基因工程的基本操作程序

1.2基因工程的基本操作程序當前第1頁\共有69頁\編于星期三\2點復習1.什么是基因工程？2.基因工程的基本工具有哪些？3.基因工程的最大優(yōu)點？4.“分子手術(shù)刀”、“分子縫合針”和“分子運輸車”分別指什么？5.質(zhì)粒的本質(zhì)、特點是什么？載體的種類、必須具備的條件？當前第2頁\共有69頁\編于星期三\2點1.目的基因的獲取2.基因表達載體的構(gòu)建3.將目的基因?qū)胧荏w細胞4.目的基因的檢測與鑒定基因工程的基本操作分四個步驟有了目的基因，我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并可進行遺傳、表達和發(fā)揮作用載體進入受體細胞穩(wěn)定表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化才能確定目的基因是否真正在受體細胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達當前第3頁\共有69頁\編于星期三\2點一、目的基因的獲?。ㄒ唬┠康幕虻母拍睿壕幋a蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因,也可以是一些具有調(diào)控作用的因子（二）獲取目的基因的常用方法有哪些?1.從基因文庫中獲取2.利用PCR技術(shù)擴增3.人工合成當前第4頁\共有69頁\編于星期三\2點1.從基因文庫中直接獲取（1）基因文庫的概念：（2）基因文庫的分類:種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫（3）獲取目的基因的依據(jù)：當前第5頁\共有69頁\編于星期三\2點某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體（4）基因文庫的構(gòu)建方法限制酶與運載體連接基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接部分基因文庫（cDNA文庫）導入導入當前第6頁\共有69頁\編于星期三\2點①基因組文庫的構(gòu)建通過對受體菌的培養(yǎng)而儲存基因當前第7頁\共有69頁\編于星期三\2點②cDNA文庫的構(gòu)建-----反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。目的基因的mRNA單鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶雙鏈DNA(目的基因)當前第8頁\共有69頁\編于星期三\2點①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物_____復制_____________的核酸合成技術(shù)。

③條件：_______________________________、_____________________、_______________、________________________________②原理：________________④方式：以_________方式擴增，即____⑤結(jié)果：聚合酶鏈式反應(yīng)體外特定DNA片段DNA復制已知基因的核苷酸序列（前提）四種脫氧核苷酸一對引物耐熱的DNA聚合酶（Taq酶）指數(shù)2n使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴增2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因當前第9頁\共有69頁\編于星期三\2點⑥過程：a.DNA變性(90℃-95℃):雙鏈DNA模板在熱作用下，_______斷裂，形成__________。b.退火(復性55℃-60℃):系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。

c.延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下，從引物處延伸，合成與模板互補的_________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈當前第10頁\共有69頁\編于星期三\2點PCR技術(shù)擴增與DNA復制的比較PCR技術(shù)DNA復制相同點原理原料條件不同點解旋方式場所酶結(jié)果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化體外復制主要在細胞核熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內(nèi)的DNA聚合酶大量的DNA片段形成整個DNA分子當前第11頁\共有69頁\編于星期三\2點目的基因的mRNA單鏈DNA(cDNA）雙鏈DNA(即目的基因)反轉(zhuǎn)錄合成1）反轉(zhuǎn)錄法：以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA，從而獲得所需的基因。蛋白質(zhì)的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列目的基因推測推測化學合成2）根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法：3.人工合成目的基因當前第12頁\共有69頁\編于星期三\2點

1.下列屬于獲取目的基因的方法的是①利用mRNA反轉(zhuǎn)錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提?、芾肞CR技術(shù)合成⑤利用DNA轉(zhuǎn)錄形成⑥人工合成①

②

③⑤

B.①

②

⑤

⑥

C.①②③④

D.①②④⑥D(zhuǎn)當前第13頁\共有69頁\編于星期三\2點二、基因表達載體的構(gòu)建——基因工程的核心1.目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。啟動子插入基因表達載體復制原點抗生素基因終止子基因表達載體模式圖當前第14頁\共有69頁\編于星期三\2點2.基因表達載體的組成(1)啟動子(2)終止子(3)目的基因(4)標記基因等它們各自的作用是什么?啟動子插入基因表達載體復制原點抗生素基因終止子當前第15頁\共有69頁\編于星期三\2點知識點一原核細胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)：非編碼區(qū)原核細胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達的核苷酸序列，在該序列中，最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點。包括啟動子和終止子①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。當前第16頁\共有69頁\編于星期三\2點非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子啟動子:位于基因首端的一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì)。(以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落)終止子:位于基因尾端的一段特殊的DNA片斷，它能阻礙RNA聚合酶的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止。當前第17頁\共有69頁\編于星期三\2點真核細胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)：外顯子:能編碼蛋白質(zhì)的序列有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點等。編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子

外顯子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子:不能編碼蛋白質(zhì)的序列知識點二真核細胞的基因結(jié)構(gòu)當前第18頁\共有69頁\編于星期三\2點原核細胞真核細胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的原核細胞與真核細胞的基因結(jié)構(gòu)比較連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼當前第19頁\共有69頁\編于星期三\2點②在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶③合成第二條DNA鏈外顯子內(nèi)含子外顯子外顯子內(nèi)含子真核細胞的基因①在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA②在核內(nèi)內(nèi)含子被切去，外顯子彼此連接③在細胞質(zhì)中將mRNA分離并加入反轉(zhuǎn)錄酶④合成第二條DNA鏈基因的cDNA不含內(nèi)含子mRNA原核細胞的基因①在細胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)錄當前第20頁\共有69頁\編于星期三\2點啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)。終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄。標記基因：為了鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。啟動子插入基因表達載體復制原點抗生素基因終止子當前第21頁\共有69頁\編于星期三\2點質(zhì)粒DNA分子限制酶處理一個切口兩個黏性末端二個切口獲得目的基因DNA重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同一種3.過程:連接酶當前第22頁\共有69頁\編于星期三\2點①切割質(zhì)粒和目的基因的限制酶必須是同一種酶，以獲得相同的粘性末端，利于重組質(zhì)粒的構(gòu)建。②插入的目的基因只是結(jié)構(gòu)基因部分，其表達需要調(diào)控序列，因而用作載體的質(zhì)粒的插入部位前須有啟動子，后須有終止子。注意：當前第23頁\共有69頁\編于星期三\2點資料科學家在培育抗蟲棉時，起初把蘇云金芽孢桿菌的抗蟲基因插入載體質(zhì)粒中，然后導入棉花的受精卵中，結(jié)果抗蟲基因在棉花體內(nèi)沒有表達。啟動子插入基因表達載體復制原點抗生素基因終止子然后在插入抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因啟動子，導入棉花受精卵，長成的棉花植株還是沒有抗蟲能力。科學家又在有啟動子、抗蟲基因的質(zhì)粒中插入抗蟲基因終止子，導入棉花受精卵，結(jié)果成長的植株，有了抗蟲能力。

資料證明：載體構(gòu)建組成要完整當前第24頁\共有69頁\編于星期三\2點①載體與表達載體的區(qū)別：二者都有標記基因和復制原點兩部分DNA片段。表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu)②用到的工具酶：既用到限制酶切割載體，又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵③啟動子、終止子對于目的基因表達必不可少④目的基因不能單獨進入受體細胞，必需以表達載體的方式攜帶進去。注意當前第25頁\共有69頁\編于星期三\2點三、將目的基因?qū)胧荏w細胞(一)轉(zhuǎn)化：(二)轉(zhuǎn)化方法將目的基因?qū)胫参锛毎麑⒛康幕驅(qū)雱游锛毎麑⒛康幕驅(qū)胛⑸锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞目的基因進入________內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持________和_______的過程受體細胞穩(wěn)定表達當前第26頁\共有69頁\編于星期三\2點1.將目的基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ?/p>

易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力①農(nóng)桿菌特點：（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法當前第27頁\共有69頁\編于星期三\2點種子植物裸子植物被子植物雙子葉植物單子葉植物:松、柏、杉…:花生、大豆、棉花…:水稻、小麥、玉米…雙子葉植物－網(wǎng)狀脈單子葉植物－平行脈當前第28頁\共有69頁\編于星期三\2點②原理：Ti質(zhì)粒上的T---DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。當前第29頁\共有69頁\編于星期三\2點植物腫瘤當前第30頁\共有69頁\編于星期三\2點當前第31頁\共有69頁\編于星期三\2點③過程：④優(yōu)點：比較經(jīng)濟和有效Ti質(zhì)粒T-DNA攜帶外源基因的DNA構(gòu)建表達載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌含目的基因的重組Ti質(zhì)粒導入植物細胞植物細胞將目的基因插入染色體的DNA中表現(xiàn)出新性狀的植株農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法示意圖當前第32頁\共有69頁\編于星期三\2點Hind限制性酶ⅢHindIIIHindIII目的DNATi質(zhì)粒蘇云金桿菌構(gòu)建表達載體Bt毒素蛋白基因

蘇云金桿菌T-DNA(可轉(zhuǎn)移-DNA)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法的過程：目的DNAamp黏性末端在質(zhì)粒的tet基因內(nèi)切開目的DNA質(zhì)粒和外源DNA的HindⅢ限制性酶切示意圖DNA連接酶當前第33頁\共有69頁\編于星期三\2點脫分化導入植物細胞通過組織培養(yǎng)產(chǎn)生新個體再分化移植個體生物學水平的鑒定如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達導入植物細胞組織培養(yǎng)農(nóng)桿菌當前第34頁\共有69頁\編于星期三\2點（2）基因槍法：適合單子葉植物（3）花粉管通道法：如抗蟲棉目的基因子房花粉管通道法當前第35頁\共有69頁\編于星期三\2點2.將目的基因?qū)雱游锛毎俜椒ǎ猴@微注射法②程序：目的基因表達載體提純?nèi)÷眩ㄊ芫眩╋@微注射受精卵新性狀動物當前第36頁\共有69頁\編于星期三\2點3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎僭松锾攸c：繁殖快、單細胞、遺傳物質(zhì)少②方法：用Ca2+處理細胞感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合細胞吸收DNA分子感受態(tài)Ca2+處理法當前第37頁\共有69頁\編于星期三\2點

若通過基因過程生產(chǎn)人的糖蛋白可以用大腸桿菌作為工程菌嗎？

不可以，糖蛋白上的糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在真核細胞中，大腸桿菌是原核生物，細胞中不含這兩種細胞器。以酵母菌作為工程菌可以嗎?可以，酵母菌為真核生物（真菌類）當前第38頁\共有69頁\編于星期三\2點四.目的基因的檢測與鑒定——檢查是否成功檢測—(分子水平)鑒定———（個體水平）①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等方法——方法——方法——DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原-抗體雜交當前第39頁\共有69頁\編于星期三\2點（一）檢測1.檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因(關(guān)鍵步驟)①首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA②用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標記,以此做探針③使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交,若顯示出雜交帶,表明目的基因已插入染色體DNA中（1）方法:DNA分子雜交（2）過程:當前第40頁\共有69頁\編于星期三\2點目的基因片段非目的基因片段目的基因片段放射性標記基因探針基因探針目的基因的檢測示意圖當前第41頁\共有69頁\編于星期三\2點DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。當前第42頁\共有69頁\編于星期三\2點2.檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA①方法:分子雜交②過程:

用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交,若出現(xiàn)雜交帶,表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA當前第43頁\共有69頁\編于星期三\2點提取3.檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內(nèi)從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質(zhì)(抗原)

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)證明：提取蛋白質(zhì)與Bt毒素蛋白質(zhì)一樣當前第44頁\共有69頁\編于星期三\2點例:用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。（二）鑒定——個體生物學水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗當前第45頁\共有69頁\編于星期三\2點

不能，受體細胞必須表現(xiàn)出特定的性狀，才能說明目的基因完成了表達。受體細胞攝入DNA分子后就說明目的基因完成了表達嗎？若不能表達，要對抗蟲基因再進行修飾。當前第46頁\共有69頁\編于星期三\2點歸納:基因工程的基本操作程序1.獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成2.構(gòu)建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因3.將目的基因?qū)胧荏w細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、顯微注射法4.目的基因的檢測與鑒定檢測：分子水平；是否插入、轉(zhuǎn)錄、翻譯鑒定：個體生物學水平當前第47頁\共有69頁\編于星期三\2點1.有關(guān)基因工程的敘述正確的是A.限制酶只在獲得目的基因時才用B.重組質(zhì)粒的形成在細胞內(nèi)完成C.質(zhì)粒都可作為運載體D.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料D練習當前第48頁\共有69頁\編于星期三\2點2.基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計施工的。在基因操作的基本步驟中，不進行堿基互補配對的步驟是A.人工合成目的基因B.目的基因與運載體結(jié)合C.將目的基因?qū)胧荏w細胞D.目的基因的檢測和表達C練習當前第49頁\共有69頁\編于星期三\2點3.(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。(1)獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）aa當前第50頁\共有69頁\編于星期三\2點(2)將重組DNA分子導入水稻受體細胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和________________________________________。(3)由導入目的基因的水稻細胞培養(yǎng)成植株需要利用______________技術(shù)，該技術(shù)的核心是__________和_______________?；驑尫ㄖ参锝M織培養(yǎng)（花粉管通道法）脫分化再分化當前第51頁\共有69頁\編于星期三\2點(4)為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標記的_____________作探針進行分子雜交檢測，又要用______________________方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。耐鹽基因濃度鹽水澆灌一定當前第52頁\共有69頁\編于星期三\2點

4.（2009年天津高考改編）為從根本上解決水稻中的高植酸問題，可將植酸酶基因?qū)胨荆嘤椭菜徂D(zhuǎn)基因水稻品種。如圖是獲取植酸酶基因的流程。酵母菌DNAmRNAcDNAcDNA文庫基因組文庫含目的基因的菌株目的基因Ⅰ含目的基因的菌株目的基因Ⅱ提取提取構(gòu)建篩選篩選構(gòu)建ABC分離分離當前第53頁\共有69頁\編于星期三\2點

據(jù)圖回答：（1）圖中基因組文庫cDNA文庫。（2）B過程需要的酶是（3）目的基因和除可從構(gòu)建的文庫中分離外，還可以分別利用圖中和為模板直接進行PCR擴增，該過程中所用酶的顯著特點是（4）A、C過程中都是篩選獲取目的基因的過程，請說出篩選的依據(jù)大于逆轉(zhuǎn)錄酶DNAcDNA耐高溫可依據(jù)基因的相關(guān)信息（基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色體上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物及基因的表達產(chǎn)物等）獲取目的基因。當前第54頁\共有69頁\編于星期三\2點5.下列有關(guān)基因工程的敘述,正確的是(

)。A.載體上的標記基因有利于促進目的基因在受體細胞中表達B.用逆轉(zhuǎn)錄法合成胰島素基因時只能從胰島B細胞中提取相關(guān)的模板C.目的基因?qū)胧荏w細胞后,引起受體細胞的變異屬于基因突變D.限制性核酸內(nèi)切酶和DNA聚合酶是基因工程中兩類常用的工具酶B當前第55頁\共有69頁\編于星期三\2點6.利用生物工程的方法可以讓大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素。下面有關(guān)敘述錯誤的是(

)。A.在進行基因操作時,將人工合成的人胰島素基因連接到質(zhì)粒上,再轉(zhuǎn)移到大腸桿菌中B.人胰島素基因能夠在大腸桿菌體內(nèi)得以表達,是因為這兩類生物具有完全相同的代謝方式C.能合成人胰島素的大腸桿菌從可遺傳變異的類型上看屬于基因重組D.大腸桿菌制造的胰島素,需要進一步的加工和提純才能使用B當前第56頁\共有69頁\編于星期三\2點7.下列有關(guān)基因工程中運載體的說法中，正確的一項是（

）A.在進行基因工程操作中，被用作運載體的質(zhì)粒都是天然質(zhì)粒

B.所有的質(zhì)粒都可以作為基因工程中的運載體

C.質(zhì)粒是一種獨立于細菌染色體外的鏈狀DNA分子

D.作為載體的質(zhì)粒DNA分子上應(yīng)有對重組DNA進行鑒定和選擇的標記基因D當前第57頁\共有69頁\編于星期三\2點8.科學家已經(jīng)將魚的抗凍蛋白基因成功的導入到番茄體內(nèi)，培育出具有很強耐寒能力的番茄。請回答下列有關(guān)問題：

⑴要獲得該抗凍蛋白基因，可采用

等方法。從魚的體內(nèi)切割該抗凍蛋白基因所用的是

，其特點是⑵某種細菌中的一種叫做EcoRI的限制