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病毒感染與細(xì)胞凋亡

微生物教研組鄭方亮當(dāng)前第1頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第2頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)細(xì)胞凋亡的含義多細(xì)胞生物的一種生理性細(xì)胞死亡的過(guò)程;凋亡過(guò)程中,細(xì)胞的形態(tài)變化是特有的;凋亡過(guò)程中需要基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成,特別是酶的合成。概念:是由一系列基因控制并受復(fù)雜信號(hào)調(diào)節(jié)的細(xì)胞自然死亡的現(xiàn)象。當(dāng)前第3頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞程序性死亡從嚴(yán)格的詞學(xué)意義上來(lái)說(shuō),細(xì)胞程序性死亡與細(xì)胞凋亡是有很大區(qū)別的。細(xì)胞程序性死亡的概念是個(gè)功能性概念,描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中的一個(gè)預(yù)定的,并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。細(xì)胞凋亡則是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念,描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。一般認(rèn)為凋亡和程序性死亡兩個(gè)概念可以交互使用,具有同等意義。

當(dāng)前第4頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)凋亡形態(tài)特征Apoptosis“葉子凋落”當(dāng)前第5頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第6頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第7頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)左,正常胸腺細(xì)胞;右,凋亡胸腺細(xì)胞當(dāng)前第8頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)凋亡形態(tài)特征當(dāng)前第9頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)壞死細(xì)胞凋亡受累范圍多為連續(xù)的大片細(xì)胞多為單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞膜完整性受到破壞仍保持完整性細(xì)胞體積增大、細(xì)胞腫脹減小、固縮→固縮性壞死核染色質(zhì)散在的小集聚,呈絮狀積聚在核膜下,呈半月?tīng)罴?xì)胞器腫脹,尤以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯崩解仍保持完整,未崩解溶酶體破壞,酶外溢保持完整,酶不外溢后期細(xì)胞破裂、溶解、殘屑被巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)胞分解成許多凋亡小體,被鄰近細(xì)胞或巨噬細(xì)胞吞噬炎癥反應(yīng)引起周圍組織炎癥反應(yīng)不引起周圍組織炎癥反應(yīng)當(dāng)前第10頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)分子生物學(xué)機(jī)制細(xì)胞程序性死亡是細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)的結(jié)果之一。環(huán)境和發(fā)育的刺激通過(guò)配體和受體之間的相互作用傳遞到胞內(nèi),即配體攜帶的信號(hào)通過(guò)與穿膜細(xì)胞受體胞外區(qū)域的結(jié)合反應(yīng)到受體的胞內(nèi)區(qū)域,完成信號(hào)由胞外到胞質(zhì)的傳遞,然后開(kāi)始胞內(nèi)一系列蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的復(fù)雜作用,最后導(dǎo)致凋亡的發(fā)生。當(dāng)前第11頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)凋亡的過(guò)程信號(hào)傳遞階段死亡信號(hào)的探測(cè)胞外信號(hào)(配體與受體的特異結(jié)合)胞內(nèi)信號(hào)(毒素、射線引起的損傷或病毒感染)下游死亡機(jī)制的傳遞效應(yīng)階段

Caspase的激活最終造成細(xì)胞死亡。當(dāng)前第12頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第13頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)凋亡的激活途徑Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡線粒體參與的細(xì)胞凋亡當(dāng)前第14頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡富含半胱氨酸死亡結(jié)構(gòu)域deatheffectordomain當(dāng)前第15頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Caspase家族Caspase屬于半胱氨酸蛋白酶,這些蛋白酶是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶,一旦被信號(hào)途徑激活,能將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)降解,使細(xì)胞不可逆的走向死亡。它們均有以下特點(diǎn):①活性中心富含半胱氨酸;②對(duì)底物天冬氨酸部位有特異水解作用,所以命名為caspase(cysteine-containingaspartate-spicificprotease;③都是由兩大、兩小亞基組成的異四聚體,大、小亞基由同一基因編碼,前體被切割后產(chǎn)生兩個(gè)活性亞基。當(dāng)前第16頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)分為兩類:一類為執(zhí)行者(executioner或effector),如caspase-3、6、7,它們可直接降解胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白,引起凋亡,但不能通過(guò)自催化(autocatalytic)或自剪接的方式激活;另一類為啟動(dòng)者(initiator),如caspase-8、9,收到信號(hào)后,能通過(guò)自剪接而激活,然后引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng),如caspase-8可依次激活caspase-3、6、7當(dāng)前第17頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)線粒體參與的細(xì)胞凋亡

BID當(dāng)前第18頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第19頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Caspase可激活名叫CAD(caspase-activatedDnase)的核酸酶,CAD能在核小體的連接區(qū)將其切斷,形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中,并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合,不能進(jìn)入細(xì)胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45,釋放出CAD,使它進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA。Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),如裂解核纖層,核纖層(Lamina)是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體,由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu),使染色質(zhì)(chromatin)得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個(gè)近中部的固定部位所裂解,從而使核纖層蛋白崩解,導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。

Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白,改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外,Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。效應(yīng)階段當(dāng)前第20頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)DNA電泳鑒定–+壞死凋亡當(dāng)前第21頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)細(xì)胞色素c誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞DNA電泳圖1.細(xì)胞色素c誘導(dǎo)0h2.細(xì)胞色素c誘導(dǎo)1h3.細(xì)胞色素c誘導(dǎo)2h4.細(xì)胞色素c誘導(dǎo)3h5.細(xì)胞色素c誘導(dǎo)4h6.陰性對(duì)照7.Marker

當(dāng)前第22頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Caspase可激活名叫CAD(caspase-activatedDnase)的核酸酶,CAD能在核小體的連接區(qū)將其切斷,形成約為200bp整數(shù)倍的核酸片段。正常情況下CAD存在于胞質(zhì)中,并且與抑制因子ICAD/DFF-45蛋白結(jié)合,不能進(jìn)入細(xì)胞核。Caspase活化后可以降解ICAD/DFF-45,釋放出CAD,使它進(jìn)入細(xì)胞核降解DNA。Caspase可直接破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),如裂解核纖層,核纖層(Lamina)是由核纖層蛋白通過(guò)聚合作用而連成頭尾相接的多聚體,由此形成核膜的骨架結(jié)構(gòu),使染色質(zhì)(chromatin)得以形成并進(jìn)行正常的排列。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),核纖層蛋白作為底物被Caspase在一個(gè)近中部的固定部位所裂解,從而使核纖層蛋白崩解,導(dǎo)致細(xì)胞染色質(zhì)的固縮。

Caspase可作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白,改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)。除此之外,Caspase還能滅活或下調(diào)與DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白。效應(yīng)階段當(dāng)前第23頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)吞噬當(dāng)前第24頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)凋亡相關(guān)的基因和蛋白細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因,包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。當(dāng)前第25頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Apaf-1Apaf-1被稱為凋亡酶激活因子-1(apoptoticproteaseactivatingfactor-1),在線粒體參與的凋亡途徑中具有重要作用,該基因敲除后,小鼠神經(jīng)細(xì)胞過(guò)多,腦畸形發(fā)育。Apaf-1含有3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域:①CARD(caspaserecruitmentdomain)結(jié)構(gòu)域,能召集caspase-9;②ced-4同源結(jié)構(gòu)域,能結(jié)合ATP/dATP;③C端結(jié)構(gòu)域,含有色氨酸/天冬氨酸重復(fù)序列,當(dāng)細(xì)胞色素c結(jié)合到這一區(qū)域后,能引起Apaf-1多聚化而激活。Apaf-1具有激活Caspase-3的作用,而這一過(guò)程又需要細(xì)胞色素c和caspase-9參與。Apaf-1/細(xì)胞色素c復(fù)合體與ATP/dATP結(jié)合后,Apaf-1就可以通過(guò)其CARD結(jié)構(gòu)域召集caspase-9,形成凋亡體(apoptosome),激活caspase-3,啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)前第26頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)Bcl-2家族Bcl-2為凋亡抑制基因,是膜的整合蛋白。它們?cè)诰€粒體參與的凋亡途徑中起調(diào)控作用,能控制線粒體中細(xì)胞色素c等凋亡因子的釋放。Bcl-2家族成員都含有1-4個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(BH1-4),并且通常有一個(gè)羧端跨膜結(jié)構(gòu)域(transmembraneregion,TM)。其中BH4是抗凋亡蛋白所特有的結(jié)構(gòu)域,BH3是與促進(jìn)凋亡有關(guān)的結(jié)構(gòu)域。根據(jù)功能和結(jié)構(gòu)可將Bcl-2基因家族分為兩類,一類是抗凋亡的(anti-apoptotic),如:Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1;一類是促進(jìn)凋亡的(pro-apoptotic),如:Bax、Bak、Bad、Bid、Bim,在促凋亡蛋白中還有一類僅含BH3結(jié)構(gòu),如Bid、Bad。雖然Bcl-2蛋白存在于線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以及外核膜上,但主要定位于線粒體外膜,它拮抗促凋亡蛋白的功能。當(dāng)前第27頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)當(dāng)前第28頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)FasFas又稱作APO-1/CD95,屬TNF受體家族。Fas基因編碼產(chǎn)物為分子量45KD的跨膜蛋白,分布于胸腺細(xì)胞,激活的T和B淋巴細(xì)胞,巨噬細(xì)胞,肝、脾、肺、心、腦、腸、睪丸和卵巢細(xì)胞等。Fas蛋白與Fas配體結(jié)合后,會(huì)激活caspase,導(dǎo)致靶細(xì)胞走向凋亡。當(dāng)前第29頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)p53一種抑癌基因,其生物學(xué)功能是在G期監(jiān)視DNA的完整性。如有損傷,則抑制細(xì)胞增殖,直到DNA修復(fù)完成。如果DNA不能被修復(fù),則誘導(dǎo)其調(diào)亡,研究發(fā)現(xiàn)喪失p53功能的小鼠胸腺細(xì)胞對(duì)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的調(diào)亡反應(yīng)和正常細(xì)胞相同,而對(duì)輻射誘導(dǎo)的調(diào)亡不敏感。當(dāng)前第30頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)C-myc

在許多人類惡性腫瘤細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)有c-myc的過(guò)度表達(dá),它能促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制分化。在凋亡細(xì)胞中c-myc也是高表達(dá),作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,一方面它能激活那些控制細(xì)胞增殖的基因,另一方面也激活促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因,給細(xì)胞兩種選擇:增殖或凋亡。當(dāng)生長(zhǎng)因子存在,Bcl-2基因表達(dá)時(shí),促進(jìn)細(xì)胞增殖,反之細(xì)胞凋亡。當(dāng)前第31頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)ATM

ATM(ataxiatelangiectasia-mutatedgene)是與DNA損傷檢驗(yàn)有關(guān)的一個(gè)重要基因。正常細(xì)胞經(jīng)放射處理后,DNA損傷會(huì)激活修復(fù)機(jī)制,如DNA不能修復(fù)則誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ATM是DNA損傷檢驗(yàn)點(diǎn)的一個(gè)重要的蛋白激酶當(dāng)前第32頁(yè)\共有35頁(yè)\編于星期五\20點(diǎn)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法◆形態(tài)學(xué)觀測(cè):染色法、透射和掃描電鏡觀察◆DNA電泳:DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶◆TUNEL測(cè)定法,即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記

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