培訓(xùn)一各種引物設(shè)計

培訓(xùn)大綱一引物設(shè)計1.

普通基因或者片段擴增引物2.熒光定量PCR引物3.適用于酶切載體構(gòu)建和Gateway載體構(gòu)建的引物設(shè)計4.RNAi載體構(gòu)建的引物5.亞細(xì)胞定位的載體構(gòu)建二基因克隆1.普通PCR2.長片段及短片段克隆3.平末端，黏性末端克隆三TA克隆，Ecoil轉(zhuǎn)化四質(zhì)粒提取五載體構(gòu)建1.酶切載體構(gòu)建及驗證2.Gateway載體構(gòu)建及驗證3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化（發(fā)根，根癌）六轉(zhuǎn)基因及功能驗證七苜蓿毛狀根轉(zhuǎn)化八菌根染色觀察，顯微鏡使用當(dāng)前第1頁\共有27頁\編于星期三\22點基因定義基因組DNAcDNARNA提取當(dāng)前第2頁\共有27頁\編于星期三\22點1.家族基因。是指具有相同功能的，不同基因。2.轉(zhuǎn)錄本。是指一個基因有兩個不同的轉(zhuǎn)錄結(jié)果。都來自于一個基因，由于選擇性剪切導(dǎo)致的。當(dāng)前第3頁\共有27頁\編于星期三\22點基因擴增PCR體系：酶，緩沖液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F，R。Forward,ReF引物R引物當(dāng)前第4頁\共有27頁\編于星期三\22點流程1.模板準(zhǔn)備，引物準(zhǔn)備2.PCR擴增3.片段回收4.連接TA克隆5.轉(zhuǎn)化大腸桿菌6.測序，確定序列7.提質(zhì)粒，保存菌液（15%-30%甘油）當(dāng)前第5頁\共有27頁\編于星期三\22點序列尋找參考基因組網(wǎng)站：甜橙（Citrussinensis）。柑橘菌根模式：枳殼（Poncirustrif.），做為砧木，使用范圍最廣，抗寒。苜?；蚪M：/cgi-bin/medicago/overview.cgi?；蜓芯壳闆r。當(dāng)前第6頁\共有27頁\編于星期三\22點1.枳殼中基因，做亞細(xì)胞定位克隆啟動子（用DNA）ATG前2kb，基因序列（用RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA）。2.對應(yīng)到苜蓿中基因，做RNAi功能驗證，熒光定量PCR驗證。（用cDNA克?。┊?dāng)前第7頁\共有27頁\編于星期三\22點引物設(shè)計原則1、長度：15—30bp，其有效長度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產(chǎn)物的特異性。2、G十c含量：應(yīng)在40%一60%之間，PCR擴增中的復(fù)性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。3.Tm53-603、堿基分布的隨機性：應(yīng)避免連續(xù)出現(xiàn)4個以上的單一堿基。尤其是不應(yīng)在其3’端出現(xiàn)超過3個的連續(xù)G或C，否則會使引物在G十C富集序列區(qū)錯誤引發(fā)。4、引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發(fā)夾樣二級結(jié)構(gòu)。5、引物之間：兩個引物之間不應(yīng)有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應(yīng)避免3’端的互補重疊。6、上下游引物的互補性：一個引物的3‘末端序列不允許結(jié)合到另一個引物的任何位點上。7、3’末端：如果可能的話，每個引物的3‘末端堿基應(yīng)為G或C。8、引物應(yīng)當(dāng)超出限制性內(nèi)切酶識別位點至少3個核苷酸。示范。。。最普通的PCR引物設(shè)計。。。當(dāng)前第8頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第9頁\共有27頁\編于星期三\22點熒光定量PCR引物設(shè)計1.Tm60度。2.片段特異性。在基因組上，僅存在這一條片段，只能擴出這一條片段。選取3‘UTR區(qū)域。3.片段長度在60-100bp左右。當(dāng)前第10頁\共有27頁\編于星期三\22點酶切法構(gòu)建載體當(dāng)前第11頁\共有27頁\編于星期三\22點1.選擇載體上的酶切位點。保證所需要的基因片段中不包含此酶切位點。2.添加酶切位點和保護堿基。都添加到引物的5’端。當(dāng)前第12頁\共有27頁\編于星期三\22點Topo克隆當(dāng)前第13頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第14頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第15頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第16頁\共有27頁\編于星期三\22點Gateway反應(yīng)當(dāng)前第17頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第18頁\共有27頁\編于星期三\22點RNAi當(dāng)前第19頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第20頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第21頁\共有27頁\編于星期三\22點超表達載體當(dāng)前第22頁\共有27頁\編于星期三\22點RNAi引物設(shè)計1.片段長度：在300-500bp比較好。2.序列必須特異。特異到，20-21bp都沒有和其它基因匹配上的。當(dāng)前第23頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第24頁\共有27頁\編于星期三\22點當(dāng)前第25頁\共有27頁\編于星期三\22點亞細(xì)胞定位的