樹(shù)脂吸附法分離苦瓜皂苷的工藝研究

樹(shù)脂吸附法分離苦瓜皂苷的工藝研究【摘要】目的研究苦瓜總皂苷的純化方法。方法苦瓜醇提的濃縮液，通過(guò)經(jīng)處理的NKA大孔吸附樹(shù)脂，用不同濃度的乙醇進(jìn)行梯度洗脫，UV法跟蹤檢測(cè)。結(jié)果80%乙醇洗液中苦瓜總皂苷的含量最高，可達(dá)到36%。結(jié)論NKA大孔吸附樹(shù)脂可有效地分離提取苦瓜總皂苷。

【關(guān)鍵詞】苦瓜皂苷提取大孔吸附樹(shù)脂NKA樹(shù)脂

StudyonExtractionTechnologyofAponinsfromMomordicacharantiaMacroporousAbsorptionResin

Abstract：ObjectiveTostudyontheextractionandpurificationmethodsoftotalSaponinsinMomordicacharantiaL..MethodsMomordicaCharantiaL.ethanolisolatedsolutionspassedthroughtreatedNKAmacroporousabsorptionresin,andweremadegradientelutionwithethanol,thenweredetectedwithUVVIS.ResultsSaponinsin80%ethanolelutionwasthehighestandover36%.ConclusionNKAresinisgreatlyeffectivefortheextractionandpurificationofMomordicacharantiaL.saponins.

Keywords：MomordicacharantiaL.;Saponins;Extraction;Macroporousadsorptionresin;NKAresin

苦瓜MomordicacharantiaL.屬葫蘆科苦瓜屬，是人們生活中的一種常用蔬菜，同時(shí)也是功能食品原料。國(guó)內(nèi)外不少學(xué)者從不同地區(qū)、不同品種苦瓜及其種子中分離出了多種生理活性物質(zhì)，其中苦瓜中含有的苦瓜皂苷、生物堿、植物甾醇等成分具有顯著的降糖作用［1～4］。鑒于苦瓜皂苷的功效及藥用價(jià)值，本文以苦瓜為原料，采用吸附法提取苦瓜皂苷，確定了各項(xiàng)主要技術(shù)參數(shù)，以期對(duì)苦瓜皂苷提取的工業(yè)化生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

儀器與試

劑山苦瓜，江都苦瓜種植基地；苦瓜皂苷對(duì)照品momordicosideA，實(shí)驗(yàn)室自制；大孔吸附樹(shù)脂，商品號(hào)NKA、AB8和D101樹(shù)脂，南開(kāi)大學(xué)化工廠；LD52A離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；玻璃層析柱：20mm×600mm；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海精科實(shí)業(yè)有限公司；Cary紫外可見(jiàn)分光系統(tǒng)，美國(guó)VARIAN公司；薄層層析板G，青島海洋化工廠分廠；玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管，華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠；濃硫酸、冰醋酸和高氯酸等均為分析純。

分析方法

苦瓜皂苷的含量測(cè)定［5］測(cè)定波長(zhǎng)的選擇：吸取MomordicosideA甲醇標(biāo)準(zhǔn)液80μl,自然揮干溶劑，加5%草醛冰醋酸溶液ml，高氯酸ml，搖勻、密塞，于60℃水浴加熱15min，冰浴冷卻，加冰醋酸ml，用紫外可見(jiàn)分光系統(tǒng)測(cè)定吸收曲線［6］。選用545nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

建立回歸方程：分別吸取40，80，120，160，200μl甲醇標(biāo)準(zhǔn)液置10ml具塞試管中，同上法測(cè)定吸收度。皂苷含量和吸收值經(jīng)回歸處理，回歸方程為：A=8C5，r=4，(n=5)?？喙显碥蘸吭?0～200mg線性較好。

樣品溶液制備：洗脫液減壓回收乙醇至干，用少量甲醇溶解后，3000r/min離心后移置10ml容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻備用。

樣品皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定：同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中找出對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。

總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)%=(樣品液皂苷的質(zhì)量濃度×樣品液的體積/苦瓜粉末質(zhì)量)×100%

洗脫液中總糖含量的測(cè)定洗脫液中總糖含量采用3,5二硝基水楊酸比色定糖法測(cè)定。采用無(wú)水葡萄糖配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。于520nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2(Y=9,r=4)。

洗脫液中蛋白含量的測(cè)定采用Folin酚法測(cè)定洗脫液中蛋白質(zhì)的濃度。以空白液為參比，在640nm處比色測(cè)定。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3。

苦瓜皂苷TLC［7］展開(kāi)劑：氯仿甲醇水(65∶35∶10，5～10℃放置12h以上）的下層液為展開(kāi)劑。顯色劑：甲液取水25ml，緩慢加硫酸50ml，放冷后，再加乙醇25ml，搖勻；乙液：8%香草醛無(wú)水乙醇溶液。用時(shí)將5份甲液與1份乙液混合。臨用現(xiàn)配，80℃烘至斑點(diǎn)清晰。

2方法

樹(shù)脂的篩選

大孔樹(shù)脂的預(yù)處理先于吸附柱內(nèi)加入相當(dāng)于裝填樹(shù)脂體積～倍的乙醇，然后將新樹(shù)脂投入柱中，使其液面高于樹(shù)脂上端3mm處，浸泡24h；用2倍柱體積(BV)乙醇，以2BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂，并浸泡4～5h；用乙醇以2BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，洗至流出液不呈白色渾濁為止，并用水以同樣流速洗凈乙醇。用2BV的2%HCl溶液，以4～6BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至流出水pH值為中性；用2BV的2%NaOH溶液，以4～6BV/h的流速通過(guò)樹(shù)脂層，并浸泡2～4h，而后用水以同樣流速洗至流出水pH值為中性。用去離子水沖洗浸泡，待用。

苦瓜皂苷吸附量的測(cè)定準(zhǔn)確稱(chēng)取NKA，AB8和D101樹(shù)脂7g，苦瓜皂苷5g，皂苷用20ml水溶解，取出1ml留下備用。將稱(chēng)好的樹(shù)脂加入到剩余19ml皂苷溶液中，搖勻，在冰箱中放置3d(溫度為5℃)，使樹(shù)脂吸附飽和，從樹(shù)脂吸附前和吸附后的溶液中分別取l00μl溶液加入10ml容量瓶中，加ml甲醇稀釋至50倍。吸取250μl，同標(biāo)準(zhǔn)曲線項(xiàng)下測(cè)定吸附前后皂苷含量，利用其差值，計(jì)算出樹(shù)脂的吸附容量。

NKA樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)稱(chēng)取NKA樹(shù)脂5g，加入50ml濃度為mg/ml的苦瓜總皂苷溶液，于30℃下恒溫振蕩，每隔30min測(cè)1次溶液中的總皂苷濃度，考察樹(shù)脂吸附量隨時(shí)間的變化。

NKA樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)將處理好的NKA樹(shù)脂濕法裝柱，取一定濃度的苦瓜總皂苷溶液以一定的流速流樹(shù)脂柱，進(jìn)行吸附，每10ml收集1次，用分光光度法檢測(cè)，至苦瓜總皂苷液的出口濃度與進(jìn)口濃度相同為止。

苦瓜皂苷上柱液的準(zhǔn)備

原料預(yù)處理稱(chēng)取一定量的鮮苦瓜，低溫干燥后，80目粉碎，得到苦瓜粉。

提?。?］稱(chēng)取2000g干燥苦瓜粉，用5倍體積70%的乙醇溶液浸泡，在60℃回流3次，5h/次，過(guò)濾得清液，揮發(fā)干凈乙醇，濃縮至適當(dāng)體積(80ml)，備用。

樹(shù)脂吸附法分離苦瓜皂苷取粗提的苦瓜皂苷40ml清液上柱，靜置后，先用2BV去離子水洗去雜質(zhì)，再用3BV乙醇溶液洗脫皂苷，收集后待用。樹(shù)脂反復(fù)使用需用3BV甲醇再生。在提取過(guò)程中，分別考察了洗脫劑濃度和洗脫流速對(duì)苦瓜皂苷提取的影響。

在考察洗脫劑濃度影響時(shí)，取30ml/次，粗提苦瓜皂苷清液原料，分別用30%，60%,80%，90%乙醇溶液洗脫，洗脫流速為ml/min。通過(guò)檢測(cè)洗脫液中苦瓜皂苷、蛋白以及總糖含量，以得到高產(chǎn)、高純的苦瓜皂苷為目的，確定吸附層析法提取苦瓜皂苷的最佳條件。

3結(jié)果

樹(shù)脂吸附容量測(cè)定結(jié)果本文以等量的3種樹(shù)脂對(duì)相同起始濃度、相同體積的苦瓜皂苷溶液的平衡吸附量為依據(jù)，比較了3種樹(shù)脂對(duì)苦瓜皂苷的吸附能力，從而進(jìn)行篩選。表1列出了3種樹(shù)脂對(duì)苦瓜總皂苷的平衡吸附量。表13種樹(shù)脂對(duì)苦瓜總皂苷的吸附能力

由表1可知3種樹(shù)脂對(duì)苦瓜皂苷的乙醇溶液中皂苷的吸附能力，其中NKA樹(shù)脂對(duì)苦瓜總皂苷有較大的吸附量，因此選擇NKA樹(shù)脂用于苦瓜總皂苷的分離。

NKA樹(shù)脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖4為NKA樹(shù)脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線，根據(jù)相應(yīng)的間隔時(shí)間計(jì)算出苦瓜總皂苷的平均吸附速率。由吸附動(dòng)力學(xué)曲線可以看出，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附量在增加，在8h右基本達(dá)到平衡；吸附速率在h以后也逐漸平穩(wěn)。

NKA樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

流速對(duì)吸附曲線的影響對(duì)吸附效果有重要影響的一個(gè)參數(shù)是固液兩相的接觸時(shí)間，而影響固液接觸時(shí)間的主要因素是料液的流速。因此，吸附過(guò)程中必須控制原料液的流速。圖5為不同流速下NKA樹(shù)脂的穿透曲線。從圖中可以看出流速為ml/min，操作時(shí)間為40min左右比較適宜。

進(jìn)樣濃度對(duì)吸附曲線的影響當(dāng)流速為1ml/ml時(shí)，分別以12，，mg/ml的濃度進(jìn)樣，穿透曲線如圖6所示。從圖中可以隨著進(jìn)樣濃度的增加，穿透時(shí)間減少。最終選擇進(jìn)樣濃度mg/ml左右進(jìn)行樹(shù)脂吸附。

乙醇洗脫濃度對(duì)皂苷提取的影響從表1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，皂苷含量逐漸增加，但是80%以后皂苷含量降低。糖的含量變化不大。蛋白的含量雖逐漸增加，但其單位是μg/ml，因此總體變化不大。

不同濃度乙醇時(shí)洗脫苦瓜皂苷的TLC結(jié)果與苦瓜皂苷含量比色分析結(jié)果一致，隨著洗脫液中乙醇濃度的增加，各皂苷單體數(shù)目和含量都明顯增多，當(dāng)然雜質(zhì)也增加。

最終確定80%乙醇為最佳洗脫濃度。

苦瓜皂苷提取率與純度1000g苦瓜粉平均得到苦瓜皂苷粗品9g，經(jīng)比色分析皂苷含量g。表2不同濃度乙醇洗脫液中皂苷、蛋白和總糖含量(略)

皂苷得率＝4/1000＝%

皂苷純度＝4/9＝%

4小結(jié)

本文研究了國(guó)產(chǎn)大孔吸附樹(shù)脂提取和純化苦瓜皂苷的方法。試驗(yàn)采用分光光度法測(cè)定了苦瓜皂苷的含量。通過(guò)對(duì)樹(shù)脂吸附量的研究，發(fā)現(xiàn)NKA樹(shù)脂對(duì)苦瓜總皂苷的吸附量較大，為mg/g。其分離純化苦瓜皂苷的最佳進(jìn)樣濃度為mg/ml，最佳流速為1ml/min。

實(shí)驗(yàn)還考查了乙醇洗脫濃度對(duì)苦瓜皂苷提取的影響，得出最佳乙醇洗脫濃度80%，所得皂苷純度為%，得率為%。是一種簡(jiǎn)便實(shí)用的苦瓜皂苷提取方法。

苦瓜皂苷的有機(jī)溶劑提取法［6］和樹(shù)脂吸附提取法都可以有效提取苦瓜皂苷。兩方法相比較，前者純度略高，但實(shí)驗(yàn)步驟較多，有機(jī)溶劑用量相對(duì)較大。而后者提取率略高且步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，通過(guò)前者方法提取的苦瓜皂苷也可通過(guò)NAK樹(shù)脂進(jìn)一步純化。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ToshiyukiMURAKAMI,MedicinalFoodstuffs.ofNewCucurbitane-TypeTriterpeneGlycosides,Goyaglycosidesa,b,c,d,e,f,g,andh,andNewOleanane-TypeTriterpeneSaponins,GoyasaponinsI,II,andIII,fromtheFreshFruitofJapaneseMomordicacharantiaL［J］.PharmaceuticalSocietyofJapan,2001,49：54.

［2］JaspreetV,AntihyperglycemiceffectsofthreeextractsfromMomordicacharantiaL［J］.JournalofEthnopharmacology,2003(88)：107.

［3］Raman,A.LAU,C,anti-diabeticpropertiesandphytochemistryofMomordicaCharantiaL.(curcubitaceae)［J］.Phytomedicine1996,(4)：349.

［4］LotlikarMM,Rajaramaofahypoglycemicprincipleisolatedf