現(xiàn)代生物技術(shù)課件 5胚胎工程

第七章

胚胎工程（Embryotechnology，

Embryo

engineering）第一節(jié)

胚胎工程

Embryoengineering

一、胚胎工程的概念

胚胎工程是通過(guò)人工操作胚胎，定向改變動(dòng)物性狀使之為人類造福的一系列生物技術(shù)的總稱。其主要是對(duì)哺乳動(dòng)物的胚胎進(jìn)行某種人為操作，然后讓它繼續(xù)發(fā)育，獲得人們所需要的成體動(dòng)物的技術(shù)。

胚胎工程相關(guān)基本概念1.超數(shù)排卵簡(jiǎn)稱超排指通過(guò)給母畜注射適當(dāng)?shù)募に兀S持更多卵泡正常發(fā)育而排出更多卵子的過(guò)程。2.體外受精,亦稱試管動(dòng)物技術(shù)指把體外受精動(dòng)物的卵子和精子取出在試管內(nèi)混合，受精而形成胚胎的過(guò)程。在哺乳動(dòng)物，體外受精胚胎一般在體外發(fā)育到一定時(shí)期后移植到受體雌性動(dòng)物輸卵管或子宮內(nèi)，妊娠到產(chǎn)仔。3.發(fā)育阻斷：

在化學(xué)組分確定的培養(yǎng)基中，早期胚胎往往不能完成從受精卵到囊胚的發(fā)育全過(guò)程,而停頓在某個(gè)特定的發(fā)育時(shí)期.這種現(xiàn)象被稱為“發(fā)育阻斷”。4.嵌合體：

生物學(xué)中把在同一個(gè)體中由基因型不同的細(xì)胞或組織互相接觸,且各自獨(dú)立并存(混合存在)的狀態(tài),稱為嵌合體。6.胚胎保存：

就是在體外或者體內(nèi)把胚胎暫時(shí)貯存起來(lái)而不使其失去活力。7.胚胎干細(xì)胞：

也可被稱為多能性干細(xì)胞，是由哺乳動(dòng)物早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)或原始生殖細(xì)胞分離的，經(jīng)體外抑制分化培養(yǎng)后，所獲得的具有保持未分化的狀態(tài)和無(wú)限增殖能力的細(xì)胞系。無(wú)論在體外還是體內(nèi)環(huán)境，ESCs都能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型。

8.轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過(guò)遺傳工程的和發(fā)育工程的手段對(duì)動(dòng)物基因組的結(jié)構(gòu)或組成進(jìn)行人為的修飾或改造，使外源基因與動(dòng)物本身的基因整合，并通過(guò)相應(yīng)的動(dòng)物繁殖育種技術(shù)使得這些經(jīng)修飾改造后的基因組在世代間得以傳遞和表現(xiàn)的工程化動(dòng)物。9.動(dòng)物克?。?/p>

指一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無(wú)性繁殖或孤雌生殖而產(chǎn)生出遺傳構(gòu)成完全相同的多個(gè)后代動(dòng)物。10.顯微受精：

亦稱顯微操作協(xié)助受精,是指通過(guò)對(duì)動(dòng)物精子進(jìn)行顯微操作，以幫助其受精的一系列技術(shù)。主要包括：胞質(zhì)內(nèi)精子注射、透明帶下精子注射及透明帶鉆洞和透明帶部分切口。二、發(fā)展歷史與意義

早在1891年，英國(guó)劍橋大學(xué)的赫普（WalterHeape）就在免子身上首次成功地進(jìn)行了受精卵移植實(shí)驗(yàn)。

20世紀(jì)30年代，一些學(xué)者用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如鼠、兔等作受精卵或胚胎移植的研究并獲得成功。以后又在綿羊、山羊、豬、牛和馬等家畜進(jìn)行胚胎移植實(shí)驗(yàn)，相繼獲得成功。

20世紀(jì)60年代以來(lái)，由于實(shí)驗(yàn)技術(shù)的突破，如超數(shù)排卵、同期發(fā)情、胚胎采集、移植方法等研究的進(jìn)展，使胚胎移植不僅在理論上而且在實(shí)踐上進(jìn)入應(yīng)用階段。近20年來(lái)，胚胎移植技術(shù)經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn)，已經(jīng)簡(jiǎn)單、實(shí)用而且規(guī)范化，技術(shù)程序化。意義1）發(fā)揮優(yōu)良母畜的繁殖潛力,增加優(yōu)良品種數(shù)量。一頭優(yōu)良品種母牛卵巢內(nèi)有幾萬(wàn)個(gè)生殖細(xì)胞，在一個(gè)正常性周期內(nèi)只有幾個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育，最終只有一個(gè)卵泡成熟并排卵，如果受精也只能生出一只良種牛犢。一只良種母畜一生只可能繁殖10個(gè)左右的后代，大部分時(shí)間用于妊娠和哺乳。如果能讓更多的卵泡成熟排卵，而又讓品質(zhì)平凡的同種母畜“借腹懷胎”，那么，優(yōu)良母畜可以獲得后代的數(shù)目至少幾十倍。2.促進(jìn)家畜改良的速度

由于提高了繁殖能力，可以使一頭母畜在一個(gè)性周期內(nèi)繁殖更多的仔畜，從而在短期內(nèi)使優(yōu)良種畜得到大量繁殖，促進(jìn)了家畜改良的速度。例子——“世界山羊之王”

波爾山羊的快速繁殖體格高大，四肢粗壯，身體豐滿。平均日增重350克，屠宰出肉率可達(dá)60%以上。具有適應(yīng)性強(qiáng)、采食性廣、繁殖性能好、肉用性十分顯著等特點(diǎn)。（一）胚胎工程研究主要包括：胚胎移植體外受精胚胎克隆胚胎性別鑒定胚胎嵌合顯微受精轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)等。三、胚胎工程的研究?jī)?nèi)容

（二）胚胎工程技術(shù)胚胎工程采用的新技術(shù)包括:

胚胎分割技術(shù)、胚胎融合技術(shù)、卵核移植技術(shù)、體外受精技術(shù)、胚胎培養(yǎng)技術(shù)、胚胎移植技術(shù)、性別鑒定技術(shù)、胚胎冷凍技術(shù)等。

1.胚胎移植及其基本程序

（1）概念

胚胎移植俗稱“借腹懷胎”，是指于著床前自一母體（供體）收集胚胎，移植到另一母體（受體）內(nèi)完成妊娠的過(guò)程。在畜牧業(yè)上，供體一般為優(yōu)秀母畜，而受體一般為品質(zhì)較差些的母畜。（2）胚胎移植的基本技術(shù)程序

胚胎移植的基本技術(shù)程序包括：供體的超排和輸精→胚胎的收集（手術(shù)法和非手術(shù)法）→胚胎的檢出和冷凍保存→受體的發(fā)情同步處理→胚胎移植（手術(shù)法和非手術(shù)法）→受體妊娠產(chǎn)仔。

(1).手術(shù)法胚胎移植

將同期化處理后的受體動(dòng)物仰面固定在手術(shù)床上，全身麻醉，腹部切口，將一側(cè)卵巢上有黃體發(fā)育的子宮遠(yuǎn)端拉出，把胚胎輸入子宮上1/3處。這種方法移卵容易、損傷小、成功率較高。

(2).非手術(shù)法胚胎移植

使用類似于人工授精的專用輸胚槍，將其直接插入排卵側(cè)子宮角內(nèi)，注入胚胎。

2.胚胎冷凍保存

要建立胚胎庫(kù)和長(zhǎng)途運(yùn)送胚胎，需要解決胚胎冷凍保存問(wèn)題。冷凍保存方法大體可分為緩慢冷凍、快速冷凍、玻璃化冷凍三類。

3.胚胎分割

借助顯微操作技術(shù)或徒手操作方法，切割早期胚胎成2、4等多等份，再移植給受體母畜，制造同卵多仔后代的技術(shù)。分割前，一般均需先準(zhǔn)備好空透明帶，將分割后的胚細(xì)胞團(tuán)移入空透明帶內(nèi)。胚胎分割是（1）擴(kuò)大胚胎利用率的一種有效途徑，可以使胚胎移植的胚胎數(shù)目成倍增加。（2）可以產(chǎn)生遺傳性狀相同的后代，因此是一種廣義上的克隆技術(shù)。

4.胚胎融合

胚胎融合又叫胚胎嵌合，將兩個(gè)不同品種或不同種（除部分或全部細(xì)胞去透明帶）胚粘合在一起，或者各自一分為二，然后各取一半，融合成新的胚胎，移植給受體，使之發(fā)育成一個(gè)胚胎，產(chǎn)生具有雜交優(yōu)勢(shì)的新后代——嵌合體?？捎脙?nèi)細(xì)胞團(tuán)囊胚注入法，將一個(gè)品系的單個(gè)卵裂球注入另一品系胚胎的囊胚腔中。胚胎融合

將同一種類的黑鼠和白鼠胚胎融合，可以獲得多個(gè)黑白相間的花鼠。將不同種的綿羊和山羊的胚胎融合，可得到擁有綿羊和山羊雙重特性的新品種——“綿山羊”。大鼠-小鼠、綿羊-山羊、馬-斑馬、黃牛-水牛等屬間嵌合體動(dòng)物。意義：1）胚胎融合技術(shù)為動(dòng)物胚胎發(fā)育及遺傳控制等研究提供了有效手段，嵌合體后代可集不同基因于一體，形成具有高度雜種優(yōu)勢(shì)的雜合體。2）胚胎融合成倍縮短家畜改良時(shí)間，為創(chuàng)造新型的家畜品種提供新的技術(shù)手段。

5.卵核移植

就是將優(yōu)良母畜胚胎的卵裂球分離開(kāi)來(lái)，獲得幾十個(gè)具有優(yōu)良遺傳基因的供體核，然后將這些供體核分別注入一般母體的去核卵子中，產(chǎn)出遺傳素質(zhì)相同的后代。目的是由一個(gè)優(yōu)良胚胎(同卵)生出更多的優(yōu)良后代，進(jìn)一步提高優(yōu)良母畜繁殖潛力。6.動(dòng)物性別控制與胚胎性別鑒定

性別控制是通過(guò)人為干預(yù)或操作手段使母畜繁殖所需要的后代。

性別控制途徑:1.X與Y精子的分離；

2.胚胎性別鑒定。1)X-Y精子的分離X-Y精子在物理和化學(xué)上存在差異，因此可以采用相應(yīng)的方法分離。離心法：

X精子DNA含量大于Y精子，因此X精子密度大。優(yōu)點(diǎn)：時(shí)間短；缺點(diǎn)：條件要求精確。電泳分離法：利用表面電荷差異，Y精子正電荷大于X精子，在負(fù)極集聚。

2)胚胎性別鑒定Y染色體短臂上一段SRY基因決定人的性別。

SRY基因啟動(dòng)雄性形狀的發(fā)育，激發(fā)下游基因MLS的轉(zhuǎn)錄，引起睪酮分泌，形成雄性組織。XX染色體缺少SRY基因，染色體上DSS位點(diǎn)基因轉(zhuǎn)錄促進(jìn)卵巢發(fā)育，形成雌性。性別鑒定方法

1.分子生物學(xué)方法根據(jù)Y染色體上的SRY基因的有無(wú)進(jìn)行鑒別，可以采用PCR或FISH等分子方法進(jìn)行確定性別。性別鑒定方法2.細(xì)胞生物學(xué)（組織學(xué)）方法胚胎階段的核型分析，根據(jù)檢出的XX、XY染色體來(lái)進(jìn)行性別鑒定等。3.免疫學(xué)方法

H--Y抗原為雄性哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜所特有，檢測(cè)胚胎細(xì)胞膜上是否存在H--Y抗原即可鑒別其性別。

7.體外受精

體外受精就是采取雌性動(dòng)物的卵子和雄性動(dòng)物的精子，使其在試管中受精。商品犢牛屠宰前用激素處理，一次有20～50個(gè)卵泡發(fā)育，可獲得20～50個(gè)卵母細(xì)胞，因而體外受精技術(shù)可充分挖掘優(yōu)良母牛生育潛力。人類試管嬰兒。精子的采集與體外獲能處理卵子的回收與成熟培養(yǎng)體外受精

8.基因?qū)?/p>

給胚胎注入外源基因，增加新遺傳物質(zhì)，并使之在后代中能穩(wěn)定表達(dá)出來(lái)。兩個(gè)目的:

①加快動(dòng)物生產(chǎn)性能的改良速度；②實(shí)現(xiàn)常規(guī)選擇和雜交不能實(shí)現(xiàn)目標(biāo)。

9.轉(zhuǎn)基因技術(shù)

指將外源基因整合到生物體內(nèi)，得到穩(wěn)定表達(dá)，并使該基因能夠穩(wěn)定遺傳給后代的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。五、

胚胎工程應(yīng)用（一）試管動(dòng)物

將供體的精子和卵子在體外受精、體外培養(yǎng)胚胎，然后將發(fā)育到一定程度的胚胎移植入受體，可以得到各種動(dòng)物。由于體外受精一般都在試管內(nèi)進(jìn)行，所以稱為“試管動(dòng)物”。也有稱為“體外受精動(dòng)物”。試管動(dòng)物定義：

利用受精卵體外受精、胚胎體外培養(yǎng)和胚胎移植獲得的各種動(dòng)物。試管動(dòng)物的培育流程

精子的采集與體外獲能處理卵子的回收與成熟培養(yǎng)卵子與精子的體外受精受精卵的體外發(fā)育成胚胎胚胎的移植體內(nèi)發(fā)育與分娩（二）試管嬰兒試管嬰兒技術(shù)的發(fā)展歷史

1978年7月25日世界上第1例試管嬰兒LouisBrown在英國(guó)誕生。奠基人為英國(guó)婦產(chǎn)科專家Stephone

及胚胎學(xué)家Edwards1.試管動(dòng)物的體外受精

一般將成熟的卵母細(xì)胞和獲能的精子在一個(gè)合適的體外環(huán)境條件下共同培養(yǎng)一段時(shí)間，就能完成體外受精。受精成功的標(biāo)志至少是看受精卵是否可以發(fā)育至囊胚期階段。2.人工授精不同于試管動(dòng)物制備時(shí)的人工受精，它不需從供體獲得精子和卵子，經(jīng)過(guò)成熟培養(yǎng)后受精。一般情況下，經(jīng)過(guò)超排卵處理的母體動(dòng)物在停藥后24-48小時(shí)內(nèi)有95%的母畜表現(xiàn)發(fā)情，在觀察到發(fā)情的當(dāng)日上午和下午或夜晚和次日晨進(jìn)行人工授精兩次。1980年6月澳大利亞,1981年12月美國(guó)、1983年10月日本1985年4月我國(guó)臺(tái)灣1986年12月香港

我國(guó)大陸第1例試管嬰兒于1988年3月10日,誕生于北京醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科,其創(chuàng)始人為張麗珠教授試管嬰兒技術(shù)發(fā)展的三個(gè)階段

由于體外授精技術(shù)方法不同，可分為3種孕育胎兒：第一代傳統(tǒng)的體外受精－胚胎移植(IVF－ET)“試管嬰兒”，第二代卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）”試管嬰兒”，第三代種植前遺傳診斷(PGD)“試管嬰兒”。

第一代“試管嬰兒”

多種激素類藥物－－－女方超排卵在陰道超聲引導(dǎo)下，經(jīng)陰道后穹隆穿刺吸卵。取出后的卵子在一定條件下與精子共同培養(yǎng)、受精，經(jīng)過(guò)48小時(shí)左右便可發(fā)育成早期胚胎。將2-4個(gè)胚胎送回母體子宮內(nèi)。由于都是在玻璃培養(yǎng)皿及試管中進(jìn)行的，故以這種助孕技術(shù)出生的嬰兒稱——“試管嬰兒”。

該技術(shù)主要用于因女性導(dǎo)致的不育。當(dāng)女方卵子不能通過(guò)輸卵管受精并運(yùn)送到子宮腔時(shí)，“試管嬰兒”便成為唯一獲得生育機(jī)會(huì)的選擇。對(duì)于卵巢功能喪失或切除或有遺傳性疾病的患者，可采用供者卵子做“試管嬰兒”，對(duì)于子宮切除或發(fā)育不良的患者，則可取其卵子與丈夫精子進(jìn)行體外授精后將早期胚胎植入代孕婦女子宮內(nèi)發(fā)育并分娩。第二代“試管嬰兒”

第二代是卵胞漿內(nèi)單精子注射“試管嬰兒”(ICSI)與第一代傳統(tǒng)“試管嬰兒”技術(shù)區(qū)別在于，它不是將許多卵子與數(shù)百萬(wàn)-上億精子在體外直接混合培養(yǎng)，而在顯微鏡及微操縱儀下，用特制的微穿刺針將單個(gè)精子注射到一個(gè)發(fā)育成熟的卵子胞漿內(nèi)，其他過(guò)程都與傳統(tǒng)“試管嬰兒”相同。

為嚴(yán)重的男性不育患者帶來(lái)了福音

嚴(yán)重的少精、弱精、畸形精子癥患者，輸精管道先天或后天缺損、阻塞或手術(shù)切除造成的阻塞性無(wú)精癥患者第三代“試管嬰兒”

第三代“試管嬰兒”技術(shù)即是對(duì)種植前的早期胚胎進(jìn)行遺傳診斷(PGD)，有問(wèn)題的胚胎棄之，只把正常胚胎移入子宮內(nèi)防止遺傳病患兒的出生。在胚胎植入母體之前，應(yīng)用分子學(xué)技術(shù)或熒光原位雜交方法測(cè)定DNA片段或特定染色體,將診斷無(wú)遺傳病的胚胎移植入子宮，

保證妊娠胚胎正常。試管嬰兒技術(shù)主要技術(shù)步驟超排卵卵泡監(jiān)測(cè)與取卵精子的優(yōu)選與處理體外受精(IVF)胚胎的體外培養(yǎng)及挑選胚胎移植(ET)移植后護(hù)理著床前準(zhǔn)備胚胎著床前遺傳學(xué)診斷(PGD)

透明帶下人工受精術(shù)(SUZI)

此方法是將單個(gè)或多個(gè)精子直接注射到透明帶下卵細(xì)胞膜外的卵黃周隙(PVS),讓精卵受精,再移植宮內(nèi)妊娠分娩。注射精子的數(shù)目一般多平均為3-5個(gè)精子,因?yàn)樽⑸涞木釉蕉?受精率高。此方法對(duì)卵的損傷不大，且多精受精率不高，目前已被較多地采用。卵細(xì)胞內(nèi)注射精子受精術(shù)(ICSI)此方法是將精子直接注入卵細(xì)胞內(nèi),省略了受精過(guò)程的一系列變化,如精子與透明帶的結(jié)合、穿透,精卵細(xì)胞膜的融合等。有利于受精的完成,特別適用于少弱精患者。而且受精之前無(wú)需對(duì)精子特殊處理,精子不需要發(fā)生頂體反應(yīng),并克服了多精受精無(wú)法控制問(wèn)題。該方法對(duì)卵的損傷大于上述二種方法。許多學(xué)者對(duì)ICSI試管嬰兒的產(chǎn)科結(jié)局畸形率和核型進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ICSI和常規(guī)體外受精試管嬰兒在產(chǎn)科結(jié)局上沒(méi)有差異。

人工受精胚胎的體外培養(yǎng)及挑選

卵子和精子受精后,置于有一定濃度共培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的條件培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)。胚胎的挑選,大多學(xué)者主張精卵受精后經(jīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)2～3天，形成8～16細(xì)胞胚卵，然后根據(jù)胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分，挑選Ⅰ-Ⅱ級(jí)胚胎進(jìn)行移植。

胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ級(jí):細(xì)胞大小均勻,形狀規(guī)則,胞質(zhì)均勻清晰,無(wú)碎片。Ⅱ級(jí):細(xì)胞大小略不均勻或形狀略不規(guī)則,胞質(zhì)有顆?，F(xiàn)象,碎片<20%。胚胎移植(ET)大多數(shù)主張?jiān)?～16細(xì)胞時(shí)移植。即受精卵培養(yǎng)2～3d移植,為控制多胎妊娠,所以一般移植2～4個(gè)Ⅰ-Ⅱ級(jí)胚胎較合適。移植操作：用很細(xì)的導(dǎo)管經(jīng)宮頸進(jìn)入子宮，然后將胚胎經(jīng)過(guò)該導(dǎo)管注入宮腔內(nèi)。代理母親代理母親（Surrogatemother）指出借或出租自己子宮代替他人生育后代的婦女。在某些發(fā)達(dá)國(guó)家已發(fā)展成為一種新興的行業(yè)。愿意出租子宮的婦女情況：

——希望體驗(yàn)懷孕和生孩子的滋味；

——由于曾經(jīng)過(guò)流產(chǎn)，包著“贖罪”心理想替別人生一個(gè)孩子

——出于經(jīng)濟(jì)考慮。胚胎著床前遺傳學(xué)診斷(PGD)著床前遺傳學(xué)診斷是避免遺傳病兒出生,達(dá)到優(yōu)生目的的重要手段。PGD是在胚胎移植到子宮之前確定其遺傳物質(zhì)是否正常；卵裂期,對(duì)受精后第3天8～12細(xì)胞階段的卵裂球進(jìn)行活檢;胚期:對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞活檢可取得較多的細(xì)胞供遺傳學(xué)診斷,增加了診斷的可靠性。目前PGD方法主要有兩種:聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)。試管嬰兒技術(shù)的展望

IVF-ET技術(shù)已日漸完善,適用于各種不孕癥的治療,但成功率有待進(jìn)一步提高?？蓛?yōu)選促排卵藥物；不斷改進(jìn)體外受精技術(shù)；改善胚胎體外培養(yǎng)條件；進(jìn)行良好的胚胎體外培養(yǎng);對(duì)胚胎進(jìn)行著床前遺傳學(xué)診斷,避免遺傳病兒出生；隨科學(xué)技術(shù)水平不斷提高,能使IVF-ET妊娠成功率進(jìn)一步上升,為不孕家庭帶來(lái)幸福和歡樂(lè)。結(jié)語(yǔ)

生殖使生命過(guò)程得到無(wú)限的延續(xù)，同時(shí)，有性生殖產(chǎn)生的后代具有雙親的優(yōu)點(diǎn)，使生物體不斷進(jìn)化。由于有了生命的存在，從而有了豐富多采的世界。人類輔助生育技術(shù)為廣大不育患者帶來(lái)了極大的福音，也給人類帶來(lái)了新的思考！話說(shuō)克隆

一、胚胎分割二、胚胎細(xì)胞克隆三、體細(xì)胞克隆四、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆話說(shuō)克隆胞胎分割是克隆嗎？體細(xì)胞克??？胚胎細(xì)胞克??？人類胚胎克??？轉(zhuǎn)基因動(dòng)物克隆？從多胞胎現(xiàn)象談起正常的胚胎發(fā)育動(dòng)物克隆

是指由一個(gè)動(dòng)物經(jīng)無(wú)性繁殖或孤雌生殖而產(chǎn)生出的遺傳構(gòu)成完全相同的多個(gè)后代動(dòng)物。動(dòng)物克隆的方法

目前看，比較現(xiàn)實(shí)可行的生產(chǎn)哺乳動(dòng)物克隆的方法主要有胚胎分割和細(xì)胞核移植兩種。