細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊

細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊實驗記錄24/2/2014一、細胞培養(yǎng)一、培養(yǎng)基的配制a.RPMI16401×（withL-glutamine）類培養(yǎng)基組分：RPMI，10%FBS（胎牛血清），雙抗生素（penicillin，盤尼西林（青霉素），streptomycin，鏈霉素）；配制方法：500mlRPMI(一瓶)+50mlFBS+5ml雙抗生素b.DMEM1×類培養(yǎng)基組分：DEMI，10%FBS，雙抗生素；配制方法：500mlDMEM(一瓶)+50mlFBS+5ml雙抗生素二、培養(yǎng)細胞RNA的提取1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2ml），吸出培養(yǎng)液；2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液指最高處打出）。重復(fù)以上操作一次。3.每孔中加1mlTrizol，吸出放-80℃冰箱冷凍。三、培養(yǎng)細胞DNA的提取1.從培養(yǎng)箱中拿出6孔板（每孔培養(yǎng)2ml），吸出培養(yǎng)液；2.PBS清洗；用大槍管吸取PBS加入每個培養(yǎng)孔中（槍頭不要觸碰培養(yǎng)板，防止交叉污染），用1ml槍吹勻清洗（把培養(yǎng)板傾斜，吸溶液至最高處打出）。重復(fù)以上操作一次。3.向培養(yǎng)板中加酶消化（時間較長，放進培養(yǎng)箱，看到有白色懸浮后取出），取出加DMEM類培養(yǎng)基；4.吸出至1.5ml離心管，3600rpm，4min離心；5.吸出上清（不要觸及沉淀），加PBS1ml清洗，3600rpm，4min離心；四、常用細胞系（人）名稱細胞類型來源核型培養(yǎng)液A431上皮型表皮細胞腫瘤非整倍體（76，XX）DMEM+10%FBSHeLa上皮樣宮頸癌非整倍體（81-83，XX）MEM+NEAA10%FBSHepG2上皮樣肝細胞癌非整倍體（55，XY）MEM+NEAA10%FBSMEM：極限必需培養(yǎng)液（Eagle）；NEAA：非必需氨基酸；DMEM：Dulbecco’sMEM改良培養(yǎng)液；RPMI：RoswellParkMemorial研究所；BrdU：5-溴脫氧尿苷；APRI：腺苷磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶實驗室除snu系列與國產(chǎn)7721用1640培養(yǎng)基，其它用DMEM培養(yǎng)基。五、原代培養(yǎng)----肝細胞1.切除乳鼠肝臟組織放進小燒杯中，用PBS或培養(yǎng)液漂洗2-3次，去除血污；2.加少量培養(yǎng)液，用剪子把組織剪碎，1平方mm左右，再用吸管吹打；3.加含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液，制成均勻的細胞懸液，移入培養(yǎng)瓶，將組織塊放在培養(yǎng)瓶底部，采用薄層營養(yǎng)液培養(yǎng)法，蓋上瓶蓋。4.換液，只將舊的培養(yǎng)液吸棄，換上新的培養(yǎng)基。六、傳代培養(yǎng)1.顯微鏡觀察是否需要傳代細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，當(dāng)前為第1頁。細胞生長良好：上清液清亮，無懸浮物，折光性好，均質(zhì)而透明，胞膜完整，胞內(nèi)顆粒少，無空泡和脂滴。細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，當(dāng)前為第1頁。細胞生長不良：懸浮物多，發(fā)差增大，胞膜不完整，胞質(zhì)中顆粒多，出現(xiàn)空泡和脂滴。2.貼壁細胞傳代①吸出瓶內(nèi)舊培養(yǎng)液；②用PBS輕緩漂洗細胞，兩遍，小皿，2ml，大皿，4ml，盡量棄去舊培養(yǎng)液（防止消化液被稀釋，造成效力下降）；③向培養(yǎng)皿中加入適量胰蛋白酶，37℃2-3min，（消化標準：細胞突起回縮，細胞間隙增大，細胞近乎圓形）；④加入一定培養(yǎng)液（小皿1ml,大皿2ml），終止消化反應(yīng)，反復(fù)吹打貼壁細胞，制成細胞懸液；⑤傳代/棄掉，剩余的細胞懸液加新的培養(yǎng)液，小皿4-5ml,大皿10-12ml;⑥貼上細胞名稱，代數(shù)，時間3.懸浮細胞的傳代懸浮細胞不貼壁生長，傳代時無需使用消化液處理；懸浮細胞不貼附于支持物，胞體圓形，培養(yǎng)液中生長空間大，可長時間生長，便于做細胞代謝研究；七、凍存細胞的復(fù)蘇（提前開水浴箱37℃）1.常用的凍存液：甘油，DMSO（二甲基亞砜，最常用，常溫時對細胞有很強細胞毒作用，凍存過程中細胞代謝停止，不能發(fā)揮細胞毒作用）。2.原則：快速融化，保證細胞外結(jié)晶在很短時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分溶入細胞內(nèi)形成細胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損傷；緩慢加液，加培養(yǎng)液時要慢，防止?jié)B透壓劇烈變化，造成細胞損傷；加入冷的5-10倍的培養(yǎng)液充分稀釋凍存液，以使DMSO對細胞的毒性作用降到最低點。3.步驟：①提前將恒溫水浴箱調(diào)到37℃-42℃預(yù)熱；取離心管、培養(yǎng)皿（酒精燈滅菌）；培養(yǎng)不同細胞，專管專用；②將放在4℃冰箱平衡的細胞培養(yǎng)液拿出，用帶有消毒水的紗布擦后放進超凈臺，瓶經(jīng)灼燒后將蓋擰松待用（避免開蓋時間過長，PH改變）；③在刻度離心管中加入5-6ml的培養(yǎng)液；④從液氮中取出凍存管，用鑷子夾其蓋部，在37℃溫水中快速搖動，管口不要遇水；⑤凍存管迅速過火開蓋，將底部細胞輕輕吹打起來，移至刻度離心管中；⑥離心，離心對細胞不利，要低速離心，800-1000r/min,3min,實驗室1200r/min,5min;在6cm培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)液；⑦離心完畢，離心管過火，將凍存液一次性倒進廢液缸，管口過火，加入新鮮培養(yǎng)液，輕輕吹打，移至培養(yǎng)皿中；⑧相差顯微鏡觀察細胞的狀況；復(fù)蘇標準：1.折光性：健康細胞立體感強，細胞內(nèi)顆粒少，非常透明，折光率高；2.細胞是否完整，細胞是否飽滿。八、細胞凍存：在體外培養(yǎng)細胞懸浮，加有冷凍保護劑（DMSO）的溶劑中，降至某溫度，并在此溫度長期保存。原則：慢凍速融；緩慢凍存：可使細胞內(nèi)的水分滲出細胞外，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶造成的細胞損傷；凍存細胞：取10代以內(nèi)為宜；步驟：1.配制凍存液；①30%血清+60%培養(yǎng)液+10%DMSO；②細胞不好培養(yǎng)時：90%血清+10%DMSO；2.對數(shù)生長的貼壁細胞，棄去舊培養(yǎng)液，PBS洗兩次；細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，當(dāng)前為第2頁。3.加入胰酶消化，制成細胞懸液（懸浮生長則直接移至離心管中），800-1000r/min離心5min，棄上清；細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，當(dāng)前為第2頁。4.加入凍存液，用吸管輕輕吹打，使細胞均勻，計數(shù)，凍存最終密度最少1×10的六次方；5.按每管0.5-1ml的量，將細胞懸液均勻裝入凍存管，擰緊管蓋；6.標明凍存細胞名稱，日期，操作者；7.凍存直接關(guān)系到細胞復(fù)蘇時的活力，分級凍存：4℃冰箱30min----轉(zhuǎn)入-20℃冰箱30—60min------轉(zhuǎn)入-70℃--80℃冰箱過夜---------將凍存管放入-196℃液氮罐中保存；注意事項：①凍存最好為對數(shù)生長期細胞，凍存前一天最好換一次液；②凍存和復(fù)蘇最好用新的培養(yǎng)基；③細胞低溫保存的關(guān)鍵是0—20℃的處理（在此溫度范圍內(nèi)，冰晶呈針狀，極易導(dǎo)致細胞損傷）；④DMSO無需滅菌（滅菌會破壞其分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致降低冷凍效果）九、收細胞1.用槍將培養(yǎng)基吸棄；2.1mlPBS洗（一定要輕柔，防止將細胞吸去）用槍將棄液吸棄；3.再加1mlPBS吹打細胞，（因293T細胞是半貼壁細胞，不用胰酶消化）將細胞全部吸打到液體中；4.將液體轉(zhuǎn)入1.5mlEP管，離心2000—3000R，3—5min;5.用槍頭吸凈上清；6.冷凍至-80℃冰箱；若為貼壁細胞：1.將舊培養(yǎng)基吸棄；2.加胰酶消化細胞；3.加入新培養(yǎng)液中和胰酶；4.將液體轉(zhuǎn)入1.5mlEP管，離心，棄上清；6.用1mlPBS清兩遍，棄凈上清；7.凍至-80℃冰箱；二、提取RNA一、工作臺處理及RNA專用器材；用Erasol處理工作臺面；RNase-free的槍頭，EP管；二、試劑準備1.Trizol試劑；2.氯仿（提RNA專用）；3.異丙醇（提RNA專用）；4.75%乙醇（DEPC水配制）；5.高壓處理的DEPC水：1000ml雙蒸水加入1mlDEPC，37℃過夜，高壓；三、操作步驟1.細胞處理：棄培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入Trizol(小皿加1ml,大皿加2ml;關(guān)鍵步驟，含醋酸鈉，在酸性環(huán)境RNA與蛋白質(zhì)分離，DNA不分離，DNA與蛋白質(zhì)被沉淀下來)，混勻，室溫靜置5min;2.反復(fù)吹打，將液體轉(zhuǎn)入1.5mlEP管中，加入0.2ml氯仿，劇烈震蕩15S，靜置5min;3.4℃離心，12000g，15min，樣品分三層，取上清（注意不要吸到中間的白色層，否則易造成DNA污染）；4.加入0.5ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min;5.4℃離心，12000g10min,棄上清；6.加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀，4℃離心，8000g5min，棄上清；7.冰上晾干，加入適量的DEPC水溶解（20ul）；8.取適量RNA進行濃度測定和電泳檢樣，剩余的RNA立即放-70℃冰箱保存；評價RNA質(zhì)量的標準是RNA的均一性和完整性均一性：OD是光密度值，A是吸光值，是同一個意思；A260是核酸（RNA/DNA）最大吸光值的波長；A280是蛋白質(zhì)最大吸光值的波長（A260/280比值可估計核酸純度）；純DNA的A260/A280是1.8，純的RNA是2.0；比值太低說明有殘留的蛋白質(zhì)，比值過高說明RNA降解；完整性：由于細胞中大部分RNA是rRNA，因此在理想的電泳圖上能看到的條帶有兩個，28S、18S，且28S是18S的兩倍，如果RNA發(fā)生降解，則上述兩條帶變?nèi)趸蛳?，出現(xiàn)一條分子量很小的條帶；細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，當(dāng)前為第3頁。細胞培養(yǎng)實驗技術(shù)手冊全文共4頁，