) 常見類型G＊C＋ 3、四股螺旋DNA (tetraplexDNA,TetrableHelixDNAA、穩(wěn)定真核生物結構B、保證DNA末端準確C、與DNA分子的組裝有關D、與的meiosis&mitosis有1、條件：加熱，pH，（尿素、酰胺)，低鹽濃度¤¤DNA溶液的溫度（0.1℃／分）Tm=ofCtC0/2OD增加值的中點溫度(85-95℃)DNA雙螺4TmAT,C,GGC Tm值愈AT形成變性，變性加快，Tm值小 已知大腸桿菌的組為4.2x106bp,COt1/2= 四、核酸分子雜交固相雜交(濾膜雜交1975E.M.Southern S.S.DNA×S.S. J.C.Northern S.S.RNA×S.S. Western Protein(antigen)×＊固相分子雜交(1975EM第5一、超螺旋 松馳態(tài)DNA（relaxform）低能量常態(tài)超螺旋（Supercoied） 正超螺旋（positivesupercoiled）overwinding右旋負超螺旋（Negative 松纏unwinding(左旋White

W（Writhingnumber）：超盤繞數(shù)，即超螺旋數(shù)，直觀上為雙螺旋在空間的轉動2、核酸的一級結 書寫方3、 ＆Crick的 參 大小 二級結構的多態(tài) 6、變性：溶解曲線 化學試劑、鹽、7、復 形成、類第3章與組的結斷裂構 性2）種C真核生物的結、簇、DNA、分散重復DNA序列人類組計了解人類組的重復順序、人類組計劃第1節(jié)的概第2節(jié)命名簡第3第4節(jié)及組的大小與C值第5節(jié)第6節(jié)第8節(jié)第9節(jié)人類組研究進第1節(jié)的概結構：編碼蛋白質 調控研究的發(fā) 分子反向生物學1955，Benzer用以表述T4具溶菌功能的區(qū)的2個亞區(qū): 第2節(jié)命名簡表示3個小寫斜體字母表示 3個小寫斜體字母+1個大寫斜體字母。自然質粒3個正體字母，首字母大寫重組質粒在2個大寫字母前面加小寫人 一、割裂的發(fā)

第3真核生物的都是不連續(xù)或割裂(splitgene)。 開的。割 割 SplittingGeneSplittinggeneSplittingGene 大T抗原小t抗原Splittinggene割裂的外顯子在中的排列順序和它在成熟mRNA產(chǎn)物中的排列順序是相 關系的序列，結果表明一個的外顯子常與其他的外顯子有親緣關系。兩個相關內含子之間的親緣關系遠遠不如其外顯子之間的親緣關系緊密 SplittinggeneIntron并非“含而不露 細胞色素bIntronII編碼成熟Exon并非“表里如一人類尿激酶原ExonI不編碼氨基酸序并非真核生物所有的結構均為splittinggeneHistonegenefamilyYeast中多數(shù)第4節(jié)及組的大小與C 的例子里，甚至有5060kb大多數(shù)酵母小于2kb，很少有超過5kb的開 開 廣和

由于人們無法用已知功能來解釋組的DNA含量，所以產(chǎn)生了C值(Cvalue第5節(jié) 一闕新歌聲漱玉，歌聲漱玉采蓮人一、原核生物的(overlap在細胞 中，一般一段序列只以三種白質可讀框一種被閱，但是在一些或線粒體中，兩個近的一種巧妙的方式生，并不同的可讀框被閱讀并表達，因此一段相同的DNA序列可以編碼兩個非同源蛋白φXl74的DNA序列組織上有(overlap-gene)和內①一個完全在另一個內部如：B和A＊E和D內部分一個堿基在這 一個特定的外顯子可能選擇性地與不同的外顯子連接形成信使RNA第6節(jié) 細菌的組通常僅由一條環(huán)狀雙鏈聚集在一起，形成一個較為致密的區(qū)域，稱為類核（nuleoid）。類核無核膜與胞A超螺旋。Fig.TypicalbacterialE.coligenomeisasingledouble-strandedDNAmoleculeof1.6ButE.coliisonly~2minDNAis~1000largerthanthesizeoftheThisisachievedbysuper-coilingtheDNAgyrase旋轉酶introducesnegative-superhelicaltwistsintotheDNA. degreeofsupercoilingofthechromosomeisstrictlyregulated.( 具有子(trnascriptionaloperon)結構,其中的結構為多順反子數(shù)個子還可以由一個共同的調節(jié)（regulatorygene）即調節(jié)子（regulon）X174D-E-J-F-G- 外殼蛋白J、F、G、組裝蛋白D裂解蛋白E.coli色氨酸子9個順反子9個酶真核很少，如18s5.8s28srRNA在大多數(shù)情況下，結構在細菌組中都是單拷貝。細菌組編碼順序一般不會，和組不同的在DNA分子中具有各種功能的識別區(qū)域如起始區(qū)OriC，終止區(qū)TerC,轉在或子的終末往往具有特殊的終止順序,它可使轉錄終止和RNA聚合酶從DNA鏈上脫落。例如大腸桿菌色氨酸子后尾含有40bp的GC豐富區(qū)，其后ProkaryoticDNAiscompacted–E.g.E.colipacks1.5mmchromosomeintoacellthatisonly1uminNohistonesornucleosomes–SmallbasicproteinsMAYserveasimilarGenesusuallydonotSingleoriginofreplication（二）質粒指細菌 組大小約質 、轉（一）真核（二）真核（四）葉綠 （一）真核(Eukaryoticchromosome組蛋白核小體著絲粒（centromere或中心粒)和端粒 Chromatinstructureenablesthechromosomestoaltertheircompactnessasthecellprogressthecellcycle.組蛋白 Mononucleosomestypicallyhave~200bpDNA.End-trimmingreducesthelengthofDNAfirstto~165bp,andthengeneratescoreparticleswith146bp.The10nmfiberisacontinuousstringof4.結構的形（1）有絲中期的（二）真核組(Eukaryoticchromosomegenome結構復雜，數(shù)龐大，具有許多起點，每個子大小不一斷裂（splitgene)。與間的非編碼序列為間隔DNA（spacerDNA).7）功能相關的構成各種，可串聯(lián)在一起，也可相距很遠。8）可移動因素（geneticelement),又稱為自私（selfishDNA).真核生物組的結–編碼蛋白質tRNA順式作用元件（cis-acting指與結構表達調控相關、能夠被調控蛋白特異性識別和結合的DNA序 真核生物分布在多個上，而原核生物只一個乎每一個都是完整的連續(xù)的DN段；真核生物組的起點多，缺少明顯的子結構，而原核生物的組含有編碼2個細胞色

5.4—DH降解酶(ND1～6)和2線粒體是 需與 互作編碼一些遺 圖1-1線粒體DNA葉綠體組較大，在高等植物中通常為140kb第7DNA一

第8節(jié)（gene 。超（genesuperfamily)指一組由多及 。 簇(genecluster)是指中的各成員緊密成簇排列成大段的串聯(lián)重復 DNA），成簇存在 概念：DNA有些高度重復DNA序列的堿基組成和浮力密度同主體DNA有 lite大DNA（macrosaliteDNA)又稱為經(jīng)典DNA?？傞L度100kb~幾個Mb。根據(jù)順序組成。小DN（minisaliteDNA)由中等大小的串聯(lián)重復序列構成，總長約0.1~20kb，分布在所有，往往近于端粒處。高度可變的DNA、端粒DNA（串聯(lián)的微DNA（microsaliteDNA):重復單位為1~5bp,重復次數(shù)為10~60次，總長度,短散在核元件（shortinterspersednuclearelements，SINEs),主要是Alu重復序列。序列中有限制酶Alu的酶切位點（AGCT）而得名。重復次數(shù)30~50萬，散在分布于組中，與表達調控有關。長散在核元件（longinterspersednuclearelementsLINEsKpn一、人類組的基本特點三、人類組計劃斷 人 A+GG+CSNP300SNP2（240 D三、人類組計劃 組計劃(HumanGenomeProject，HGP)， 年月決定出資億，用15年時間（1991—2005年）完成“人類組計劃”?！叭祟惤M計劃”是生物學有史以 年月日國家人類組研究項目斯博士隆由30億個堿基對（3×109bp）組成的人類組，蘊藏著生命的奧秘?？茖W家發(fā)現(xiàn)人類數(shù)目約為3.4萬至3.5萬個，僅比果蠅多2萬個，遠小于原先10萬個2－5完成5人 斷裂構 性種類真核生物的結、簇、DNA、分散重復DNA序列人類組計第四章DNA 第一節(jié)DNA概述第二節(jié)DNA的酶學DNA

第一節(jié)DNA概述(DNAReplication:An三、起點、方式和方向 DNA中含有一定起點和終點的單位。1.3萬—90萬不Aunitofthegenomeinwhich aregionfromoriginto Themultiprotein(30±)structurethatassemblesatreplicatingforktoundertakesynthesisofDNACsClCesiumchloridedensitygradientultracentrifugation（CsCl密度梯度超離心LabeledE.ColiDNAwith 三、起點、方向和方AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprisesinglereplications.（單子）1、起點（origin，ori或O，原點）開始處DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：單起點，即——整個只有一個單位真核生物（Eukaryote）：多起點，即－－一個genome中有多個單位2、方向（過程的順序性 fork）：中參與的活性區(qū)域，即正在發(fā)生眼 真核生物的多 多個（1）單雙向取決于起點處有一個還是兩個（2）的多模多起點、單方向（真核多起點、雙方向（真核3、方從新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork置換式（Discementform）又稱D circle從新起始（denovoinitiation）或叉式（replicationfork）或θAreplicationeyeformsathetastructureincircular置換 form，又稱D線粒體和葉綠體DNA的方共價延伸方（covalenceelongation）或滾環(huán)式 （rollingcirclereplication）由于時產(chǎn)生的滾環(huán)結構形狀象σ，又稱σ 1968年（ReijiOkazaki）設計了兩組實驗，其一是脈沖標記實驗experiment了研究在脈沖標記實驗中所發(fā)現(xiàn)的10－20s的小片段在全過程中的發(fā)展結局，將實驗菌株先進行同位素標記培養(yǎng)30秒，然后轉入正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)分為此將DNA的這種方式稱為不連續(xù)模式，將最初合成的10－20s片段稱如果兩條極性單鏈的DNA均按這種不連續(xù)的模式進行，后隨鏈的合成可以在模板單鏈到1000－2000核苷酸長度后，開始從5’→3’合成片段，而先導鏈的合成從進化的原則講，大可不必按片段的模式不斷地啟動小片段的合成，既耗時又費能。換言之,DNA的應該是按一種半不連續(xù)的方式進行，即先導鏈以連續(xù)的方式完成子代DNA的合成，而后隨鏈以不連續(xù)的方式完成OkazakiDNA全部為小片DNAIIIdUMPDNA分子中，必然會導致生物的表達與進化過程中的潛在，實際上E.coli依靠了兩種機制了dUMP摻入到DNA分子的過程。由dut編碼的dUTP酶（dUTPase）能有效dUTPdUDdUTPasedUTP1／1200dUTP分子的DNA分子中的dUMP切除，形成一個無嘌呤或嘧啶的Ap位點（apurinicapyrimidinic鏈為模板重新聚合和連接，完成切補修復過程.1200dUMP被切除的dutungdut－突變體的脈沖標記實驗中，由由于已摻入的dUMP被切除的幾率降低，片段變長。選用連接酶突變體第二節(jié)DNA的酶學 ofDNA底物： 模板（temte):解開成單鏈的DNA母鏈引物（primer):寡核苷酸片段,3’-OH末端,dNTP其它酶和蛋白質因子:合酶（DNA DNApolymerase）或DNA指導的DNA聚合酶（DNA-directedDNA (一)DNA聚合酶催化的反應(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+2、3’－5’ 校對功能 KornbergInfact,thereare5polymerasestodate,althoughwewillfocusonlyonDNApolDNApolDNApolDNAPolymeraseDNAPolymeraseDNApolⅡ：5`3`聚合酶活性及3`5`:–α5`3` DNApolⅢ是主要 為什么子鏈DNA延伸方向只能是5’(一)模板對的指導作用在于堿基的準確配對，而堿基卻埋在雙螺旋的內部。只有相關蛋白的：dnaA、dnaB、dnaC……dna相應的表達產(chǎn)物蛋白質：DnaA、DnaB、DnaCDnaXDnaA：辨認起始位點DnaBDnaC：輔助解螺旋酶使其在起始點上(二DNA拓撲異構酶I（topoI）拓撲異構酶II（topo(三)單鏈DNA結合蛋白(SSB):表4參與DNA的酶及蛋白DNADNADNA合成RNA引物DNA

1、基本概 DNA子體時3、起點：結構特方向：叉眼單雙向的決定條件的多模式D環(huán)（置換式4、酶三種 聚合活 外切活 5、DNA的半不連續(xù)實 先導 后隨BacterialDNATerminationofDNAStudysystem:theE.colioriginlocusoriCisclonedinto smidstoproducemoreeasilystudiedminichromosomes.Initiationisdividedintothefollowing–1.recognitionoftheorigin（識別原點–2.separationofparentalstrandsandstabilizationofsinglestrands（分開雙 HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.假定每個都在同樣的一個起始點（i）開始，那么距i近的將先被而得多些，遠離i的將得少些。因此在一個群體中離i點越近的出現(xiàn)頻率越高。假如–雙向的，頻率以i為中心呈雙向梯HowdoweknowthatthereisonlyoneoriginofreplicationinE.測定了大腸桿菌上很多的頻率，發(fā)現(xiàn)以OriC附近為WhatdoesthisexperimentThereisasingleceonthechromosomewherereplicationReplicationproceedsinbothThetworeplicationforksmeetatnear31’onthegeneticmapThestructureofOriCHowisreplicationDnaAproteinbindsto9-mers9nt聚合體DnaAtogetherwithHUdenaturetheDnaBhelicasebindstheopenInitiationofDNAreplicationinE.AlongwiththeHUprotein,thednaAprotein-ATPcomplexbindstothe passingthefournine-mers.Inall,thiscomplexcoversabout200bp.（隨同HU蛋白一起，dnaAprotein-ATP復合體結合到DNA上，包圍4Opencomplex（開放復合體）和Preprimingcomplex(前復合體ATP這時DnaB和DnaC蛋白進入DNA的熔解區(qū)與OriC結合形成前復SeparatedstrandsintheoriCregionarepreventedfromreannealingbythebindingofsingle-strandedbindingprotein(SSBprotein).TheprimosomecomplexAhelicase(DnaB)beginstounwindtheSSBbindstopreventGyraserelievesthetension.PrimasesynthesizesashortstrandofPrimasebindstodnaBproteinatoriCandformsaprimosome體Let’sreviewtherolesofthemajorDnaA-RecognizesoriginanddenaturestheDnaB-HelicasethatunwindstheDnaC-RequiredforDnaBHU-histone-likeproteinstimulatesPrimase(DnaG)SynthesizesRNASSB-SinglestrandedDNAbindingRNApolymeraseFacilitatesDnaADNAgyraseRelievestorsionalDammethylaseMethylatesGATCsequencesatReviewInitiationofDNAreplicationinE.oriCcontainsfour9bpbindingsitesfortheinitiatorproteinDnaA.SynthesisofDnaAiscoupled聯(lián)系togrowthratesothatinitiationofreplicationisalsocoupledtogrowthrate.DnaAformsacomplexof30-40molecules,facilitatingmelting解鏈ofthree13bpAT-richrepeatsequenceforDnaBbinding.DnaBisahelicasethatusetheenergyofATPhydrolysis水解tofurthermeltthedouble-strandedDNA.SSB(single-strandedbindingprotein)coatstheunwindedDNAtopreventDNArenaturing.DNAprimaseloadtosynthesizesashortRNAprimerforsynthesisoftheleadingstrand.Primosome(體):DnaBhelicaseandDNAElongationinvolvesanothercomplexofproteinscalledtheREPLISOME(體，顆粒).Itisassembledfromitscomponentseachtimereplicationoccurs.E.colireplicationmachinery(Elongationphase)HelicaseunwindDNAatreplicationforkinareactioncoupledtoATPSingle-strandedDNAbindingproteins(ssb)bindandstabilizetheDNAinasingle-strandedconformationaftermeltingbyhelicasesPrimosomesynthesizesRNAprimersonlaggingDNAPolIIIthetrueE.coliDNATopoisomerase–relaxessupercoiledDNAthatformsaheadofreplication–decatenatesthefullyreplicatedDNAPolIrecesRNAprimerswithDNAbynick- joinsOkazakiConcurrentDNABothstrandsreplicatesimultaneouslyatthesamereplicationThelaggingtemtestrandisloopedtoinvertthephysicaldirectionofsynthesis,butnotthechemicaldirectionDNApolymeraseIIIfunctionsasadimer,witheachcoreenzymeachievingsynthesisononeortheotherstrandIfthepolymerasecomplexismovingcontinuouslyalongtheleadingstrand,howdoesitdiscontinuouslysynthesizeDNAalongthelaggingstrandintheoppositedirection??TerminationofDNASpecificterminationsitesofDNAreplicationexistinE.Terminationinvolvesthebindingofthetusgeneproduct(tusprotein)--terbindingprotein,aninhibitoroftheDnaBhelicase（終止位點結合蛋白，ThisterbindingproteinmayacttopreventhelicasefromunwindingDNA(willthereforehalt停止polIIIandpolIaction).DNAreplicationproducestwointerlockingrings（連環(huán)）whichmustThisis plishedviatheenzymetopoisomerase.TerminationofE.coliDNAreplicationTrapthereplicationforks（使叉受到限制Containsequencesthatfacilitatedecate-nationandpartitioningof<300SummaryofstepsinE.coliDNAdnaAproteinmeltsduplexinoriCdnaB(helicase),alongwithdnaCandATPbindstoreplicationfork(dnaCproteinexits).(Pre-primingcomplex)Singlestrandbindingprotein(ssbprotein)bindstoseparatedstrandsofDNAandpreventsreannealing.Primasecomplexeswithhelicase,createsRNAprimers(pppAC(N)7-10)onthestrandsoftheopenduplex2(Primase+helicaseconstitutetheAftermakingtheRNAprimers,DNApolIIIholoenzymecomesinandextendstheRNAprimer(layingdowndNTP's)ontheleadingstrand.4.Asthereplicationforkopensup(viahelicase+ATPaction)leadingstrandsynthesisisanuninterrupted不間斷的process,thelaggingstrandexperiencesagap.ThegapregionofthelaggingstrandcanwindaroundoneactivesiteunitofthePolIIIcomplex,andboundPrimaseinitiatesanRNAprimerinthegapregion.Onthelaggingstrand,PolIIIextendstheRNAprimerwithdNTP‘sasthelaggingtemtestrandisloopedthroughthePolIIIcomplex. Aftersynthesisofanascent初始fragmentthelaggingstrandloopisreleasedandthesinglestrandregionfurtherupnearthereplicationforkissubsequentlyloopedthroughthePolIIIcomplex.Steps7-9areMeanwhile其間,PolIremovestheRNAprimerregionsoftheOkazakifragmentsvia5to3'exonucleaseactivitynicktranslationPolIexitsandligasejointstheDNAfragments(onlaggingstrand).EukaryoticDNAcellnuclearomereYeast(Saccharomycescerevisiae酵母:hasmuchsmallergenome(1.4X107bpin16chromosomes)andonly400replicons.SV40(simian 40猿猴40,5kb):isgoodm lianmodelsforreplicationfork.Cell-extract無細胞提取物preparedfromXenopuslaevis(非洲爪蟾)eggscontaininghighconcentrationofreplicationproteinsandcansupportinvitroreplication.cellcycle——細胞從一次有絲結束到下一次有絲完成所經(jīng)歷間期(interphaseG1phase，Sphase，G2phase，細胞可由G1期進入一Mphase:有絲期(Mitosis),胞質期細胞周期是通過多種蛋白激酶復合物催化的蛋白磷酸化來實施調控圖Cyclin-dependentkinase(Cdk)OriginsandARS（自主序列Licensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特許因子）DifferencesinDNAbetweeneukaryotesandprokaryotesEukaryoticgenomesaremuchReplicationineukaryotesoccursduringasmallportionofthecellDNAineukaryotesisboundbyEukaryoticchromosomesare圖MultipleReplicationOnlyonceinonecellcycle(每個細胞周期只有一次Clustersofabout20-50replicons(子) initiatesimultaneouslyatdefinedtimesthroughoutS-phase（20-50個子在S期同時起始）Initiationofeachrepliconwithinaninitiationzonemayoccurat不同區(qū)域的染色質起始的時間不同EarlyS-phaseeuchromatin常染色質LateS-phaseheterochromatin異染色質Centromeric(著絲粒的)and omeric(端粒的)DNAreplicateatlastYeastorigin:theminimal11bpBoundbyoriginrecognitioncomplex(ORC起始識別復合體)activated激活byCDK.ARS:AutonomouslyReplicatingSequence（自主序列）。單細胞酵母的起點克隆進原核生物的質粒，由于這些起點序列允許質粒在酵母中而被稱之為ARS。TheyeastLicensingfactorcontrolseukaryoticreplication（特許因子控制真核生物DNALicensingfactorcontrolseukaryoticrereplicationDNAThemachineryof–AdditionalfeaturesofeurkaryoticOnereplicationpercycle–Theoriginofreplication–passagethroughaseriesof?Originofreplicationboundby?Licensingfactorsbindassembletheprereplication?Licensingfactors–atleastsix–Mcm2-?Mcmproteinsmovewiththereplication?McmproteinsarethendiscedfromDNAbutremainin?Mcmproteinscannotreassociatewithanoriginofreplicationwhichhasalready‘fired’replicatonThemachineryofAdditionalfeaturesofeurkaryoticNucleosomesandthereplication–Histones–H3H4tetramers四聚體remainintactandaredistributedbetweenthedaughterduplexes–OldandnewH3H4tetramersfoundoneach–H2A/H2Bdimers–separateandbindrandomlytoH3H4tetramersalreadyinceReplicationof Whathappenstothenucleosomewhenthereplication replicationmachinery andopenuptheDNAdoublestrand?Nucleosomesarefoundproperlyspacedonboth strandsimmedia yafterpassageofreplicationfork.圖Amodelfornucleosome圖AmodelfornucleosomereplicationNucleosomeandReplicationforkNewnucleosomesareassembledtoDNAfromamixtureofoldandnewlysynthesizedhistonesaftertheforkpasses.EukaryoticDNADNAsynthesisisverysimilarinprokaryotesandManyofthesameenzymeactivitiesareNuclearMatrix（核基質Nuclearmatrix:Replicationisspatiallyorganizedbyaproteinscaffoldofinsoluble不溶的proteinfibers.Replicationfactoriesareimmobilized固定onthismatrixandtheDNAmovesthroughthem.Ascaffoldofinsolubleproteinfiberswhichactsasanorganizationalframeworkfornuclearprocessing,includingDNAreplication,omerereplication——TheproblemoflinearomereSolvingtheproblemoflaggingstrand--ChromosomalendsRegulation0fDNA大腸桿菌DNA的調大腸桿菌DNA的調–起始物位點編碼調節(jié)蛋白質，起點與調節(jié)蛋白作用啟動–編碼的調節(jié)蛋白通過與復合物的相互作用確定起始頻率和方式。細胞生活周期水平調控：限制點調控，真核細胞DNA的發(fā)生是起始調控，如酵母起始受時序調控。BacterialDNA–TerminationofDNAEukaryoticDNA–cell omereDNA聚合酶DNA聚合酶核酸酶DNA聚合酶快慢Regulation0fDNA Chapter DNAdamageand教學要求DNADNA(5.1.1Thereasonsof5.1.2Typesof5.1.3Mutagens誘變劑5.1.4mutagenesis誘變Mutation(突變）=Permanent,heritableal tionsinthebasesequenceofaDNAThereasonsofSpontaneouserrors(自發(fā)性錯誤):inDNAreplicationor Mutagen(誘變物): AconsequenceofthedamagingeffectsofphysicalorchemicalmutagensonDNAMutagen=mutationcausingEssentiallyallmutagensare 物MostcarcinogensareTypesof)-InvolvelargeregionsofDNAPointmutations（點突變-Involveonlyoneor few-AriseduringDNATypesofpointmutations ABCDEEF ABCD-F Typesofpointmutations 堿基序列的改變引起了產(chǎn)物氨基酸序列的改變Nonsensemutation（無義突變）: 為蛋白質合成的終止子(stopcodon，TAG,TAA,TGA)。 effect(silentmutation沉默突變)Readingframe（閱讀框）isoneofthethreepossiblewaysinwhichanmRNAsequenceofnucleotidescanbereadasaseriesofbasetriplets三個一組tospecifytheaminoacidsinaproteinchain.ORFopenreadingframe開放性閱讀框fromstartcodontostopWhatisthefirstdefenseagainstOntheonehand,theactualerrorrateofthepolymerase,beforeediting,isoftheorderof0.1%to1.0%.However,theoverallerrorrateforDNAreplicationis1errorin109to1010baseThisphenomenalfidelityisachievedinthreeways.Replicationfidelity（的保真度）First,Watson-CrickbaseSecond,DNApolymeraseshavetheabilitytoedit("proofread")theirwork(3’to5’exonucleaseactivityofthepolymerases).Third,post-replicationrepairofDNA（mismatch(High-energyionizingradiation(電離輻射）: X-raysandγ-raysstrandbreaks（斷鏈），base/sugardestruction（堿基/核糖損傷）Nonionizingradiation（非電離輻射）UVlightpyrimidinedimers（嘧啶二聚體 ogs（堿基類似物）mispair，direct deaminatesCto (Directmutagenesis直接誘變)resultsfromthepresenceofstableunrepairedbasewithalteredbasepairingpropertiesintheDNA.Indirectmutagenesis()Themutationisintroducedasaresultofanerror-pronerepair（傾向差錯的修復）. 損傷)DNAsynthesisInsertionofbasesoppositeunrepairedlesionregardlessoftheoriginalsequence（不顧原始序列如何，在未修復的損傷序列對面插入堿基--tomaintaintheDNAintegritybutnotthesequenceaccuracy（只保證DNA序列的完整性，不保證序列的精確性）.DNA bulkyadductsDNAlesions(DNA損傷）：Anal theDNA（DNA正常的化學或物理結構的改變）Alkylation烷基化作用Bulkyadducts聚化加合物Bulkylesionssuchaspyrimidinedimersandarylating芳基化agentadductsdistortthedoublehelixandcauselocalized局部denaturation.ThisdisruptsthenormalfunctioningoftheDNA.鍵，然后，又由3’-5’校對功能而將之水解。如此反復發(fā)生，而產(chǎn)生了一個空耗由于蛋白質仍在不斷合成，而DNA不能，細胞也就不能，結果出現(xiàn)細絲狀的所謂蛇形細胞，最后導致細胞。Direct(Exisionrepair切除修復Mismatchrepair錯配修復Post-ReplicationRepair 后修復binationalrepair（重組修復SOSPhotoreactivation(活 E.coliPhotoreactivationofThymineProcessiscatalyzedinaprocesssimilartophotosynthesisharvestingenergyfromHumancellsdonotcontain(AlkylationofDNACanblockDNAreplicationbecauseofmodifiedbasesthatareSometimeusedinchemotherapy（化學療法）toblockcellUsuallypurinesarealteredspectrumofproductsMosthighlymutagenicoftheseGuanine→O6–alkyl替換為烷基轉移酶特異性地轉移O6–甲基鳥嘌呤或O6–乙基鳥嘌呤上的甲基或乙團Exisionrepair切除修復–NucleotideExcisionRepair（NER，核苷酸切除修復 E.coliendonuclease Uracil-DNANglycosylaseIsaubiquitousmechanismrepairingavarietyoflesions.是修復多種損傷的普遍性機 核苷酸切除修復—ExcisionrepairsystemsinEuvrA和uvrB發(fā)現(xiàn)二聚體后，uvrA解離，uvrCuvrB和uvrCDNA被DNA螺旋酶(uvrD)DNADNAI和連接酶填補）核苷酸切除修復ExcisionrepairsystemsineukaryotesNucleotideexcisionrepairBaseexcisionrepairBER,堿基切除修復Mismatchrepair錯配修復OccursjustafterMustdistinguishtheparentfromthedaughterbinational（重組修復PresentinprokaryoticandeukaryoticOnlypoorlyWeknowitexistsbecauseUvrA-andRecA-cellsaremuchmoresensitivetoUVthancellscontainingonlyonemutation.binationalDependsonRecAproteinimportantfor binationandrepair;itcatalyzesstrandSOSrepair（SOS修復UVreactivation（紫外激活反應）Wreactivation（W激活反應50年代J.Weigle發(fā)現(xiàn)，用經(jīng)紫外線照射后的噬菌體用低劑量UV照射過的大腸桿菌時，噬菌體的存活率比未用低劑量UV照射的大腸桿菌明顯增加，突（W激活反應）TheincreasedsurvivalintheUVirradiatedhostisduetotheinductionoftheSOS-repairsysteminthehost.（存活率上升是由于紫外線照射引起了寄主SOS修復Metabolicsystemthathelpsthecellsurviveinperiodsofpotentiallylethalstresses（在UVirradiation（紫外照射TreatmentwithDNAmodifyingenzymes（DNA修飾酶處理Inactivationofgenesessentialtoreplication（DNA必須的失活SOSrepairDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesWernersyndromeprematureaging過早衰老beginningin20’slifeexp.Predisposition易患病的體質tomalignanciesDiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesBloomsyndromedwarfismimmunedeficiencybutterflyrash皮疹sunpredispositiontomalignanciesofalltypes(uptohighsisterchromatidexchange,other DiseasescausedbydefectsinRecQhelicasegenesRothmund-Thomsonsyndromeskin,skeletalabnormalities骨骼畸形sunPredisposition易患病體質to somaticwholechromosomeaneuploidyDNA是遺傳信息的載體，它需要有極高的保真度，這不僅依賴于 –Exisionrepair切除修復( binationalrepair（重組修復第6章RNA細菌的轉 1956年E.Volkin和 這種“信使”Jacob和Monod將它定名為:信使RNAMessengerRNA)或mRNA1. 1963J.Marmur和DotySpiegelnan區(qū)分有義鏈。采用枯草桿菌的SP8SP8DNA雙鏈有“輕”、“重”’-利用這個差別以14C來標記U,在0C培養(yǎng)E.coli6.1.4RNA合成和DNA的區(qū)轉錄的底物是rNTP，的底物是細菌的轉1.全酶(HoloEnzyme)和酶(Core(1)全酶（Holo依靠空間結構與DNA模板結合(σ 半衰期：數(shù)小時 轉錄效率低，速度緩慢（σ的結合（2）酶（Core作用于轉錄的延伸過程（終止依靠靜電引力與DNA模板結合（蛋白質中堿性基團與DNA半衰期：60 RNApolcoreσ Enzyme識別啟動子的 tamaBox(－35區(qū)), ?酶的組建因促使RNApol與DNAEditing(排斥與模板鏈不互補的堿基與Rho（ρ）因子競爭RNA構成Holoenzyme后,β因子含有兩個位點Isite siteRifs):該位點專一性地結合(Esite(elongationsiteRifR):對NTP非專一性地結合（催化作用和Editing功能β’ 有義DNA鏈結合位點（β’亞基提供雙鏈DNA解鏈位點（α亞基提供原核生物RNApolCore)RNApol物的區(qū)域，它還包括一些調節(jié)蛋白因子的結合位點。CAP-cAMP（表達調控的正控制位點CAP（catabolitegeneActivatorProtein）降解物活化蛋白，環(huán)腺苷RNApol的進入（結合） 2、RNA聚合酶的進入位點（1）tama框（tama Pribonow框（Pribonow-10序列，RNA聚合酶的牢固結合位點——結合位點（B位點一致序列 4轉錄起始位點一、終止子的種類1ρ因子的終止子(內在終止子)1ρ因子的終止子(強終止子結構特征?發(fā)夾結構的突變可轉錄的終 二是6~8個連續(xù)的U串(發(fā)夾結構末端2ρ結 IR序列中的G／C對含量較 造成高度延宕（典型的有60秒左右RNApol6~8個連續(xù)的U串可能為RNApol與模板的RNA－DNA之間的rU－dA結合力較弱于是：RNA－DNA解離 三元復合體RNApolU2ρ通讀（readthrough）：ρ因子的轉錄終止過程中，RNApolIR序列之后，雖發(fā)生一定時間的延宕，但如果沒有ρ因子存在，則RNApol會繼續(xù)促進轉錄終止的活性，NTPasea、ρ因子與RNA結合（終止子上游的某一處，RNA的5’c、ρRNApolRNAPol轉錄ρ因子跟在RNAPol后沿RNA轉錄終止,釋放出RNAPolρ子和RNADNARNA值，才能配合ρ因子與RNApol的作用序列不同的終止子→不同的終止程度 編碼鏈 轉錄方向都是5’→（1）全酶（2）酶(coreα2ββ’DNA啟動子概念原核生物啟動子的特點②-10bp處-TATAAT- ③-35bp處- (tama封閉的酶-啟動子二元復合物（closedbinary開放的啟動子二元復合體（openedbinarycomplex）真核生物的6.3.1真核生物的RNApolⅠ核 活性所占比例最大轉錄rRNA（6.8S、18S、RNApolhnRNA、snRNAhnRNA（mRNA前體，核不均一 heterogeneousnuclearsnRNA（核內小分子RNA，small 表6-2真核生物的三種RNA 28S,18S,6.8S感 表6-34RNApol分子量500KDa,7~12大亞基中有C末端結構域(carboxy C端重復七肽，不同生物中重復數(shù)目不一樣（酶活性RNApol→三種啟動子→三類，Ⅰ Ⅱ Ⅲ1、RNApolⅡ的啟動子——2、RNApolⅠ的啟動子——3、RNApolⅢ的啟動子——位于轉錄起始點的上游,通用型啟動子（無組織特異性siteTATA框（HognessGoldberg-Hogness框位于－30一致序列為定位轉錄起始點的功 CAAT框（CAAT增強子GC（GC序列為八聚核苷酸元件（octamerelementOCT元件） B元 一致序列為 一致序列為,啟動子（corepromoter）或元件（coreelement），位于-45到+20，負責轉,可增 5SRNAtRNAb、上游啟動 最早發(fā)現(xiàn)于非洲爪蟾的5S★非洲爪蟾的細胞提取液作為體外轉錄體系，進行缺失試★以不同長度的5SrRNA為模板進行轉錄。結果★5SrRNA的啟動子位于內第一類：含A框和C框（5SrRNA）第二類：含A框和B框（tRNA、VARNA）?RNApol圖6-23真核RNAPolⅢ的內啟動子和外啟動

?轉錄起始過程需要很多的輔助因子(轉錄因子)參與, 成復合物，協(xié)助RNApol定位于轉錄起始點。RNApolⅡ的轉錄起始RNARNApol單制

需要二種輔助因子：UBF1、表6-6RNApol TBPRNApol的轉錄起始都需要RNApolⅠ的轉錄起始過程中,TBP是SL1的組份，起定位RNApolⅠ的作RNApolⅡ的轉錄起始由TBP識別TATARNApolⅢ的轉錄起始過程中,TBP起定位RNApol TBP起定位作用,所以又稱定位因子 Transcription1、起始時，σ因子有利于ββDNA專一性結合所要求的構起始后,σ因子解離,ββ’2、Euk.多種輔助因子的共同作用來保證這一轉變二、延伸過程RNANTP不斷加到RNA3’-OH★形成一個磷酸二酯鍵后，酶向前滑?1RNApol結合和轉錄的DNA模板區(qū)域，有17bp胰臟RNAase——其長度10bp（確2 拓撲學問RNApolRNApol…..DNAΦ超纏問題的解決靠DNA旋轉酶ΦRNA-DNA3RNA30~50個核苷酸／秒,與蛋白質的合成速度相近（15模板DNA中G／C（G／C8~10）轉錄的終止 RNAProk.和Euk.都具有－－一種表達調控了解很少（3’末端） 發(fā)夾結 2RNApolⅢ的終止子類似原核生物（發(fā)夾結構U串且保守性很強（酵母→人1、真核生物RNApol：3、RNApolI第6章RNA細菌的轉轉錄后的加工(posttranscriptional是指將各種前體RNA分子加工成成各種RNA。加工（processing）有三種形式表6-10RNA加工反應的分類一.原核的tRNArRNA的加工tRNArRNAtRNA①串聯(lián)的tRNA分子都是相同的，如在27’的tRNATyr-少數(shù)的tRNA前體為單順反子圖6tRNA去尾，形成3’-OH末端；RNaseF，RNaseD(4tu),D臂的2甲基鳥苷(2mG)，TψC臂的假尿苷(ψ)和反子環(huán)上的2異戊腺苷(2ipA)圖6-三種tRNA前體的剪切圖6tRNArRNA在E.coli中rRNA有7個轉錄單位,名為rrnA-rRNA序列是保守的,每個轉錄單位都含有等比例的16S、23S、5SRNA及一個或幾個tRNA每個轉錄單位轉錄成單個的RNA前體分子，經(jīng)剪切后變成為成RNA的分子rRNA前體的加工是由RNase(一)tRNA真核tRNA的和原核不同 簇排列，間有間隔區(qū) 真核tRNA一般都比原核tRNA得多，如酵母約有400個tRNA③)都要加CCA酵母tRNA在未處理前先進行凝膠電泳，結果只顯示一條帶，且跑得較慢，表明此為tRNA圖6-酵母tRNA在體外的剪切真核tRNA內含子切除的特點 沒有交界序列，也沒有內部引導序列；酵母tRNA前體內含子3’和5’端的剪切是由內切酶的不同亞基催化的。亞基Sen34,真核tRNA的加工和原核的區(qū) 真核tRNA 真核生物的18S，5.8S和28SrRNA 體，5SRNA是和它們分開轉錄的，這和原核的rRNA不同。切除5′端的前導序列,即外部的轉錄間隔序列轉錄間隔序列（ITS），產(chǎn)物分別為20S（含18SrRN段）和32S。mRNA個單個的多順反子mRNA，然后經(jīng)RNaseⅢ將其切開，四個兩兩分開，最后再各自進行E.coli90’/100’T7噬菌體早期區(qū)轉錄單條前體RNA，經(jīng)RNaseⅢ剪切成5條成RNaseⅢ在T7莖環(huán)上的典型切割位點(GENESVIFig 、真核mRNA前體的加(一)核內不均一RNA（heterogenousnuclear 3′端有poly（A）尾巴； (4) 莖環(huán)結構，可能分布于編碼區(qū)（非重復序列）的兩側；15′23′3如呼腸，如皰 在末端鳥苷的第7位上存在單個甲基化位點的稱O型帽子在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位點上還有一個甲基位點的稱1型帽子(cap此外，在第三個核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位點的稱2型帽子（cap2）這三種帽子都有特殊面對面核苷酸結構（confrontdenucleotidestructure）。圖mRNA53’端約長200bp(大多數(shù)Euk.的mRNA) 最近研究發(fā)現(xiàn)，原核生物的RNA轉錄后也有3’添加poly(A)E.coli的poly(A)聚合酶早 年就已發(fā)poly(A)與mRNA的有b、胚胎發(fā)育中，poly(A)mRNA（非poly(A)cpoly(A)mRNApoly(A)剪切因子(CF)AAUAAA下游11－30nt二．I類內含子的剪接1、RNA拼接（RNA 5’拼接點或左拼接點（內元上游1982Davies 結構（centralcorestructure）:在有些內元中，含有4個重復的保守序列，長度為10~20bp，4個保守序列構成一種二級結構，在拼接中起重要作用 ★Ⅰ類內元（groupⅠ）:含有中部結構的細胞器核★Ⅱ類內元（groupⅡ）:不含有中部結構的細胞器線粒體核★Ⅲ類內元（groupⅢ）:具有GU－AG特征的邊界序列，核mRNA前★tRNA的內元均位于tRNA的