高級動物生物化學蛋白質(zhì)的分離純化

1一、別離純化的意義①從生物材料中別離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對于了解生命活動的規(guī)律，說明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。②工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。③醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。④基因工程的需要2二、別離純化的要求1、純度：主要取決于研究的目的和應用上的要求。如作為研究蛋白和一級結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級結(jié)構(gòu)與功能的關系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標準蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應用的酶和蛋白質(zhì)制劑，到達一定純度即可，不要求均一。2、活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。3、收率：希望收率越高越好，但在別離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大。3三、別離純化的一般程序蛋白質(zhì)分子的別離純化一般可分為以下幾個階段：①材料的選擇和預處理②破碎細胞及提取〔有時還需要進行細胞器的別離〕③別離純化：包括粗分級別離和細分級別離其中前兩個階段為別離純化的前處理。4第二節(jié)蛋白質(zhì)別離純化的前處理一、材料的選擇與預處理選擇材料主要根據(jù)實驗目的而定。工業(yè)生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡單、本錢低的動植物組織或微生物做原料。科研選材那么無需考慮上述問題，只要能到達實驗目的即可。實驗材料選定后，常常需要進行預處理，如動物材料需要除去一些與實驗無關的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子需要除殼；微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。假設不立即進行實驗或加工，應冷凍保存。5二、細胞的破碎別離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應選擇適當?shù)姆椒▽⒔M織和細胞破碎。但假設材料是體液〔如血〕或生物體分泌到體外的分泌物，那么不必進行組織細胞的破碎。6組織細胞的破碎方法很多，不同的實驗規(guī)模，不同的實驗材料和實驗要求，使用的破碎方法和條件也不同。一般動物組織和細胞可用電動搗碎機或勻漿器破碎或用超聲波處理破碎。植物組織和細胞由于具有纖維素、半纖維素和果膠等物質(zhì)組成的細胞壁，一般常用與石英砂和適當?shù)奶崛∫阂黄鹧心サ姆椒ㄆ扑榛蛴美w維素酶處理也能到達目的。細菌細胞的破碎比較困難，因為整個細菌細胞壁的骨架實際上是一借共價鍵連接而成的肽聚糖囊狀大分子，非常堅韌。破碎的方法常有超聲波震蕩、與石英砂研磨、高壓擠壓或溶菌酶處理〔以分解肽聚糖〕。7三、細胞器的別離細胞器包括細胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細胞還有葉綠體。如果要別離制備分布在這些細胞器中的生物大分子，為了防止其他細胞組分中的物質(zhì)對制備物的干擾或污染，還需先將細胞器別離出來，然后在某一細胞器中別離某一物質(zhì)。細胞器的別離一般采用差速離心法，即將破碎后的細胞在適當?shù)慕橘|(zhì)中進行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)屢次分步離心后，即可獲得所需組分。8四、提取組織細胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，防止因長久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。91、蛋白質(zhì)的提取大多數(shù)蛋白質(zhì)均能溶于水、稀鹽、稀堿或稀酸溶液中，故蛋白質(zhì)的提取一般以水溶液提取為主。通常采用類似生理條件下的緩沖液，如20-50mmol/L的磷酸鹽緩沖液〔pH7.0-7.5〕或0.1mol/LTris-HCl〔pH7.5-8.0〕緩沖液作提取液。對于一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性較多的蛋白質(zhì)，不溶于水、稀鹽、稀堿、稀酸，常在提取液中參加適量的有機溶劑，如乙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇等。10第三節(jié)別離純化從細胞中提取得到的蛋白質(zhì)往往是不純的，含有大量雜質(zhì)，必須進一步別離純化，這一階段可分為粗分級別離和細分級別離兩步進行。11一、蛋白質(zhì)的別離純化蛋白質(zhì)別離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。性質(zhì)方法分子大小透析、超濾、密度梯度離心、凝膠過濾溶解度等電點沉淀、鹽析、有機溶劑沉淀電荷電泳、離子交換層析吸附性質(zhì)吸附層析〔羥基磷灰石層析、疏水作用層析〕對配體分子親和層析的生物親和力12主要是利用鹽析法、等電點沉淀、有機溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開，這些方法的特點是簡便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)，但分辨率低。1、粗分級別離13〔1〕鹽析向蛋白質(zhì)溶液中參加大量的中性鹽[〔NH4)2SO4，Na2SO4]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀，這種現(xiàn)象稱為鹽析。鹽析作用是由于當鹽濃度較高時，鹽離子與水分子作用，使水的活度降低，原來溶液中大局部的自由水轉(zhuǎn)變?yōu)辂}離子的水化水，從而降低蛋白質(zhì)極性基團與水分子之間的作用，破壞蛋白質(zhì)分子外表的水化層，使蛋白聚集沉淀。同時鹽離子可以中和蛋白質(zhì)的外表電荷，也促進蛋白的沉淀。14不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子外表的極性基團的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。如：血清球蛋白清蛋白(NH4)2SO450%飽和度100%飽和析出析出分段鹽析1516〔2〕等電點沉淀蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，其溶解度與其凈電荷數(shù)量有關，隨溶液pH變化而變化。在溶液pH值等于蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的溶解度最小。不同的蛋白質(zhì)有不同的等電點，因此通過調(diào)節(jié)溶液pH到目的蛋白的等電點，可使之沉淀而與其它蛋白質(zhì)分開，從而除去大量雜蛋白。17〔3〕有機溶劑法與水互溶的極性有機溶劑如甲醇、乙醇、丙酮等能使蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低。有機溶劑引起蛋白質(zhì)變性的原因有兩個：降低水的介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)分子外表可解離基團的離子化程度減弱，水化程度降低，促進了蛋白質(zhì)分子的聚集沉淀。是極性有機溶劑與蛋白質(zhì)爭奪水化水，而使蛋白質(zhì)分子沉淀。18室溫下，這些有機溶劑不僅能使蛋白質(zhì)沉淀，而且伴隨著變性。假設預先將有機溶劑冷卻，然后在不斷攪拌下將其逐漸參加蛋白質(zhì)溶液中，防止有機溶劑局部濃度過高，那么在很大程度上解決變性問題。不同的蛋白質(zhì)由于水化層厚度不同，發(fā)生沉淀需要的有機溶劑濃度不同，因此可利用不同濃度的有機溶劑別離不同的蛋白質(zhì)。192、細分級別離一般蛋白質(zhì)樣品經(jīng)粗制分級后，體積較小，雜質(zhì)大局部被除去。進一步提純，通常使用高分辨率的柱層析及電泳方法。常用的柱層析方法有分子篩層析、離子交換層析、疏水吸附層析、親和層析。常用的電泳方法有聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電聚焦電泳。另外，結(jié)晶也是蛋白質(zhì)別離純化的方法之一，制備的結(jié)晶物常常作為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析之用。20酶的活力測定在酶的制備過程中，每一步驟都應測定留用以及準備棄去局部中所含酶的總活力和比活力，以了解經(jīng)過某一步驟后酶的回收率、純化倍數(shù)，從而決定這一步的取舍?？偦盍?活力單位/ml酶液×總體積〔ml〕比活力=總活力單位數(shù)/總蛋白〔氮〕mg純化倍數(shù)=每次比活力/第一次比活力回收率〔產(chǎn)率〕=〔每次總活力/第一次總活力〕×100%21第三節(jié)純度鑒定生物大分子經(jīng)過別離提純，最后還要鑒定制品的純度。蛋白質(zhì)和酶制品純度鑒定通常采用的方法有：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法、等電聚焦電泳法、超速離心沉降分析法、免疫化學法、N-末端氨基酸分析法等。純的蛋白質(zhì)在一定條件下進行電泳，將以單一的速度移動，它的電泳圖譜只出現(xiàn)一條帶。同樣純的蛋白質(zhì)在離心場中，應以單一的沉降速度移動。選用任何單獨一種鑒定方法都不能最后確定蛋白質(zhì)的純度，必須同時采用2-3種不同的方法才能確定。22第四節(jié)蛋白質(zhì)的層析別離應用廣泛。特征：有一個固定相和一個流動相。由于待別離的各種物質(zhì)在這兩個相分配系數(shù)不同，當兩個相作相對運動時，這些物質(zhì)在兩相間反復屢次分配，結(jié)果使其相互分開。根據(jù)兩相的狀態(tài)，層析法可分為：氣相層析和液相層析；按層析原理可分為：吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析和親和層析等。按操作形式分為：柱層析、薄層層析、紙層析等。2324分配系數(shù):k=Cs/Cm,物質(zhì)在固定相與流動相濃度之比。質(zhì)量分配系數(shù)：D=k×Vs/Vm,

Vs,Vm為固定相和流動相的體積。一、層析的一般原理3216168816812412412228如果柱頂參加32mg樣品，樣品的質(zhì)量分配系數(shù)D為1，即樣品在兩相中是等量分配。經(jīng)過5層的平衡分配后，樣品在柱的分配情況見圖。樣品集中在中間。如果D<1，樣品集中在中間偏上；如果D>1，樣品集中在中間偏下。25

離子交換層析(IEX)是根據(jù)電荷來別離分子的。離子交換劑是通過化學反響將解離基團引入到惰性支持物上形成的。分為：陽離子交換劑:解離基團帶負電,結(jié)合陽離子;陰離子交換劑:解離基團帶正電,結(jié)合陰離。蛋白質(zhì)分子是兩性物質(zhì)。當pH〉pI，分子帶負電，可結(jié)合陰離子交換劑；當pH<pI，分子帶正電，可結(jié)合陽離子交換劑。如陽離子交換劑與帶正電蛋白質(zhì)分子之間有如下平衡：二、離子交換層析〔一〕根本原理26帶電蛋白質(zhì)分子與交換劑的結(jié)合是可逆的。由于pH可改變蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和帶電量，鹽離子會影響蛋白質(zhì)在交換劑上吸附。所以用一定濃度的鹽溶液或一定pH的緩沖液就可把蛋白質(zhì)從離子交換劑上洗脫下來。對多組分混合物，每種分子所帶的電荷不同，因此，可用不同的離子強度或不同的pH溶液將蛋白質(zhì)從交換劑上一一洗脫下來。27〔二〕離子交換劑的根本類型根據(jù)可供交換的離子的性質(zhì)，離子交換劑可被分為陽離子交換劑和陰離子交換劑。假設按酸堿性的強弱，又可分為強酸、強堿、弱酸、弱堿幾種類型的離子交換劑。強酸和強堿型交換劑能在較廣泛的pH范圍內(nèi)〔pH2—12〕完全解離。弱酸型交換劑在低于pH4、弱堿型交換劑在高于pH9就難于解離，因而失去交換能力。因為一般蛋白質(zhì)在pH6—8之間穩(wěn)定，所以常用弱酸或弱堿型交換劑。28離子交換基團的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)類型名稱結(jié)構(gòu)式性質(zhì)DEAE二乙基氨基乙基(diethylaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)2弱堿性QAE季胺乙基(quaternaryaminoethyl)-O-CH2-CH2-N+-(C2H5)3強堿性Q季胺(quaternaryamine)-CH2-N+-(CH3)3強堿性CM羧甲基(carboxymehyl)-O-CH2-COO-弱酸性SE磺乙基(sulfoethyl)-O-CH2CH2-SO3-強酸性SP磺丙基(sulfopropyl)-O-CH2-CH2-CH2-SO3-強酸性P磷酸基(phosphate)-O-PO3-中酸性S磺酸基(sulfonate)-CH2-SO3-強酸性29可用來作為交換劑支持物的物質(zhì)種類較多。早期用于別離氨基酸、小肽和其它小分子物質(zhì)的離子交換樹脂的支持物是聚苯乙烯類。別離蛋白質(zhì)的常用的親水性支持物。有三大類：纖維素、葡聚糖凝膠(sephadex)、瓊脂糖凝膠(sepharose)和合成凝膠(Trisacryl和Fractogel)。1、離子交換纖維素離子交換纖維素是以纖維素做支持介質(zhì)的。具有松散的親水性網(wǎng)絡，較大的外表積，吸附容量大，通透性好。根據(jù)離子交換纖維素所含離子交換基團的性質(zhì)可分為強酸、強堿型和弱酸、弱堿型?，F(xiàn)將常用的離子交換纖維素列于下表中。30常用的離子交換纖維素離子類型解離基團特點DEAE-—O—CH2—CH2—N+(C2H5)—

在pH<8.6應用31陰離子解離基團交換摩爾(mmol/g)

特點DEAE—O—CH2—CH2—N(C2H5)0.1～1.1

在pH<8.6應用AE——O—CH2—CH2NH20.3～1.0

TEAE—O—CH2—CH2—N(C2H5)30.5～1.0

堿性較強

GE—

0.2～0.5

強堿性在極高的pH仍可應用PAB—0.2～0.5

ECTEOLA三乙醇胺通過甘油基和多聚甘油基鏈連接到纖維素上，混合基團0.1～0.5

弱堿性適于分離核酸常用的離子交換纖維素3233在Sephadex上接上某種離子交換基團。這種凝膠既有離子交換劑的性質(zhì)，又有分子篩效應。因此，其別離能力比單純的層析凝膠或離子交換劑好。葡聚糖凝膠離子交換劑的交換量比相應的纖維素離子交換劑大，如DEAE—Sephadex的交換量大約是DEAE—纖維素的～倍。2、離子交換葡聚糖凝膠〔Sephadex〕34葡聚糖凝膠離子交換劑的性質(zhì)35-O-C2H4N+(C2H5)236將各種離子基團引入到交聯(lián)瓊脂糖(SpeharoseCL)和大孔合成凝膠(Trisacryl或Fractogel)上，那么形成一系列離子交換劑。這類交換劑即堅硬、吸附容量大，形狀球形，能維持較好的流速及分辨率。3、交聯(lián)凝膠離子交換劑37〔三〕層析條件的選擇1、離子交換劑的選擇選擇離子交換劑之前要了解樣品的性質(zhì)：熱穩(wěn)定性、帶電情況、pH和鹽濃度對其活性和溶解度的影響。一般情況下，帶負電的物質(zhì)用陰離子交換劑，反之，那么用陽離子交換劑。實驗室中最廣泛使用的是DEAE—和CM—交換劑。2、交換顆粒大小的選擇粒子大小主要影響分辨率和流速。①粗粒子：交換容量小、間隙大、分辨率底、流速較快。②細粒子：分辨力高、交換容量大但是流速慢。383、層析緩沖液的選擇選擇正確的緩沖液可獲得較好的層析效果。因為離子相互作用取決于pH，而維持介質(zhì)的pH，通常是由緩沖液來實現(xiàn)的。所用緩沖液的種類、pH大小，決定待別離組分的穩(wěn)定性和溶解度。為防止緩沖液的離子參與離子交換過程，采用緩沖液所帶的電荷應與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽離子交換劑時，要用陰離子型緩沖液〔磷酸、醋酸等〕；使用陰離子交換劑時要用陽離子型緩沖液〔Tris、胺鹽、吡啶等〕。39要得到好的別離效果，層析時要注意層析柱的高度和體積；上樣量的大??；洗脫液體積；洗脫速度；分級物的收集量。1、柱床體積：至少要比結(jié)合所有樣品所需要的要大2—5倍。離子交換層析所用的柱不用太長，以便縮短操作時間。2、樣品pH和離子強度：與起始緩沖液具有相同的pH和離子強度。3、洗脫液體積和洗脫梯度的形狀：對柱的分辨率影響很大。洗脫可用恒定組成的緩沖液來完成〔簡單洗脫〕也可用改變pH或鹽濃度，或二者均改變的洗脫液來完成。pH和鹽濃度的改變又分為連續(xù)改變〔梯度洗脫〕和不連續(xù)改變〔階段洗脫〕?！菜摹持鶎游黾夹g(shù)40交換劑的處理就是將交換劑轉(zhuǎn)變?yōu)檫m合別離目的的離子類型。一般包括除雜質(zhì)、溶脹，除細粒和改型。改型就是用適當?shù)碾x子平衡，使交換劑帶上希望的離子。陽離子和陰離子交換劑最后分別為Na和Cl型是最穩(wěn)定形式。4、洗脫速度：太快或太慢都會降低柱的分辨率。5、分級物收集量：關系到能否充分代表層析柱的分辨率。一般總洗脫體積在500—2000ml時，每管收集5—10ml〔五〕離子交換劑的處理和再生離子交換劑價格較貴，用后再經(jīng)過再生處理，可反復屢次使用。處理時防止用強酸或強堿長時間浸泡，以防載體的糖鏈結(jié)構(gòu)遭水解破壞。41各類離子交換劑的再生條件42血清蛋白常用離子交換層析別離。IgG可用QAE—SephadexA—50或DEAE—SephadexA—50別離。現(xiàn)在臨床上有重要用途的許多血清蛋白，如白蛋白，factorIX復合物和專一性免疫球蛋白已用離子交換層析大規(guī)模生產(chǎn)?！擦畴x子交換層系的應用實例43凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于別離分子大小不同的生物大分子及測定其分子量。凝膠層析設備簡單，操作簡便，每次層析后無需再生處理，因此，在生化