高效液相簡介及常見問題

高效液相色譜簡介簡介：高效液相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography\HPLC）又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”、“高分離度液相色譜”、“近代柱色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個(gè)重要分支，以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。該方法已成為化學(xué)、醫(yī)學(xué)、工業(yè)、農(nóng)學(xué)、商檢和法檢等學(xué)科領(lǐng)域中重要的分離分析技術(shù)應(yīng)用高效液相色譜簡介特點(diǎn)：高效液相色譜法有“四高一廣”的特點(diǎn)：

1.高壓：流動(dòng)相為液體，流經(jīng)色譜柱時(shí)，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對(duì)載液加高壓2.高速：分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個(gè)樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內(nèi)即可完成，一般小于1小時(shí)3.高效：分離效能高?？蛇x擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍4.高靈敏度：紫外檢測器可達(dá)0.01ng，進(jìn)樣量在μL數(shù)量級(jí)5.應(yīng)用范圍廣：百分之七十以上的有機(jī)化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢(shì)6.柱子可反復(fù)使用：用一根柱子可分離不同化合物

7.樣品量少、容易回收：樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備高效液相色譜簡介

此外高效液相色譜還有色譜柱可反復(fù)使用、樣品不被破壞、易回收等優(yōu)點(diǎn)，但也有缺點(diǎn)，與氣相色譜相比各有所長，相互補(bǔ)充。高效液相色譜的缺點(diǎn)是有“柱外效應(yīng)”。在從進(jìn)樣到檢測器之間，除了柱子以外的任何死空間（進(jìn)樣器、柱接頭、連接管和檢測池等）中，如果流動(dòng)相的流型有變化，被分離物質(zhì)的任何擴(kuò)散和滯留都會(huì)顯著地導(dǎo)致色譜峰的加寬，柱效率降低。高效液相色譜檢測器的靈敏度不及氣相色譜

高效液相色譜簡介HPLC儀器的配置及流程：高效液相色譜簡介色譜分離的機(jī)理：高效液相色譜簡介色譜的圖形結(jié)果：高效液相色譜簡介色譜柱進(jìn)樣閥脫氣裝置流動(dòng)相檢測器高壓泵構(gòu)造：高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：

輸液泵：多用柱塞往復(fù)泵，柱塞向前運(yùn)動(dòng)，液體輸出，流向色譜柱；向后運(yùn)動(dòng)，將貯液瓶中液體吸入缸體。如此往復(fù)運(yùn)動(dòng)，將流動(dòng)相源源不斷地輸送到色譜柱中高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：色譜柱：常用的色譜柱填料有硅膠和化學(xué)鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠最為常用辛基鍵合硅膠次之，氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：色譜柱：在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項(xiàng)下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖

化學(xué)鍵合固定相應(yīng)用，量出供試品主成分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時(shí)間t(R)和半高峰寬W(h/2)，按n=5.54[t(R)╱W(h/2)]^2計(jì)算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項(xiàng)下規(guī)定的最小理論板數(shù)，應(yīng)改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達(dá)到要求高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：檢測器：分為紫外檢測器和熒光檢測器。紫外檢測器：是基于溶質(zhì)分子吸收紫外光的原理設(shè)計(jì)的檢測器，其工作原理是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光透過流動(dòng)池時(shí)，若流動(dòng)相不吸收光，則吸收度A與吸光組分的濃度C和流動(dòng)池的光徑長度L成正比

高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：熒光檢測器：是高壓液相色譜儀常用的一種檢測器。用紫外線照射色譜餾分，當(dāng)試樣組分具有熒光性能時(shí)，即可檢出高效液相色譜簡介高效液相色譜構(gòu)造：流動(dòng)相：

1.溶劑對(duì)于待測樣品，必須具有合適的極性和良好的選擇性2.溶劑要與檢測器匹配。對(duì)于紫外吸收檢測器，應(yīng)注意選用檢測器波長比溶劑的紫外截止波長要長3.高純度。由于高效液相靈敏度高，對(duì)流動(dòng)相溶劑的純度也要求高。不純的溶劑會(huì)引起基線不穩(wěn)，或產(chǎn)生“偽峰”。痕量雜質(zhì)的存在，將使截止波長值增加50～I(xiàn)OOnm4.化學(xué)穩(wěn)定性好。不能選與樣品發(fā)生反應(yīng)或聚合的溶劑5.低粘度。若使用高粘度溶劑，勢(shì)必增高壓力，不利于分離。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙晴等。但粘度過于低的溶劑也不宜采用，例戊烷、乙醚等，它們易在色譜柱或檢測器內(nèi)形成氣泡，影響分離.高效液相色譜簡介HPLC的主要類型：液一液分配色譜法（LLPC）：在液-液色譜中,流動(dòng)相和固定相都是液體,它能適用于各種樣品類型的分離和分析，無論是極性的和非極性的，水溶性和油溶性的，離子型的和非離子型的化合物分離原理：液液分配色譜的分離原理基本與液液萃取相同，都是根據(jù)物質(zhì)在兩種互不相溶的液體中溶解度的不同，具有不同的分配系數(shù)。所不同的是液液色譜的分配是在柱中進(jìn)行的，使這種分配平衡可反復(fù)多次進(jìn)行，造成各組分的差速遷移，提高了分離效率，從而能分離各種復(fù)雜組分高效液相色譜簡介HPLC的主要類型：液一液分配色譜法（LLPC）：固定相：液液色譜的固定相由載體和固定液組成，通常有以下幾類；1.全多孔型載體：由硅膠、硅藻土等材料制成，直徑約100m的全多孔型顆粒，這類固定相由于顆粒很細(xì)，孔仍然較淺，傳質(zhì)速率快，易實(shí)現(xiàn)高效、高速。特別適合復(fù)雜混合物分離及痕量分析2.表面多孔型載體（薄殼型微珠載體）：由直徑為30~40m的實(shí)心玻璃球和厚度約為1~2m的多孔性外層所組成。目前，這種載體粒度為5~10m

流動(dòng)相：根據(jù)所使用的流動(dòng)相和固定相的極性程度，將其分為正相分配色譜和反相分配色譜高效辰液相薪色譜即簡介HP潔LC的主國要類女型：液一求液分雨配色抽譜法鞠（LL爸PC）：正相帖液-液分系配色罪譜法(N雨or抽ma椒l引Ph理as鍵e芹li歲qu蹄id屈C廚hr挎om計(jì)at胸og耕ra溝ph葛y)蔑:流動(dòng)禽相的因極性元小于李固定鈔液的拳極性反相巧液-液分濁配色雷譜法(R疲ev爺er碼se孤P滲ha桐se贏l儲(chǔ)iq喇ui絕d獨(dú)Ch堤ro躁ma輪to令gr心ap喂hy映):流動(dòng)嘉相的架極性匯大于術(shù)固定奴液的燈極性液-液分般配色季譜法營的缺城點(diǎn)：盡管測流動(dòng)宗相與辛固定獨(dú)相的小極性駁要求撒完全鉤不同老，但岸固定糊液在夕流動(dòng)慰相中縱仍有夸微量舞溶解摸；流蛙動(dòng)相金通過田色譜濁柱時(shí)羨的機(jī)冤械沖應(yīng)擊力公，會(huì)病造成辯固定剪液流摘失高效雜液相共色譜鑄簡介HP徐LC的主容要類蔬型：液一機(jī)固吸踏附色淚譜法(L兆SA糖C)：液一巖固吸淘附色獄譜是軍以固熱體吸禾附劑孝作為乓固定戰(zhàn)相，俊吸附呈劑通逼常是然些多板孔的裁固體懷顆粒賽物質(zhì)狼，在價(jià)它們梅的表封面存塘在吸猜附中鬼心。確液固萌色譜葡實(shí)質(zhì)濱是根龜據(jù)物躺質(zhì)在宗固定殃相上耽的吸疏附作厭用不答同來蹈進(jìn)行礎(chǔ)分離觸的分離纖原理：當(dāng)惹流動(dòng)州相通臟過固個(gè)定相島（吸犧附劑折）時(shí)浩，吸笑附劑羅表面未的活監(jiān)性中貫心就倒要吸皆附流南動(dòng)相荒分子浮。同禮時(shí)，壞當(dāng)試歸樣分店子（X）被武流動(dòng)致相帶族入柱帖內(nèi)，莫只要篩它們簽在固油定相芬有一揀定程柱度的銜保留臨就要渴取代醫(yī)數(shù)目另相當(dāng)鎖的已鑼被吸棄附的嚇流動(dòng)濃相溶偷劑分課用）義于是夸，在頭固定快相表唱面發(fā)墨生競壺爭吸撓附X充+御nSad=鞋Xad+追nS高效縮慧液相兄色譜認(rèn)簡介HP拾LC的主傳要類研型：液一棟固吸狐附色殿譜法(L土SA偷C)：固定摘相：液－園固吸票附色龍譜所旅用固販定相揉多是佳一些歡吸附樹活性叮強(qiáng)弱傳不等濁的吸守附劑灶，如內(nèi)硅膠聯(lián)、氧摩化鋁聞、聚戶酸膠蒙等。搏由于茫硅膠停的優(yōu)康點(diǎn)較謎多，鐘如線旦性容顯量較金高，炭機(jī)械探性能想好，雀不溶壩脹，狀與大釣多數(shù)述試樣作不發(fā)演生化該學(xué)反建應(yīng)等灰，因棟此，層以硅捧膠用渡得最巾多目前倡最廣紙泛使蔥用的兄還是5～10m的全多每孔型接微粒壞填料流動(dòng)均相：一般擠把吸徒附色喉譜中白流動(dòng)障相稱素作洗元脫劑。在吸慢附色益譜中括對(duì)極坦性大噸的試溜樣往犧往采剃用極劣性強(qiáng)剩的洗示脫劑沿；對(duì)伐極性捉弱的榨試樣錢宜用臣極性自弱的哄洗脫噴劑高效廈液相捏色譜犁簡介HP站LC的主基要類霸型：離子吵交換儀色譜預(yù)法（IE亦C）：此法鍵是利圓用離睬子交克換原堵理和掛液相拖色譜志技術(shù)艘的結(jié)愉合來張測定賽溶液何中陽黎離子死和陰吃離子平的一費(fèi)種分林離分嫂析方始法。搬凡在紙溶液尿中能坊夠電迫離的絲式物質(zhì)蘆，通伶常都伶可用捧離子旱交換譜色譜微法進(jìn)園行分滑離。面它不蒸僅適卸用無塘機(jī)離旺子混域合物獅的分件離，活亦可茫用于哪有機(jī)雨物的櫻分離侮，例型如氨順基酸吸、核芬酸、掙蛋白捉質(zhì)等忍生物消大分?jǐn)z子。絞因此運(yùn)，應(yīng)以用范稼圍較弟廣離子箏交換甲原理困：離子蛙交換絡(luò)色譜設(shè)法是畜利用攔不同漏待測深離子巖對(duì)固宜定相鐵親和掩力的鐵差別隙來實(shí)算現(xiàn)分違離的張。其攝固定信相采風(fēng)用離渾子交繭換樹煤脂，容樹脂乓上分槽布有好固定罩的帶出電荷找基團(tuán)緊和可陪游離坐的平只衡離敘子。枝當(dāng)待郊分析朽物質(zhì)排電離瞞后產(chǎn)誘生的月離子箭可與隨樹脂傲上可違游離村的平拖衡離奇子進(jìn)爐行可糧逆交天換高效咽液相缺色譜逗簡介HP煮LC的主戒要類窩型：離子甩交換角色譜狹法（IE榆C）：固定廣相：1.多孔姐型離夠子交泛換樹贏脂：攀它主切要是激聚苯慈乙烯務(wù)和二斬乙烯莊苯基敬的交包聯(lián)聚嚼合物永，直拾徑約憤為5～20守μm，有爺微孔辮型和支大孔師型之到分2.薄膜手型離惱子交國換樹興脂短：它無是在段直徑腎約對(duì)30犁μm的固創(chuàng)體惰師性核稍上，慣凝聚1～2μ欄m厚的四樹脂具層3.表面傾多孔血型離招子交愿換樹肅脂：吉它是課在固衰體情仔性核早上，選覆蓋息一層捷微球燒硅膠盜，再則在上戴面涂委一層羨很薄犁的離獻(xiàn)子交銅換樹煉脂流動(dòng)仙相：離子問交換冷色譜虧法所析用流夢(mèng)動(dòng)相肥大都稅是一站定pH和鹽慌濃度預(yù)（或綠離子耀強(qiáng)度雀）的晌緩沖松溶液全。通籠過改撫變流蓮動(dòng)相巾中鹽師離子淺的種端類、舒濃度分和pH值可儲(chǔ)控制k值，占改變象選擇光性。有時(shí)組也使暢用有宏機(jī)溶緣瑞劑如晃甲醇橫或乙浴醇同嬸水緩址沖溶連液混拴合使斜用，爐以提襖高特譯殊的才選擇腔性，則并改脹善樣霞品的爆溶解辛度高效吸液相霧色譜量簡介HP逆LC的主敞要類嗎型：離子燭對(duì)色堅(jiān)譜法克（IP龍C）：離子說對(duì)色饞譜法窄是分啞離分求析強(qiáng)蹄極性脂有機(jī)鼠酸和即有機(jī)妖堿的不極好登方法得。離層子對(duì)碌色譜密法是確將一運(yùn)種（喊或數(shù)渴種）先與溶說質(zhì)離介子電掛荷相幻玉反的阻離子撿（稱舊對(duì)離灰子或如反離妻子）談加到凱流動(dòng)安相或劫固定候相中繡，使鑄其與貧溶質(zhì)指離子納結(jié)合揪形成海離子膝對(duì)，以從而槍控制促溶質(zhì)眾離子眠保留豪行為妖的一里種色月譜法分離窯原理案：由于捷離子蜓對(duì)化榨合物A-B+具有亦疏水價(jià)性，識(shí)因而絮被非特極性欲固定矮相（率有機(jī)甜相）仰提取腐。組太分離牢子的跳性質(zhì)明不同劃，它側(cè)與反灑離子臥形成跟離子隸對(duì)的銷能力圣大小陪不同遠(yuǎn)以及槍形成江的離逆子對(duì)壁流水葉性質(zhì)執(zhí)不同君，導(dǎo)優(yōu)致各叫組分株離子蒸在固界定相萬中滯耗留時(shí)擔(dān)間不哲同，扔因而旋出峰李先后姿不同高效耽液相藏色譜框簡介HP道LC的主釀要類氧型：離子尤對(duì)色霸譜法有（IP診C）：固定扶相：非極弟性的聾疏水厲鍵合廚相流動(dòng)以相：加有攝平衡塵離子藏（反脊離子輝）的班極性蘭溶液另通過疏改變府流動(dòng)欠相的pH、平趴衡拋離子粉的濃劫度和礦種類嘗可改次變分皂離的鮮選擇外性。高效歡液相之色譜社簡介HP爹LC的主芬要類掠型：空間過排阻日色譜道法（SE疑C）：主要朵用于根較大噴分子摸的分安離。睛與其趴他液嚷相色暑譜方蟻法原愛理不哥同，除它不壓具有稅吸附制、分杯配和崖離子忘交換自作用郊機(jī)理堅(jiān)，而箭是基苦于試且樣分與子的代尺寸李和形胃狀不傭同來成實(shí)現(xiàn)懸分離兆的分離伶原理未：空間提排阻圓色譜箏是按壇分子兔大小熟順序退進(jìn)行原分離起的一惰種色棟譜方旱法。母凝膠圖內(nèi)具籠有一離定大吩小的疤孔穴落，體蔽積大劃的分掠子不忙能滲當(dāng)透到脂孔穴醬中去盟而被逃排阻云，較躁早地倦被淋券洗出牽來；毅中等六體積題的分吹子部眠分滲帖透；現(xiàn)小分蔥子可揚(yáng)完全子滲透跑入內(nèi)未，最猶后洗新出色輪譜柱高效額液相丙色譜裁簡介HP僑LC的主宗要類答型：空間灶排阻抵色譜海法（SE間C）：固定馳相：排阻筒色譜售固定黎相種畏類很抬多，稈一般弄可分突為軟陸性、局半剛茅性和頭剛性旁凝膠姐三類膀。1.軟性四凝膠崗如震葡聚臘糖凝苗膠、時(shí)瓊脂盛糖凝耀膠都跑具有硬較小薄的交紗聯(lián)結(jié)映構(gòu)，壩其微響孔能算吸入櫻大量仿的溶沫劑，拋并能縱溶脹伶到它全們干繁體的鴨許多悔倍。蟻它們膊適用哪以水陵溶性躲溶劑槍作流礦動(dòng)相陶，一石般用拳于小際分子怠質(zhì)量逆物質(zhì)處的分東析，綱不適腸宜用嘴在高去效液慨相色骨譜中2.半剛槍性凝符膠美如肥高交胳聯(lián)度翠的聚懲苯乙對(duì)烯（St朗yr遠(yuǎn)ag米el）比茫軟性焰凝膠藏稍耐社壓，馳溶脹牛性不企如軟裹性凝菠膠。六常以持有機(jī)皺溶劑卡作流釣動(dòng)相吵。用電于高瓦效液饞相色孩譜時(shí)謙，流離速不額宜大3.剛性哪凝膠廚如晨多孔蕩硅膠到、多其孔玻脂璃等舟它們散既可沉用水久溶性訪溶劑亡，又塔可用灣有機(jī)長溶劑遵作流灶動(dòng)相蟻，可恩在較撒高壓定強(qiáng)和釣較高留流速壤下操梨作。笑一般揮控制孝壓強(qiáng)鼠小于7M叛Pa，流似速＜1c膠m3湊·s拉-1；否意則將或影響芝凝膠濱孔徑啄，造譽(yù)成不經(jīng)良分想離高效痰液相包色譜不簡介HP哄LC的主累要類鹽型：空間跟排阻劫色譜著法（SE鞋C）：流動(dòng)物相：排阻援色譜湊所選大用的董流動(dòng)拾相必秒須能野溶解網(wǎng)樣品甜，并溝必須黎與凝知膠本饅身非餐常相懷似，例這樣創(chuàng)才能憤潤濕親凝膠釋。當(dāng)甲采用維軟性耍凝膠涌時(shí)，象溶劑毀也必膛須能缸溶脹符凝膠鴿。溶銜劑的春粘度封要小駁，因欣為高降粘度治溶劑者往往伍限制雁分子今擴(kuò)散嘗作用時(shí)而影遷響分享離效剛果。鑄常用刃的流瓣動(dòng)相床有四串氫呋策喃、革甲苯超、氯情仿、純二甲軋基酸飲胺和腹水等高效員液相攜色譜睛簡介液相誦色譜綠分離庸類型景選擇順參考板表：高效罵液相偽