目的基因T載體克隆實(shí)驗(yàn)步驟

目的基因T載體克隆試驗(yàn)步驟pcrt一.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：重組的dnadnamg切的載體分子與外源dnadnat4dnadnadna都存有將兩個(gè)具有一樣粘性末端的dnat4噬菌體dna除了一種大腸桿菌dnadna來(lái)。但這種相連接的效率比粘性末端的相連接率為高，通常可以通過(guò)提升t4dna連接酶濃度或削減dnat4dnadna3t4dnaatp-atp-atp5’3’羥基切口的dna上，并使dna個(gè)代萊磷酸二酯鍵，把切口封出來(lái)。連接反響通常將兩個(gè)一樣大小的片斷相連。很多dnapcrpcrdna3’端加上一個(gè)突出的堿基a。pucm-t3’端帶有一個(gè)突出的t。這樣，pucm-tpcrat化下，就可以把pcrpucm-t37℃時(shí)有助于連接酶的活性。但是在這個(gè)溫度下黏末端的氫鍵融合12-16℃，12-16h〔過(guò)夜〕，這樣既可以最大限度地充分發(fā)揮連接酶的活性，又兼具至較長(zhǎng)時(shí)間接合構(gòu)造的平衡。2、atp連接緩沖器系統(tǒng)中，將分別經(jīng)酶二.感受態(tài)制備原理狀態(tài)。

ccacl2dna三.β-半乳糖甘酶顯色反響選擇法〔藍(lán)白篩選〕原理lacz子中的一個(gè)基因，可以編碼β—半乳糖核苷酶。β—4聚體，可催化乳糖的水解．用x-gal〔puc/pbs〕，常帶有β—半乳糖核苷酶的調(diào)控序列和β—半乳糖核苷酶n146〕的編碼序列，在這個(gè)編碼序列里還插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)〔mcs〕,它并laczβ—半乳糖核苷酶c〔β段〕，的編碼序列。在各自獨(dú)立的狀況下，這些質(zhì)粒與大腸桿菌各自編碼的β—半乳糖核苷酶片段都沒(méi)有酶的活性。只有當(dāng)攜帶α培育基誘導(dǎo)物iptgβ—半乳糖核苷酶n〔α〕，這樣就與宿主細(xì)胞合成的β—半乳糖核苷酶c〔β〕互補(bǔ)，形成完整的β—半乳糖核苷酶活性蛋白。而當(dāng)外源基因填入至此種載體質(zhì)粒laczlacz發(fā)，從而無(wú)法制備β—半乳糖核苷酶；而對(duì)于空載體，laczα互補(bǔ)制備β—半乳糖核苷酶，水解培育基里的色素底物x-gal，最終構(gòu)成藍(lán)色的化合物，發(fā)生藍(lán)色菌斑。x-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d-半乳糖苷，分子式為c14h15brclno6，分408.63，它是β–半乳糖苷酶的底物，水解后呈藍(lán)色。iptg，中文名，異丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷，分子式:c9h18o5s，分子量238.30，2-8°c20°c，室溫可以置放一個(gè)月。主要促進(jìn)作用：異丙基硫代半乳糖苷(iptg)就是一種促進(jìn)作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑,不被細(xì)菌陳代謝而十分平衡,因此被試驗(yàn)室廣泛應(yīng)用清洗，5100ml〔1〕，63100ml。1ml殺菌：5100ml〔1〕，63涂敷棒，10mllb1.5mlep20.1mol/lcacl250ml+50ml100ml)，0.1mol/lcacl210ml，100mg/mlamp1ml，20mg/mlx-galx-gal5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d〔dmf〕熔化gal20mg/ml〔0.02gx-galdmf1ml〕的貯存液。留存于一玻璃管或聚丙烯管中，裝有x-gal當(dāng)貯存于-20℃。x-gal〔dmf;dimethylformamide;n,n-dimethylformamide;dmf;cas：68-12-2胺味的液體。分子式c3-h7-n-o73.100.9445(25℃)。熔點(diǎn)-61℃。沸152.8℃?！?00mg/mliptg0.8ml0.2giptg1ml，0.22μm-20℃。950ml10g5gnacl10g5mol/lnaohph7.3.1l15psi20min.〔100mllb1.5g〕0.1mol/lcacl2：0.11098g10mlamp〔100mg/ml〕：0.1g1ml，用0.22μm〔一〕.目的基因片段與載體連接旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml式離心機(jī)，干式恒溫氣浴。tt4dnaddwaterpcrt事先將干式恒溫儀〔或冰盒里的水〕溫度設(shè)定在14~16c。4200ul：〔必要調(diào)整〕4l1lt0.5lt4dna〔takara,350u/ul〕后加1l10xbuffer3.5lddwater14c〔14c〕中保溫過(guò)夜〔12-16h〕。連接后的產(chǎn)物可以馬上用來(lái)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或置4〔二〕.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制取細(xì)菌轉(zhuǎn)變

c旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，50ml1.5ml臺(tái)式冷凍離心機(jī)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，分光光度計(jì)，超凈工作臺(tái)，恒溫培育箱，搖菌試管，三角燒瓶，接種環(huán)，恒溫?fù)u床，培育皿〔已鋪好固體lb-amp〕，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培育箱，濾膜和過(guò)濾器e.colilb0.1mol/lcacl2ddwater，lb〔不提抗菌素〕，lb〔提抗菌素〕，無(wú)菌ddwater，iptg，x-gal。1ml100mllb〔不含抗菌素〕，37℃來(lái)靠培育過(guò)夜。0.5ml50mllb，37℃250r/min搖23h，測(cè)量od5900.35~0.4〔1ml41.5ml10min，然4℃，5000rpmVergt5min。1ml0.1mol/lcacl2旋30min?！?〕4℃，5000rpm5min100μl0.1mol/lcacl2垂2h，可以輕易用做轉(zhuǎn)變?cè)囼?yàn)，或馬上放進(jìn)-4藥。42℃。從-70℃超低溫冰柜中抽出一管〔100μl〕感受態(tài)菌，馬上用手指冷卻溶化后填入510min。5μl〔dna100ng〕，輕輕盤(pán)整后置放冰上42℃90s3min。在無(wú)塵室工作臺(tái)中向上述各管及中分別重參加300μllb〔不不含抗菌素〕輕輕攪勻，37℃1h。200μl，分別幾滴至不含最適宜抗菌素〔amp100ug/l〕的固體lb40μl20mg/mlx-gal，7μl200mg/mliptg，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻〔留意：一個(gè)不含抗生素作為比照組，玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂，菌液涂皿操作時(shí)，應(yīng)避開(kāi)反復(fù)來(lái)回涂布，由于感受態(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化，過(guò)多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞裂開(kāi)，影響轉(zhuǎn)化率?！场?7℃30min體都37℃恒溫培育箱過(guò)夜。70%乙醇，擦拭桌面。觀看平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能相互分開(kāi)為好。留意白色菌斑。〔三〕.轉(zhuǎn)變克隆的甄選和鑒別旋渦混合器，小鑷子，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml管架，干式恒溫氣浴〔或恒溫水浴鍋〕，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，超凈工作臺(tái)，酒精燈，無(wú)菌牙簽，搖菌管。lb〔提抗菌素〕，pcr且酶及其緩沖液，65%甘油〔65%甘油，0.1mol/lmgso4，0.025mol/ltrisclph8.0〕。操作步驟方法一：快速pcr4在的培育皿底部玻璃反面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。0.2mlpcr25μlddwater16μl10×pcrbuffer〔C99mgmgcl2〕2.5μl25mmmgcl21.5μl2.5mmol/ldntp2μl〔每種dntp0.2mm〕10μmol/lprimer11μl〔12.5—25pmoles〕10μmol/lprimer21μl〔12.5—25pmoles〕模板質(zhì)粒用小tippcrtaq0.5μl〔1.5u〕25μl〔2〕依據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置pcr〔本試驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為wz〕：①94℃5min②94℃1min③60℃1min④72℃1min50s⑤goto②29times⑥72℃10minpcr10μl〔與完整填入片斷同時(shí)比對(duì)〕。觀察膠上是否有估量的主要產(chǎn)物帶。依據(jù)編號(hào)找出培育皿中的原菌斑。依據(jù)必要開(kāi)放壓縮培育抽取其質(zhì)粒提取到的質(zhì)粒與原先的空載體〔或分子量的質(zhì)?！吃俦日针娪?，以進(jìn)一步確方法二：加質(zhì)粒再pcr33mllb〔50用

g/ml〕，記號(hào)筆寫(xiě)下不好編號(hào)。70%乙醇浸泡的小鑷子頭用酒精燈烤過(guò)，鑷取一支無(wú)菌牙簽。用牙簽下的尖部碰觸轉(zhuǎn)變的平板培育基上的一個(gè)白色菌落，然后將牙簽放進(jìn)器皿3mllb〔50g/ml〕33菌管及中?！?〕37℃搖菌過(guò)夜后，用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。搖菌管中的剩余菌液保存在4℃冰箱中。3pcr含外源插入片斷〔方法見(jiàn)有關(guān)試驗(yàn)〕。將經(jīng)過(guò)鑒別推論為恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒留存。依據(jù)編號(hào)找出冰箱中原菌液。依據(jù)必要開(kāi)放壓縮500l500存。70%乙醇，擦拭桌面附：目的基因pcr〔選做〕

l65%甘油混合后-80℃保0.2mlpcr50μl〔以下加樣量供參考，括號(hào)內(nèi)就是最終需要量，試驗(yàn)時(shí)需弁taq〕ddwater32μl10×pcrbuffer〔不含mgcl2〕5μl25mmmgcl23μl2.5mmol/ldntp4μl〔每種dntp0.2mm〕10μmol/lprimer12μl〔12.5—25pmoles〕10μmol/lp