實(shí)驗(yàn)：分離以尿素為氮源的微生物

實(shí)驗(yàn)2分離以尿素為氮源的微生物思考：采用什么方法從土壤中分離出以尿素為氮源的微生物？如何判斷分離出的細(xì)菌確實(shí)能將尿素分解？一.實(shí)驗(yàn)原理

尿素NH3

中性堿性

酚紅顏色：

(酸性)黃色

紅色(變色范圍

pH6.4-8.2)二.實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖褂靡阅蛩貫槲ㄒ坏吹呐囵B(yǎng)基分離細(xì)菌(有脲酶)通過(guò)指示劑（酚紅）顏色的變化檢知培養(yǎng)基pH的變化(脲酶催化的化學(xué)反應(yīng))以尿素為氮源的微生物培養(yǎng)一段時(shí)間后，由于細(xì)菌產(chǎn)生的脲酶向周?chē)鷶U(kuò)散，將培養(yǎng)基中尿素的分解，產(chǎn)生的NH3使培養(yǎng)基的pH由原來(lái)的中性變?yōu)閴A性，于是培養(yǎng)基中的酚紅變成紅色，菌落的周?chē)鷷?huì)產(chǎn)生紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶愈大，表明這種菌利用尿素的能力愈強(qiáng)。三.實(shí)驗(yàn)步驟２.倒平板３.制備一定濃度梯度的細(xì)菌懸液１g土壤＋９９ml無(wú)菌水，振蕩，為１０-2稀釋液，依次制備１０-3、１０-4、１０-5的土壤稀釋液。４.稀釋涂布分離法分離細(xì)菌１.制備無(wú)菌的全營(yíng)養(yǎng)ＬＢ固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基５.培養(yǎng)觀察（倒置，37℃24-48h）（無(wú)菌，0.1ml，玻璃刮刀）1、配制培養(yǎng)基尿素培養(yǎng)基葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g

瓊脂糖0.5g

酚紅0.25g

尿素

10mlLB培養(yǎng)基蛋白胨：0.25g酵母提取液：0.12gNaCl：0.25g

瓊脂糖：0.5g

對(duì)照組選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組為什么用瓊脂糖代替瓊脂？怎么獲得無(wú)菌的尿素溶液？

瓊脂和瓊脂糖瓊脂是一種未被純化的混合物，主要成分為瓊脂糖和瓊脂果膠，還含有少量的含氮化合物，及其它有機(jī)雜質(zhì)和不溶性雜質(zhì)。瓊脂作為微生物固體培養(yǎng)基不可缺少的組成成分，其優(yōu)點(diǎn)是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培養(yǎng)基固化；③不影響培養(yǎng)基中其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被細(xì)菌吸收。實(shí)驗(yàn)是用瓊脂糖代替瓊脂作為微生物培養(yǎng)基的固化劑，其目的是：盡可能使培養(yǎng)基中只含尿素一種含氮化合物，以防止瓊脂中的含氮化合物被以非尿素為氮源的細(xì)菌利用，有利于對(duì)這類(lèi)細(xì)菌的篩選。思考？選擇培養(yǎng)基加入青霉素的培養(yǎng)基:

分離酵母菌、霉菌等真菌加入高濃度食鹽的培養(yǎng)基:

分離金黃色葡萄球菌不加氮源的無(wú)氮培養(yǎng)基:

分離固氮菌不加含碳有機(jī)物的無(wú)碳培養(yǎng)基:

分離自養(yǎng)型微生物加入青霉素等抗生素的培養(yǎng)基:

分離導(dǎo)入了目的基因的受體細(xì)胞——添加或缺少某種化學(xué)成分用于菌種的分離2、倒平板制備空白平板：取2個(gè)三角瓶，分別裝入已滅菌的全營(yíng)養(yǎng)LB固體培養(yǎng)基和尿素固體培養(yǎng)基，放在超凈工作臺(tái)上，冷卻至60℃左右時(shí)，在酒精燈旁把上述兩種培養(yǎng)基分別倒至培養(yǎng)皿中，輕輕搖勻，平放至凝固。2、倒平板在無(wú)菌條件下，在將1g土樣加到裝有99mL無(wú)菌水的三角瓶中，振蕩10min，即成10-2土壤稀釋液，并依次制備出10-3～10-5稀釋液。例如，若想制備10-3的稀釋液，可取0.5mL10-2的稀釋液。取樣時(shí)，盡量只取懸液，倒入有4.5mL無(wú)菌水的有蓋試管中，搖勻，放在試管架上。3、制備細(xì)菌懸液4、涂布分離涂布法分離細(xì)菌：在無(wú)菌條件下，分別取0.1mL的稀釋度為10-3、10-4和10-5的土壤稀釋液（細(xì)菌懸液），分別加到裝有全營(yíng)養(yǎng)LB培養(yǎng)基和尿素培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿（空白平板）中；再將保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精燈火焰上，待刮刀上火焰熄滅后，在酒精燈火焰旁打開(kāi)培養(yǎng)皿，將前面已加入的土壤稀釋液（細(xì)菌懸液）均勻涂布到整個(gè)平面上。接種取0.環(huán)1m敵l菌懸因液涂布稠分離按濃呈度捆釣成一配摞5、37奇℃恒溫重培養(yǎng)們箱饒倒置烏培養(yǎng)四1、為牲什么匹要用限瓊脂兄糖代摧替瓊膝脂配專(zhuān)置固雪體培尸養(yǎng)基因?yàn)榫抄傊魇俏幢缓屑兓幕旌⒑衔镒u(yù)，內(nèi)含一定成量的含氮蟻化合暖物。如劫果用圍瓊脂輛固化碎培養(yǎng)灘基，念會(huì)為百細(xì)菌喇提供燥一定胞量的段非尿紅素類(lèi)悅氮源辯，這顯樣會(huì)顏在尿訂素固醬體培哥養(yǎng)上認(rèn)產(chǎn)生撓大量艦以非具尿素房誠(chéng)為氮皺源的龍細(xì)菌牙，不胸利于鐵以尿裳素為劣氮源喇的細(xì)扭菌的超篩選貝，故如用純息化的朱瓊脂談糖而寇不用威瓊脂圣做固盡化劑思考踏題：2、有邁脲酶敏的細(xì)物菌在熱生態(tài)搶穩(wěn)態(tài)臣上起扶什么囑作用如果興土壤飾中有檢許多防尿素翁，在驗(yàn)自然菜界較聞高溫皂度下?tīng)斁蜁?huì)俯被水陡解，伴水解問(wèn)后的NH3會(huì)使噴土壤貧變成紹堿性圾，NH3與其皂他陰廣離子年物質(zhì)白如SO42－、CO32－、NO3－等形悠成化紀(jì)合物逝，則唯會(huì)使想土壤躍板結(jié)屆。有脲菌酶的標(biāo)細(xì)菌瞇使植袖物廢爪棄物萌和動(dòng)宵物尸吧體降絞解，檢并利識(shí)用了舌所形姜成的澆氨，進(jìn)有利偶于自師然界嗎中氮的防循環(huán)。3、有環(huán)脲酶并的細(xì)勺菌菌鈔落周燙圍為逃什么烤有著橫色的絡(luò)環(huán)帶務(wù)出現(xiàn)提。細(xì)菌同向胞虹外分巴泌脲稠酶，宴使培愚養(yǎng)基嬸中尿話(huà)素水蝴解，導(dǎo)水解酒后產(chǎn)直生氨趴，氨宏為堿碗性，揮酚紅刺在酸勒性環(huán)編境里懶呈黃便色，簡(jiǎn)堿性秋里呈遣紅色肚。培征養(yǎng)基乳中酸鄰堿指李示劑網(wǎng)產(chǎn)生止顏色沾變化揚(yáng)（變饑紅）躬，標(biāo)足志著蠶存在項(xiàng)脲酶模水解霞尿素衡的作臣用，肥從而激證明歉這一嶄菌株苦以尿板素為叔氮源邀。4、與兩全營(yíng)挑養(yǎng)培捐養(yǎng)基膜上的冤菌落斗數(shù)比派較，恢為什蔥么尿附素培岸養(yǎng)基重上只旦有少至數(shù)菌稈落因?yàn)閿∪珷I(yíng)制養(yǎng)培哨養(yǎng)基日中的么氮源研是蛋膜白胨梨，很竄多細(xì)棋菌都辮能利大