早期給予黃芪注射液治療大鼠腦出血對血腫周圍胞凋亡的影響

早期給予黃芪注射液治療大鼠腦出血對血腫周圍胞凋亡的影響【摘要】目的探討大鼠實(shí)驗(yàn)性腦出血后早期給予黃芪注射液對血腫周圍細(xì)胞凋亡及細(xì)胞凋亡因子Caspase-3的影響。方法將腦出血模型大鼠隨機(jī)分成4個治療組和1個出血對照組。各治療組每日給予腹腔注射黃芪注射液1次。然后各組分別于不同時期處死，取腦，連續(xù)切片作TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色。觀察不同時間給藥后對大鼠神經(jīng)功能缺損、血腫周圍細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3指標(biāo)的影響。結(jié)果各治療組血腫周圍細(xì)胞凋亡率、Caspase-3蛋白表達(dá)均明顯降低，各治療組的神經(jīng)功能評分較對照組明顯改善，其中手術(shù)同時治療組和術(shù)后6h治療組與術(shù)后12h治療組、術(shù)后24h治療組比較上述各項(xiàng)觀察指標(biāo)差異有顯著性。結(jié)論早期應(yīng)用黃芪注射液治療大鼠腦出血能夠顯著降低血腫周圍區(qū)域的細(xì)胞凋亡率和Caspase-3蛋白表達(dá)率。

【關(guān)鍵詞】腦出血；黃芪注射液；細(xì)胞凋亡；大鼠

Theeffectofastragaluspropinqunsinjectiononcellapoptosisaroundthehematomaintheearlytimeaftertheexperimentalintracerebralhemorrhageinrats

【Abstract】ObjectiveTostudytheeffectofastragaluspropinqunsinjectiononapoptoticcellandcaspase-3proteinintheearlytimeaftertheexperimentalintracerebralhemorrhageinrats.MethodsAlltheICHratsabouttheexperimentwererandomlydividedintotheremedialgroupinjectingastragaluspropinqunsandthegroupwithoutinjection.Thentheremedialgroupofratsweredividedintofourgroupswhichweretheinstantlytreatedgroup，the6hourstreatedgroup，the12hourstreatedgroupandthe24hourstreatedgroup.Theremedialgroupswereinjectedwithastragaluspropinqunsinjectiononceaday.AfterthatallICHratswerekilledondifferentdaystotakeouttheirbraininwhichtheimmunohistochemicalmethodwasperformedbyusingtheantibodyofcaspase-3proteinandTUNELmethodwasusedtodetectapoptosisaroundthehematomainthebrain.Toobservetheeffectofastragaluspropinqunsinjectionindifferenttimeontheneurologicaldysfunction，caspse-3proteinexpressionandcellapoptosisaroundthehematomaoftheComparedwiththehemorrhagegroup，theapoptoticrateandthepositivecellsofcaspase-3proteinintheremedialgroupsweresignificantlydecreased()andneurologicaldysfunctionsweresignificantlyimproved.Theapoptoticrateoftheinstantlytreatedgroupand6hourslatertreatedgroupdecreasedsignificantlycomparedwiththatofthe24hourslatertreatedgroup().ConclusionWhenastragaluspropinqunsinjectionwasusedearliertocureICH，itcandecreasetherateofcellapoptosisandcaspase-3proteinexpressionaroundthehematomasignificantly.

【Keywords】brainhemorrhage;astragaluspropinqunsinjection;cellapoptosis;

腦出血是一種嚴(yán)重危害人類生命健康的臨床常見病和多發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計，在我國，腦出血占急性腦血管病的40%～50%，是腦卒中死亡率最高的臨床類型，腦出血后30天內(nèi)病死率接近50%，許多存活者遺留明顯的神經(jīng)功能缺失［1］。目前對高血壓腦出血的治療方法雖較以往有很大進(jìn)步，如超早期手術(shù)、微創(chuàng)技術(shù)清除血腫和綜合治療等［2］，但由于影響腦出血療效的因素是多方面的，腦出血仍具有相當(dāng)高的死亡率。近年來，有人嘗試采用活血化瘀藥黃芪治療急性期的腦出血，取得了一定的效果［3］，但目前對于該藥治療腦出血的時機(jī)和機(jī)制問題尚不清楚?；诖藛栴}，本實(shí)驗(yàn)欲在不同時間給予黃芪注射液，采用TUNEL染色和Caspase-3免疫組化染色的方法，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損、血腫周圍細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3指標(biāo)，以期達(dá)到早期應(yīng)用黃芪治療腦出血后觀察其療效的目的。

1材料與方法

材料

動物SD大鼠雌雄不限200只，體重300～350g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物合格證號。

主要試劑黃芪注射液(哈爾濱圣泰制藥有限公司，批號Z23020820)；Ⅶ型膠原酶(sigma公司)；TUNEL熒光檢測試劑盒，Caspase-3多克隆抗體，DAB染色試劑盒。

方法

動物分組將大鼠隨機(jī)分成4個治療組：手術(shù)同時治療組、術(shù)后6h治療組、術(shù)后12h治療組、術(shù)后24h治療組和1個出血對照組。各治療組每日給予腹腔注射黃芪注射液1次，劑量為8ml/，出血對照組不予治療。每日進(jìn)行神經(jīng)功能評分1次，治療組分別于第4天和7天處死。

腦出血大鼠模型制作根據(jù)腦立體定位圖譜于大鼠前囟后㎜，中線右側(cè)旁開㎜鉆孔，暴露硬腦膜。微量進(jìn)樣器吸取μg/μlⅦ型膠原酶μl，以硬腦膜平面為零點(diǎn)，緩慢進(jìn)針，深度為㎜，緩慢注入藥物，注射完畢后留針10min，緩慢退出微量進(jìn)樣器，清潔傷口，縫合頭皮，術(shù)后保溫。

免疫組織化學(xué)染色石蠟切片，采用ABC法，DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察。在200倍視野下，隨機(jī)觀察并計數(shù)血腫周邊3個不重復(fù)視野的Caspase-3蛋白免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目。

細(xì)胞凋亡的檢測取與免疫組化染色相鄰切片，用末端脫氧核糖核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)。在暗室內(nèi)熒光顯微鏡下觀片，在200倍視野下，隨機(jī)觀察并計數(shù)血腫周邊3個不重復(fù)視野的TUNEL反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)目。

結(jié)果分析結(jié)果用x±s表示。統(tǒng)計學(xué)處理采用軟件包進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析，顯著性水準(zhǔn)均為α=。

2結(jié)果

大鼠神經(jīng)功能缺損評分麻醉蘇醒后，兩組動物均出現(xiàn)不同程度神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)，根據(jù)Berderson評分標(biāo)準(zhǔn)對術(shù)后各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，各組評分情況見表1，神經(jīng)功能變化情況見圖1。表1腦出血后各時相點(diǎn)神經(jīng)功能評分注：*，VSICHgroup

TUNEL熒光染色TUNEL熒光染色陽性細(xì)胞是核周染色質(zhì)濃縮呈明亮點(diǎn)狀的黃綠色細(xì)胞。ICH各組、各時間點(diǎn)凋亡細(xì)胞表達(dá)情況見表2。表2各組血腫周圍區(qū)TUNEL陽性表達(dá)情況注：*，VSICHgroup;★，VSinstantlytreatedgroup;△，VS12hgroup;●，VSinstantlytreatedand6hgroup

Caspase-3免疫組化染色Caspase-3染色陽性的神經(jīng)細(xì)胞，胞漿呈棕黃色，高倍鏡下觀察Caspase-3表達(dá)顯色深的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較為正常，細(xì)胞核尚完整。各治療組均比出血對照組明顯降低()，見表3。表3各組血腫周圍區(qū)Caspase-3蛋白表達(dá)情況注：*，VSICHgroup;★，VS6hgroup;△，VS6hgroup;●，VSinstantlytreatedgroup

3討論

腦出血是一種發(fā)病率、病死率和致殘率均較高的臨床常見病和多發(fā)病，迄今為止對腦出血的治療雖較以往有很大進(jìn)步，但腦出血急性期仍無肯定、有效的治療方法，腦出血仍具有相當(dāng)高的死亡率［2］。有文獻(xiàn)報道臨床應(yīng)用益氣消腫藥黃芪治療急性期腦出血患者，取得了一定的效果［3］，但目前對于該藥治療腦出血的時機(jī)問題尚不清楚。

近幾年在腦出血的機(jī)制方面的研究取得了一定的進(jìn)展；文獻(xiàn)表明，腦出血后血腫周圍腦組織血流量下降，相對于嚴(yán)重缺血性卒中而言屬于輕中度腦缺血，輕微腦缺血伴隨著大量激活的細(xì)胞因子外滲所導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡，是腦出血后細(xì)胞死亡主要途徑之一［4］。

細(xì)胞凋亡是一個多步驟發(fā)生的受多基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡，在很大程度上依賴天冬氨酸特異性半胱氨蛋白酶(cysteinylaspartate-specificprotease，caspase)家族的激活。其中caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡中的關(guān)鍵酶，在細(xì)胞凋亡分子機(jī)制網(wǎng)絡(luò)中居核心地位［5］。Nicholson等［6］研究發(fā)現(xiàn)敲除Caspase-3基因，大鼠神經(jīng)系統(tǒng)及大腦發(fā)育過程中的程序性死亡被干擾，出現(xiàn)細(xì)胞增生發(fā)育失控。此結(jié)果表明Caspase-3在大腦細(xì)胞凋亡中起重要作用。本研究應(yīng)用相鄰切片分別進(jìn)行Caspase-3免疫組化和TUNEL熒光染色，兩者陽性細(xì)胞范圍及時間變化基本一致。說明caspase-3在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)控作用。

腦出血后腦內(nèi)血腫，中醫(yī)認(rèn)為離經(jīng)之血，即為瘀血，治法也應(yīng)活血化瘀。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為血瘀是中風(fēng)的本質(zhì)，活血化瘀是治療中風(fēng)的根本大法，但在治療時機(jī)上存在較大爭議。有學(xué)者認(rèn)為活血化瘀不論在早期先驅(qū)癥狀、發(fā)作期，還是恢復(fù)期均可應(yīng)用。特別提出，在急性腦血管疾病中，控制出血，不是采取止血方法，而是應(yīng)用活血止血、化瘀止血、理氣止血等法。

黃芪為傳統(tǒng)的益氣利水中藥之一，含有豐富氨基酸，微量元素硒、鐵、鋅及黃酮、黃酮類似物、黃芪皂苷類和黃芪多糖等多種成分。據(jù)報道黃芪具有提高細(xì)胞免疫和體液免疫功能［7］，抗脂質(zhì)過氧化、降低自由基生成或增加自由基清除、抗氧化及穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加組織細(xì)胞抗缺血缺氧能力［8，9］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明：實(shí)驗(yàn)性ICH后使用黃芪注射液治療有效。6h治療組和12h治療組治療效果優(yōu)于其他組。從行為學(xué)表現(xiàn)來看，在術(shù)后12h、24h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，出血同時治療組神經(jīng)功能缺失癥狀明顯輕于對照組，術(shù)后4天評分發(fā)現(xiàn)出血同時治療組和6h治療組神經(jīng)功能明顯好于出血對照組。從TUNEL陽性表達(dá)情況來看，各治療組凋亡率低于出血對照組，出血后第4天時間點(diǎn)上6h治療組與出血同時治療組差異無顯著性，但6h組凋亡率明顯低于24h組，12h組與24h組比較差異無顯著性。在7天時間點(diǎn)上，手術(shù)同時治療組和術(shù)后6h治療組凋亡率都顯著低于24h組。從各組Caspase-3蛋白表達(dá)情況來看，各治療組均比出血組明顯降低，其中手術(shù)同時治療組和術(shù)后6h治療組都比24h治療組明顯降低，6h治療組比12h治療組陽性表達(dá)明顯降低。綜上所述，黃芪注射液治療實(shí)驗(yàn)性大鼠腦出血可明顯減少血腫周圍的細(xì)胞凋亡率，特別是6h內(nèi)用藥效果優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組。

【參考文獻(xiàn)】

1王永炎，劉柄林.中風(fēng)病研究述評.中國中醫(yī)急癥，1995，4(2):51-55.

2PrasadK，BrowmanG，SrivastavaA，etinprimarysupratentorialintracerebralhematoma:ameta-analysisofrandomizedActaNeurolScand，1997，95:103-110.

3楊麗陽，曾凱軍，王致道.黃芪注射液治療腦出血臨床觀察.中國中醫(yī)急癥，2002，11(6)：461.

4KohjiM，WeiM，XiaoringW，etal.EvidenceforapoptosisafterintracerebralhemorrhageinratCerebBloodFlowMetab，2000，20(2)：396-404.

5金伯泉.細(xì)胞和分子免疫學(xué)，第二版.北京：科學(xué)出版社，200