生化工程第七章固定化細(xì)胞和酶

酶催化劑的優(yōu)點(diǎn)：專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)速度較快。弱點(diǎn)：溶液酶在反應(yīng)后，分離困難，重復(fù)利用困難；溶液酶穩(wěn)定性差，易失活。1969出現(xiàn)了固定化酶技術(shù)。固定化酶就是把原來游離的水溶性酶，設(shè)法限制或固定于某一局部的空間或者固定于載體上。當(dāng)前第1頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)固定化酶生物反應(yīng)器實(shí)際應(yīng)用中，固定化酶可以裝在反應(yīng)器中，連續(xù)生產(chǎn)有利于生產(chǎn)的自動(dòng)化，提高生產(chǎn)率。鑒于此，70年代以來，該技術(shù)受到各國(guó)學(xué)者的矚目，紛紛開展固定化酶的研究。當(dāng)前第2頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)8.1

固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的性質(zhì)

一、固定化的原則和方法由于酶催化作用依靠它的高級(jí)結(jié)構(gòu)及活性中心。固定化時(shí)，活性中心的必需基團(tuán)避免參加反應(yīng)；避免高溫、強(qiáng)堿、有機(jī)溶劑以及高濃度鹽的處理，保護(hù)靠氫鍵、離子鍵、疏水鍵等弱鍵維系的酶蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。盡可能在溫和條件下進(jìn)行固定化反應(yīng)。當(dāng)前第3頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)固定化方法：載體結(jié)合法：將酶（細(xì)胞）固定在不溶性載體上?？抗矁r(jià)結(jié)合、離子結(jié)合、和物理吸附。常用的載體：纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等多糖衍生物顆粒或多孔玻璃等。載體結(jié)合法交聯(lián)法包埋法8.1

固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì)當(dāng)前第4頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)交聯(lián)法：使酶與具有兩個(gè)以上官能團(tuán)的試劑（戊二醛）進(jìn)行反應(yīng)，應(yīng)用化學(xué)鍵把酶固定。

包埋法：將酶包在凝膠微小格子內(nèi)，或是將酶包裹在半透性聚合物膜內(nèi)的固定化方法。常用的凝膠為聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、膠原、卡拉膠等。包埋法簡(jiǎn)單，可適用于大多數(shù)酶。當(dāng)前第5頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)當(dāng)前第6頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)當(dāng)前第7頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)二、固定化酶和細(xì)胞的性質(zhì)

1、固定化后的活性

酶經(jīng)固定化后，活力降低。原因是：a.

酶和載體結(jié)合時(shí)，活性中心的氨基酸也或多或少地參與了結(jié)合，使得酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生部分變化，酶活力有一部分喪失。b.

由于載體的存在，有空間位阻，影響底物和酶接觸，酶的活性得不到全部表達(dá)。細(xì)胞固定化后，一般酶活力不下降。細(xì)胞內(nèi)酶受細(xì)胞膜、壁的保護(hù)。8.1

固定化方法及固定化后酶和細(xì)胞的的性質(zhì)當(dāng)前第8頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)固定化酶結(jié)構(gòu)的改變當(dāng)前第9頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)2、穩(wěn)定性酶或細(xì)胞被固定化后，由于載體的存在，酶分子的結(jié)構(gòu)或細(xì)胞被約束，對(duì)外部惡劣環(huán)境的敏感性下降，使其穩(wěn)定性增加（對(duì)熱、對(duì)各種化學(xué)試劑等）。而且有時(shí)穩(wěn)定性增加的幅度比較大。當(dāng)前第10頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)3、催化活性（底物專一性，反應(yīng)的pH值，T，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）a.

底物專一性：當(dāng)?shù)孜餅榇蠓肿訒r(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專一性下降；當(dāng)?shù)孜餅樾》肿訒r(shí)，酶或細(xì)胞對(duì)底物專一性變化不大。b．最適pH：依固定化載體與酶分子、細(xì)胞上所分布電荷的相互作用不同而異。有的變化，有的不變化，有的向pH小的方向移動(dòng)，有的向pH大的方向移動(dòng)。當(dāng)前第11頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)3、催化活性（底物專一性，反應(yīng)的pH值，T，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）c.反應(yīng)的最適溫度固定化酶、細(xì)胞的最適溫度往往升高，升高的幅度不同，2~15

oC不等。d.動(dòng)力學(xué)常數(shù)酶：米氏常數(shù)km反映了酶和底物的親和力。固定化酶的表現(xiàn)Km(app)與游離酶的Km相比有些不變，有的變化很大。當(dāng)前第12頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)3、催化活性（底物專一性，反應(yīng)的pH值，T，動(dòng)力學(xué)常數(shù)）原因可能是：載體間的靜電作用，以及擴(kuò)散效應(yīng)。如果固定化酶區(qū)域的底物濃度比外部液相主體溶液高，Km(app)下降。相反，用包埋法的固定化酶的Km(app)值，可較游離酶多兩個(gè)數(shù)量級(jí)。這是由于凝膠中的擴(kuò)散效應(yīng)使底物濃度減少，導(dǎo)致內(nèi)部底物濃度低于外部區(qū)域的濃度，Km(app)上升。對(duì)于固定化細(xì)胞，情況類似。Vmax一般不變化。當(dāng)前第13頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)當(dāng)前第14頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)8.2固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用

在70年代初，首先固定單一的酶，催化單一反應(yīng)；隨后同時(shí)固定兩種酶或兩種以上的酶，以及固定化酶和輔酶，催化復(fù)雜一些的反應(yīng)；再后來發(fā)展起來的固定化細(xì)胞技術(shù)，使得不易提取的不穩(wěn)定的酶的利用有了方便條件，還可以利用活細(xì)胞的完整代謝體系來完成復(fù)雜的反應(yīng)。如乙醇的生產(chǎn)。當(dāng)前第15頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)8.2固定化酶和固定化細(xì)胞的應(yīng)用在固定化酶、固定化細(xì)胞的研究中發(fā)展起來的親和層析技術(shù)，已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了利用酶和微生物進(jìn)行催化反應(yīng)的范疇。例如抗體抗原的提純是利用了特異的免疫吸附反應(yīng)。當(dāng)前第16頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)固定化酶和細(xì)胞技術(shù)的顯著特點(diǎn)：1．連續(xù)反應(yīng)；2．獲得的產(chǎn)物純度高；3．固定化酶或細(xì)胞可重復(fù)使用，減少了浪費(fèi)；4．易實(shí)現(xiàn)自控。當(dāng)前第17頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)應(yīng)用實(shí)例：DL-氨基酸的光學(xué)拆分人體只能利用L-氨基酸，所以L-氨基酸在食品醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用非常廣泛，并且需要量不斷增加?；瘜W(xué)合成法是生產(chǎn)氨基酸的方法之一，該法成本低，但生產(chǎn)出來的氨基酸是DL外消旋體。要想把L-氨基酸分離出來，需要進(jìn)行光學(xué)拆分。

當(dāng)前第18頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)復(fù)習(xí)幾個(gè)概念：外消旋體：對(duì)映體的右旋體和左旋體等量混合后，它們的旋光性相互抵消，不再有旋光性。這樣的混合物稱為外消旋體，以D、L表示。外消旋體可以用適當(dāng)方法拆開或分開。當(dāng)前第19頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)復(fù)習(xí)幾個(gè)概念：外消旋化：在一般情況下，和不對(duì)稱碳原子相連的四個(gè)原子或原子團(tuán)，不能隨意調(diào)換位置，因此對(duì)映體不能相互轉(zhuǎn)換，旋光度維持不變。

但在熱、光、或者化學(xué)試劑的影響下，不對(duì)稱碳原子上的原子或原子團(tuán)可發(fā)生調(diào)換現(xiàn)象，使旋光物質(zhì)轉(zhuǎn)化為它的對(duì)映體，最后得到外消旋體，原來100%的左旋體，經(jīng)變化后，變成50%左旋體和50%的右旋體，這種現(xiàn)象稱為外消旋化。當(dāng)前第20頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)DL-氨基酸光學(xué)拆分中，以酶法最佳，它是利用酰化氨基酸水解酶，制備純度高的L-aa，且收率高。

氨基酰化EDL-R-CHCOOH+H2OL-R-CH-COOH+D-R-CHCOOH

不對(duì)稱水解

NH2NH2NHCOR?

溶解度小?；?DL-aaL-aa酰化D-aa

外消旋化外消旋體當(dāng)前第21頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)固定化酶光學(xué)拆分DL-氨基酸生產(chǎn)流程當(dāng)前第22頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)1969年，日本千鈿一郎成功地利用固定化?；被崴饷?，由?；?DL-氨基酸連續(xù)生產(chǎn)L-aa獲得成功。這是世界上固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用的第一個(gè)實(shí)例。各種光學(xué)活性氨基酸都用這種方法生產(chǎn)。該項(xiàng)技術(shù)成功的關(guān)鍵是制造出適合于工業(yè)化要求的固定化酶。當(dāng)前第23頁\共有24頁\編于星期四\4點(diǎn)果葡糖漿的生產(chǎn)