蠶絲蛋白制備工藝研究

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11蠶絲蛋白制備工藝研究【摘要】：植桑養(yǎng)蠶是我國一些地區(qū)的傳統(tǒng)產業(yè)，在養(yǎng)蠶過程中得到大量的蠶繭。20世紀80年代初以來，對蠶繭開始進行深度加工的研究，其中含有豐富的絲膠、絲素、多肽蛋白等成分在食品和醫(yī)藥工業(yè)中有廣泛的用途。為了合理利用蠶繭資源，本論文主要研究了提取絲膠的新工藝，以指導工業(yè)生產。即以蠶絲為原料，在堿性條件下加熱水解提取了蠶絲蛋白。其優(yōu)化的提取條件為：溫度90～96℃、pH值11～12、水解時間3～4h?！娟P鍵字】：蠶絲絲膠絲素蛋白【引言】：蠶絲是一種高蛋白纖維，富含18種氨基酸，且其結構與人體皮膚相似。經水解后的絲蛋白相對分子量減小、滲透力增強，可加速細胞的新陳代謝，使肌膚富有光澤、增加彈性。同時具有很好的保濕、抗皺、潤膚、抑制黑色素的生成及防止化學損害的作用。將蠶絲水解液作營養(yǎng)添加劑加入化妝品中，能讓肌膚感覺清爽自然，另外，蠶絲蛋白可以廢繭絲作為原料，成本低廉，不含生理活性成分，來源充足。因此，將蠶絲蛋白提取分離并應用于化妝品行業(yè)已成為國內外普遍研究的課題，并已達到了實用化程度。此外，蠶絲水解液在醫(yī)療保健、美容、食品、酶工程等方面也具有廣闊的應用前景。絲膠是球狀蛋白，可從下繭，廢絲中經高溫脫膠，濃縮，干燥制得，也可從絲綢制造廠家排放的廢水中大量提取，絲膠二級結構主要以無規(guī)卷曲結構為主和部分β構象，含有74．61％的極性側鏈氨基酸，絲膠具有良好的吸放濕性能，抗氧化性，營養(yǎng)及保健功能，可用作合成纖維的滌層材料，化妝品和食品的添加劑，還可在醫(yī)藥，固定化酶載體，高分子材料和水泥漿添國劑等方面被開發(fā)利用，回收利用絲膠，對保護環(huán)境和增加經濟效益具有重要意義。天然蠶絲由絲素和被覆在其外部的膠質物質兩部分組成，前者是蠶絲蛋白的主要成分，約占總重量70％，后者主要是絲膠蛋白，占總重量的25％，其余約5％是雜質部分，主要包括碳水化合物、色素、鹽和蠟質等。絲素和絲膠蛋白均由18種氨基酸組成，但氨基酸組成完全不同。絲素蛋白中包含的l8種氨基酸以甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸為主，極性氨基酸僅占18％左右。這種絲素蛋白作為人工皮膚和醫(yī)用組織工程材料正在研究與開發(fā)。而絲膠蛋白的氨基酸組成則不同，極性氨基酸占多數(shù)，且以絲氨酸和天冬氨酸為主，非極性氨基酸只占22％。目前，絲膠蛋白已在高級化妝品、醫(yī)用生物材料和表面活性改性材料等方面得到廣泛應用。絲膠蛋白的廣泛應用主要歸功于它所具有的多種生物活性，主要包括抗氧化、美白、促進細胞有絲分裂和增殖、作為細胞培養(yǎng)的基質、促進微量元素吸收、抗紫外線、防癌等。在上述生物活性的試驗中所用的絲膠蛋白樣品，有的是利用碳酸鈉、中性皂等水溶液煮沸而獲得的脫膠液，經過24-48h水透析而獲得的絲膠溶液及其凍干粉作為試驗材料，這種純化處理并不能保證試驗樣品是單一的絲膠蛋白，也就是說，可能吸附在絲膠蛋白上的一些繭層小分子物質特別是具有生物活性的黃酮類物質沒有完全被除去。還有些試驗用絲膠樣品是用普通水或高溫高壓水處理后獲得的脫膠液，直接干燥制成的絲膠肽及其水解物作為試驗樣品，這些樣品中也含有黃酮類物質。目前市場上用于化妝品、護膚品和護發(fā)品等領域的絲膠粉末，大多是從繭殼或繭衣脫膠后經過酶解，沒有經過進一步的純化就直接噴霧干燥制成，同樣，這些產品中仍可能含有黃酮類物質。目前已有報道彩色繭的繭層中含有葉黃素、一胡蘿卜素等活性物質，新開發(fā)的家蠶熒光判性蠶繭品種的繭層中含有多種紫色熒光色素和黃色熒光色素，特別是大造繭層中含有許多黃酮類色素，這些物質都具有諸多生物活性。由于研究人員用的蠶繭品種、絲膠制備與純化方法各不相同，很難比較和確定絲膠蛋白哪些成分具有真正的生物活性。因此，本試驗使用了5種蠶繭品種(普通蠶繭、金黃繭、熒光判性雌雄蠶繭和大造繭)，利用高溫高壓水脫膠的方法，制成水溶性絲膠蛋白溶液，經過酒精反復沉淀來制備純化的絲膠蛋白樣品，以確保完全除去繭層上某些小分子物質，最后分別測定5種純化絲膠樣品的體外生物活性。1、蠶絲及其成分性質的組成國內外學者對蠶絲蛋白結構進行許多研究和探討，但由于蠶絲蛋白結構的復雜性而后易變性，致使研究結果互不相同，甚至相差很大。蠶絲中蛋白含量高達98％以上，主要是由兩條絲素和周轉覆蓋的絲膠兩部分組成。根據資料調查，蠶絲的組成，含有絲素70％～80％，絲膠20～30％，乙醚浸出物0.4％～0.6％，酒精浸出物1.2％～3.3％，礦物質1.0％～1.7％。絲素的氨基酸組成和絲膠有一定差別，以蠶絲中絲素和絲膠的氨基酸組成為例，見表1．11．1絲素絲素又稱絲心，是蠶絲的主體部分，是具有結晶結構的蛋白質，有18種氨基酸組成，其中7％左右為人體所必需的8種必需氨基酸。絲素的氨基酸組成結構簡單，并且組成多肽分子后分子問容易斂集，所以有一定結晶性，其結晶度在50％左右。絲素中極性側基約占29.5％，非極性占70.5％，兩者比為O.42，而絲膠中兩者比為2.91，兩者差別較大，這也是絲膠易溶于水而絲素不溶于水且具有一定強度的根本原因。其中側基為簡單的甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸約占總數(shù)的85％，三者摩爾比為4：3：1，并且按一定的序列結構排列成較為規(guī)則的鏈段。這些鏈段大多位于絲素蛋白的結晶區(qū)域，而帶有較大側基的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等主要存在于非結晶區(qū)域。絲素中蛋白的構象主要以無規(guī)則線團為主，還有少量。轉角、螺旋等，其分子量普遍認為在3.6～3.7×范圍。在水中只發(fā)生膨脹而不溶解，亦不溶于乙醇。圖1.SEQ圖1.\*ARABIC1蠶絲中絲素和絲膠的氨基酸組成名稱絲素絲膠甘氨酸丙氨酸亮氨酸異亮氨酸苯丙氨酸蛋氨酸色氨酸脯氨酸胱氨酸絲氨酸蘇氨酸天門冬氨酸谷氨酸組氨酸賴氨酸精氨酸41.8727.030.320.310.660.70.60.340.312.450.581.231.290.360.711.8313.754.90.80.911.070.870.51.40.233.318.71919.623.251.910.873.58長期以來，人們認為其分子是以Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-X(X是包含Ser殘基的其他的氨基酸殘基)的氨基酸排列順序的重復構造為主體的一根長鏈分子。但近幾年來隨著絲素蛋白分子生物學研究的進展，已認識到絲素蛋白是由大小兩個多肽鏈通過二硫鍵締合而成，大的叫重鏈(H鏈)，小的叫輕鏈(L鏈)。H鏈是由結晶區(qū)和非結晶區(qū)段交互排列構成，其親水區(qū)域中存在的2個Cys殘基與L鏈親水區(qū)域中的Cys殘基通過極性基團的相互作用而靠近，并最終締合在一起。在特定的處理條件下，絲素蛋白分子會發(fā)生無規(guī)則卷曲結構與折疊結構的相互轉變，其形態(tài)可相應的表現(xiàn)為纖維狀、粉狀、膜狀、凝膠狀以及溶液狀，而且這些形態(tài)之間可相互轉變。絲素不溶于酒精、乙醚、二硫化碳等溶劑之中，也不溶于水。但水溶劑對絲素不是沒有作用的，絲素也和其他蛋白質一樣，與水接觸，能吸收一定量的水分而膨化，其膨化度一般不超過30％～40％。其次在一些中性鹽如氯化鈉、硝酸鈉的稀溶液中，也能產生與水同樣的膨化作用。在另一些鹽，如鈣和矽的氯化鹽、溴化鹽、硝酸鹽氯化鋅等濃熱溶液中，幾分鐘內就完全熔化。絲肽是絲素蛋白水解的中間產物，絲素水解可采用酸法、堿法以及酶法得到絲肽。絲肽的氨基酸組成與蠶絲中的絲素組成基本相同，主要是由Cly、Ala、Ser、Try組成，這4種氨基酸含量總和占其氨基酸總量的88.4％，這是絲素多肽氨基酸組成的特征，其分子構象為無規(guī)則卷曲結構，且無序疏松結構。絲肽中含有多種氨基酸，其中人體所必需的八種氨基酸幾乎全有，其含量約占氨基酸總量15％左右，而絲肽具有水溶性，極易被人體吸收，特別是絲肽組成中的Ser、Lys、Asp、Arg、Glu都是皮膚的營養(yǎng)要素。絲肽分子量分布在300～20000一個很廣的范圍，由于絲肽多肽鏈比絲素要短的多，所以其分子量亦必然要比絲素小?？刂菩Q絲的水解程度，可得到不同分子量的絲肽。絲肽分子量在300左右，其水溶性最好，分子量在2000以下，其水溶性良好，當絲肽分子量最高達400～5000，絲肽基本上以大分子聚合肽的形態(tài)出現(xiàn)，水溶性較差，放置穩(wěn)定性亦隨之變差。另外平均分子量低于1000的絲肽，味道可口，可直接食用，而分子質量在lOO～5000的絲肽具有良好的保濕性、分散性和溶解性，用于冰淇淋中具有很好的起泡性、持泡能力和保香性，并使口感良好。高純度的絲肽在冷水中的溶解度非常大，而絲素只在水中發(fā)生膨潤而不溶解，其主要原因是由于絲肽與絲素的分子構象不同所引起的。從圓色光譜分析來看，絲肽分子以無規(guī)則卷曲結構為主，而絲素分子的構象為反平行的折疊為主。兩者構象不同的原因是絲肽的制得必須要用強極性的濃鹽溶液溶解絲素，在溶劑溶解絲素過程，在數(shù)量眾多強極性離子的強烈的水化作用下，水分子不僅能進行絲素的非結晶區(qū)，而且還能進入結晶區(qū)，削弱了多肽鏈間的范德華力，溶劑化的作用還可以用絲素大分子的多肽鏈部分發(fā)生斷烈，這些強極性的濃度溶液使絲素發(fā)生無限膨潤而成粘稠溶液，同時又破壞了絲素緊密有序的聚集態(tài)結構，使之變?yōu)槭杷蔁o序結構。1．2絲膠被覆絲素外層的是絲膠，絲膠在蠶體內對絲素的流動起潤滑劑作用，在繭絲中對絲素起到保護和膠粘作用，約占繭層質量的30％。除含少量蠟質、碳水化合物、色素和無機成分外，主要成分為絲膠蛋白，絲膠是一種球狀蛋白，相對分子質量為1．4～31．4萬，其中Ser、Alp、Gly含量較高，相對質量分別達到33.4％、16.17％和13.49％。絲膠的2級結構以無規(guī)則卷曲為主，并含部分構象，幾乎不含螺旋結構，故絲膠分子空間結構松散、無序。在絲膠的氨基酸組成中含大量的絲氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸等羥基和羧基的氨基酸，因此絲膠表現(xiàn)出較好的水溶性和吸水性，可在水中膨潤溶解。將溶于水的絲膠在自然條件下放置，可得到可逆性的絲膠凝膠。在液膠向凝膠轉化的過程中，伴隨著部分無規(guī)卷曲向構象的不可逆轉化，凝膠強度與凝膠的濃度呈正比。絲膠向凝膠轉化的過程中，伴隨著部分無規(guī)卷曲向構象的不可逆轉化，凝膠強度與凝膠的濃度呈正比。絲膠能抑制酪氨酸酶和多酚氧化酶的活性，其機理可能是由于絲膠中高比例的羥基氨基酸與微量元素如銅、鐵的絡合，從而影響了酶活性的正常發(fā)揮。在酪氨酸、組氨酸等堿性氨基酸中，極性側鏈氨基酸占74.16％。此外，絲膠在水中的溶解度與壓力溫度有關，加壓加熱比常壓加熱溶解度高，在2.5～3.O個氣壓下加熱3h，蠶絲即可全部脫膠；其次，絲膠的溶解度與溫度亦成正比，溫度在60℃以下，絲膠溶解度小，60℃以上，溶解度則顯著增加。當溫度達到100℃時，蠶絲可脫膠完全，但所需時間較長；溫度提高到105℃時，溶解度顯著增加；110絲膠溶解度的大小，還決定介質的反應。在酸性和堿性尤其是堿性溶液中，溶解度急劇增加。這因為絲膠是一種具有兩性反應的蛋白物質，能與酸和堿結合而成更高度溶劑化的可電離鹽，即使是應用pH為9.5～lO.O的弱堿溶液，蠶絲也能在95～100℃時很快達到脫膠的目的。絲膠對蛋白分解是不穩(wěn)定的，這點與絲素不同，因而也是絲膠與絲素區(qū)別的一種征象。絲膠溶液的等電點在pH3.9～4.3之間，絲膠雖然是兩性物質，但酸性基比較強，絲膠溶液是弱酸溶液。1.3其他成分除上述的幾種主要成分外蠶絲還含有少量的無機物、蠟質物、碳水化合物和色素。其中無機物指生絲燃燒后所殘留的灰分物質；蠟質物指高級醇和脂肪酸所形成的脂和石蠟的化合物，它在蠶絲中含量甚微，存在于絲膠內層和絲素外層，約有0.19～1％，不溶于冷水，溶于酒精和乙醚，故也稱為乙醚浸出物；碳水化合物大多與絲膠結合，在蠶絲絲膠中平均約含1.45％，蠶繭絲膠中含2.4％，絲素中含0.3％；色素主要存在于絲膠中，絲素中有極微量的殘留色素，一般有色繭色素多，白色繭色素少。2、蠶絲蛋白的結構被覆于絲素外圍的絲膠層，約占繭層質量的25％，對絲素起到保護和膠粘作用，除含少量蠟質、碳水化臺物、色素和無機成分外，主要成分為絲膠蛋白(通常稱為絲膠)。絲膠是一種球狀蛋白，相對分子質量為1.4～31.4萬，由18種氨基酸組成，其中絲氨酸(Ser)、天門冬氨酸(Asp)和氨酸(Gly)含量較高，相對質量分別達到33.43％、16.71％和13.49％。絲膠的二級結構以無規(guī)卷曲為主，并含有部分構象，幾乎不含螺旋結構。接近絲素的內層絲膠中含口結構的比例相對外層絲膠來說要高，但外層絲膠在環(huán)境條件特別是濕度的影響下，部分無規(guī)卷曲能向結構發(fā)生不可逆轉化。通過對絲膠基因ser1進行序列分析，確定其9個外顯子中有2個外顯子含有由114個枝苷酸(相當于38個氨基酸殘基)為重復單位組成的構造．該重復構造中絲氨酸密碼子約占40.8％，其編碼的肽極有可能形成折疊和轉角，因此推測絲膠中也可能含有類似于絲素的結品區(qū)。對絲膠的組成，因研究的角度不同，采用的方法和手段不同，因此得到的結果也不盡相同。金子英雄用鹽析方法分離絲膠得到易溶性的A與難溶性的B兩種絲膠。清水正德提出控制不周的時間，將繭層加水煮沸，分離出三種溶解性不同的絲膠。小松計一?在清水正德工作的基礎E，運用紫外分光光度法進行分析，提出繭絲中存在四種絲膠(分別稱為絲膠I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ)的觀點。涉川明朗從組織學的角度將絲膠區(qū)分為3種，分別稱為內、中、外層墼膠。蒲生卓磨等將中部絲腺切成5個部分，從各部分抽出蛋白質，進行凝膠電泳，分離出相對分子量不同(8～30萬)的5種多肽。從基因表達的角度來看，目前已有5種絲膠基因被克隆和部分測序，共分離到由這5種絲膠基固轉錄的9種mRNA，因此絲膠可能含有9種多肽。3、蠶絲的應用長期以來,蠶絲的主要價值體現(xiàn)在紡織工業(yè)上,最近幾年對它的不斷研究、開發(fā),它的應用范圍已涵蓋食品、醫(yī)藥、精細化工、生物技術等諸多領域,如應用于手術后的縫合線、涂料、化妝品、藥物的緩慢釋放、分離膜及生物活性物的固定化和生物傳感器的制作等。3.1共混紡絲作者通過用絲素蛋白和聚丙烯腈共混在NaSCN水溶液進行濕法紡絲,成功地紡制出絲素白含量為15%的絲素蛋白2聚丙烯腈共混復合纖維,纖維的力學性能達到常規(guī)服用纖維的要求,纖維的外觀光澤和手感與蠶絲的相似。纖維的吸濕性能較腈綸有一定的改善,染色性能也得以增強,使纖維的染色品種大大擴展,陽離子染料、酸性染料等都用于復合纖維的染色,并且均可以得到一定深度的色譜。3.2酶的固定化和生物傳感器雖然許多高分子材料應用于酶生物傳感器的制作,蠶絲素蛋白作為一種酶的固定基材,其最為突出的優(yōu)點在于酶的固定化基于它從水溶性的SilkⅠ結構轉變?yōu)榉€(wěn)定的水不溶SilkⅡ結構,而不需要任何交聯(lián)劑,只要改變溶劑、溫度等因素就能達到。Fukui研究小組首次報道蠶絲用于葡萄糖苷酶(glucosidase)的固定化[59],在1987年開始,Asakura研究小組進行了用活蠶腺體中得到的絲素蛋白固定葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase)。作者研究小組于1991年開始用活蠶腺體中得到的絲素蛋白研究酶的固定化工作,制得了第一代葡萄糖生物傳感器和脲酶電極。為了縮短傳感器的響應時間和克服活蠶來源受季節(jié)影響的限制,作者把再生絲素蛋白應用于酶的固定化和生物傳感器的制作,并用紅外光譜、電子吸收光譜和掃描電鏡觀察酶在絲素蛋白膜中的形態(tài),發(fā)現(xiàn)酶與絲素蛋白之間的相互作用很弱,它們以聚集態(tài)的形式存在。但是,再生絲素蛋白在有機體系中或在干燥狀態(tài)下容易變脆,影響使用。為了克服這個缺陷,作者采用了絲素蛋白和聚乙烯醇共混物來固定酶,發(fā)現(xiàn)此共混的致密均質膜應用于葡萄糖生物傳感器其響應速度較慢,為此制備了多孔膜,其響應時間隨膜的孔隙增多而縮短,但其檢測范圍基本不變,使用壽命和重現(xiàn)性等性能也幾乎與用再生絲素蛋白和葡萄糖氧化酶的共混膜制得的電流型葡萄糖生物傳感器的相同,它也可以用于固定過氧化物酶,由此可見,再生絲素蛋白和它與聚乙烯醇共混物作為酶的固定化材料具有廣泛的應用前景。3.3智能性水凝膠4、實驗4．1蠶絲結構及其水解原理蠶絲由絲素蛋白(Fibroin)和絲膠(Sericin)兩部分組成。絲素蛋白是蠶絲中的主要組成部分，約占質量的，絲膠包在絲素蛋白的外部，約占質量的25％，此外還含有5％左右的雜質。絲素蛋白中包含18種氨基酸，水溶性良好，分子量很高，其構象可分為SilkI和SilkII結構。SilkI結構包括無規(guī)線團和a螺旋，SilkⅡ結構呈反平行0折疊，兩者均可通過改變溫度、溶液pH值和應力作用加以轉變。根據此原理，本實驗在一定的溫度、pH值條件下，將蠶絲水解成游離的氨基酸、二肽和三肽的混合物，使絲蛋白分子量減小、滲透力增強，能很快地被皮膚同化吸收，從而成為一種優(yōu)良的營養(yǎng)添加劑。4．2主要材料及儀器篩選上好的蠶絲，經預處理后備用。NaOH(或KOH)試劑等。玻美計、玻璃棒、電加熱器、反應器(搪瓷襯里)、溫度計、天平、真空抽濾裝置等。在實驗過程中，pH值一定時，溫度直接影響著水解液的收率和顏色。較高的溫度可使蠶絲水解速度加快，但是水解后的絲蛋白顏色呈深棕色且水分蒸發(fā)較快。溫度較低時在同樣時問里水解不完全、收率低。因此，控制水解溫度在95～100℃，可得到金黃色的絲蛋白水解液。4．3分離提取過程稱取備用的蠶繭或蠶絲，計量，將其放人搪瓷反應器中，加入適量去離子水，加熱、加堿，并不斷調節(jié)pH值，使蠶絲充分水解，然后冷至常溫，調其玻美度、脫色、除雜、抽濾、貯存?zhèn)溆谩?、結果及討論在實驗過程中，pH值一定時，溫度直接影響著水解液的收率和顏色。較高的溫度可使蠶絲水解速度加快，但是水解后的絲蛋白顏色呈深棕色且水分蒸發(fā)較快。溫度較低時在同樣時問里水解不完全、收率低。因此，控制水解溫度在95～100℃，可得到金黃色的絲蛋白水解液。5.1pH值對蠶絲水解液收率的影響（圖1）圖5.SEQ圖5.\*ARABIC1不同溫度時的收率在水解過程中，pH值的大小直接影響著蠶絲水解的收率，經反復實驗，蠶絲在酸性或中性條件下幾乎不能水解，在堿性條件下可快速水解。堿性越強，絲蛋白水解速度越快、收率越高。控制pH值在1l～12，可使收率達到80％。由實驗可知在pH值一定的條件下，反應時問愈長，蠶絲蛋白水解量越大，但水解液顏色也愈深，收率也并不是隨水解時間越長越高。因此選擇水解4h，可使收率達到80％。5．2水質對水解液的影響（圖2）圖5.SEQ圖5.\*ARABIC2不同pH值時的收率通常自來水中含有鈣、鎂、鈉鹽等雜質，它們不僅破壞蠶絲蛋白周圍的水膜，同時又影響了蛋白分子的電荷。因此，會使蛋白沉淀，發(fā)生鹽析現(xiàn)象，還會導致水解不徹底，影響產品的收率。所以在水解過程中一定要使用精制純水或蒸餾水。5．3設備對絲蛋白水解液質量的影響（圖3）圖5.SEQ圖5.\*ARABIC3不同水解時間時的收率設備也是影響收率的因素之一，如果選用較好的搪瓷反應器，就會避免因高溫、強堿、水解時間較長而導致金屬化合物進入產品影響質量。5．4貯存方式對絲蛋白水解液質量的影響蠶絲中的絲素蛋白分子因含有一定量的羥基及其它結構，容易吸收紫外線而變性，對其性能有很大影響。實驗證明，隨照射時間的延長，絲素蛋白泛黃程度也增加，特別是在有水存在時，泛黃更為嚴重，因此，為了避免水解飯顏色的加深，應避光貯存。要想獲得亮度好的金黃色透明蠶絲蛋白水解液，除了控制好pH值以外，還應盡量縮短水解時間、降低水解溫度、選擇質量好的搪瓷襯里反應器并用去離子水或蒸餾水避光貯存。5．5樣品分析經反復對比實驗，篩選出4個樣品，分析結果如表1所示。表5.SEQ表5.