第四章基本常用技術(shù)

第四章基本常用技術(shù)第一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一第一節(jié)無菌技術(shù)防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。由于體外培養(yǎng)細(xì)胞缺乏抗感染能力，故在一切操作中要努力做到最大限度的無菌。細(xì)胞培養(yǎng)工具做到細(xì)胞培養(yǎng)專用進(jìn)出細(xì)胞培養(yǎng)室做到更衣?lián)Q鞋超凈工作臺紫外照射時不要放置過多物品遮擋紫外線第二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一一、操作區(qū)消毒1.使用紫外線燈滅菌，照射細(xì)胞培養(yǎng)室和超凈工作臺20-30min。2.在用紫外線燈照射期間，超凈工作臺上放置物品不要過多，留有死角阻礙照射，勿置培養(yǎng)細(xì)胞和培養(yǎng)用液等物，以免受射線影響(必要時可用紙張覆蓋)。3.所有操作用具（包括培養(yǎng)瓶）要經(jīng)75%的乙醇擦拭后才可放置進(jìn)超凈工作臺內(nèi)。4.實驗開始前使用75%的乙醇擦拭超凈工作臺臺面。第三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一二、洗手和著裝1.進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室更換專用室內(nèi)鞋和無菌服、帽子和手套。2.使用75%酒精或0.2%的新潔爾滅洗手。3.實驗過程中可能觸及污染物品或者出入培養(yǎng)室均要洗手。第四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一三、火焰消毒1.在無菌環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)或做其它無菌操作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作,需要在酒精燈附近進(jìn)行。2.實驗中使用器械均要經(jīng)過火焰燒灼進(jìn)行。3.金屬器械不宜灼燒長，防止退火和過熱。4.含營養(yǎng)液的吸管不要灼燒防止?fàn)I養(yǎng)液碳化。5.培養(yǎng)瓶口過火時間不要太長防止燒死細(xì)胞。第五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一四、培養(yǎng)操作1.操作臺面布局合理2.不用手觸及已消毒物品3.操作保持一定順序，動作準(zhǔn)確敏捷4.組織或細(xì)胞在未做處理前或培養(yǎng)液在未用前，勿過早暴露在空氣中；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)立即封閉瓶口。5.防止各種用液的交叉污染。6.不向操作方向講話或咳嗽第六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一原代培養(yǎng)：取自體內(nèi)新鮮組織并置于體外條件下生長的細(xì)胞在傳代之前稱為原代培養(yǎng)。意義:1.原代培養(yǎng)的最大優(yōu)點是細(xì)胞剛剛離體，生物性狀尚未發(fā)生很大變化，具有二倍體的遺傳性，而且大多數(shù)細(xì)胞表現(xiàn)出原來組織的特性。2.利用原代培養(yǎng)做各種實驗，如藥物測試、細(xì)胞分化及病毒學(xué)方面的試驗效果很好。3.原代培養(yǎng)也是建立各種細(xì)胞系（株）必須經(jīng)過的階段。第二節(jié)原代培養(yǎng)第七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一取材原則：1.幼體組織尤其是胚胎組織比年老個體的組織容易培養(yǎng)；2.分化程度低的組織比分化程度高的容易生長；3.腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。4.取材之后，最好立即培養(yǎng)，如因故不能培養(yǎng)時，應(yīng)把組織切成1立方厘米左右的小塊，置于培養(yǎng)液中，4℃貯存，存放時間不宜超過24小時。5.從體內(nèi)取材時，應(yīng)嚴(yán)格保持無菌，避免受到紫外線照射或接觸任何化學(xué)試劑及有害藥物如碘、汞等。取腫瘤和其它病理組織時容易帶菌，為減少污染，可用含500-1000單位／毫升的青、鏈霉素BSS液，漂洗5-10分鐘后再做培養(yǎng)處理。第八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一取鼠胚組織引頸法處死小鼠整個小鼠浸入75％酒精中2~3秒鐘打開胸腔取出組織第九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一組織的分離：從體內(nèi)取出的各種組織均由眾多細(xì)胞和纖維成分組成，而且結(jié)合十分緊密。為獲取多量生長良好的細(xì)胞，必須把組織細(xì)胞分散開，使細(xì)胞解離出來。機(jī)械法化學(xué)法第十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一機(jī)械法：把組織塊先剪成小塊后，把組織放入注射器針管中使用壓擠法，或是把組織置于不銹鋼紗網(wǎng)中用鈍物壓取法。其中以壓取法較多用。簡便易行，節(jié)省時間，但對組織有一定損傷，僅適用于處理軟組織。第十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一化學(xué)法：在把組織剪切成較小體積的基礎(chǔ)上，應(yīng)用生化和化學(xué)手段進(jìn)一步分散組織，最后制成細(xì)胞團(tuán)或單個細(xì)胞懸液接種的方法。最常用的消化酶是胰蛋白酶和膠原酶兩種。第十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一93第十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果細(xì)胞接種后一般幾小時內(nèi)就能貼壁，并開始生長如接種的細(xì)胞密度適宜，5天到一周即可形成單層第十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一離體培養(yǎng)的細(xì)胞群體增殖達(dá)到一定密度時，細(xì)胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細(xì)胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細(xì)胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其他比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細(xì)胞的傳代通常是采用胰蛋白酶消化。第三節(jié)傳代培養(yǎng)第十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一第十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一貼壁細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1.選取生長良好的細(xì)胞，倒去瓶中的舊培養(yǎng)液，加入2～3ml的PBS，輕輕振蕩漂洗細(xì)胞，以除去懸浮在細(xì)胞表面的碎片。2.加入適量0.１％－0.25％胰蛋白酶消化液，室溫消化，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞單層收縮突起出現(xiàn)空隙時，倒去酶液。3.用Hanks液洗滌1次，加入適量培養(yǎng)液，反復(fù)吹打細(xì)胞，使其成細(xì)胞懸液。4.使用臺盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按照計數(shù)結(jié)果進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)。5.24h后觀察的生長情況。第十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一懸液細(xì)胞的傳代培養(yǎng)1.取生長良好的細(xì)胞，在超凈工作臺用無菌吸管把培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞吹打均勻。2.轉(zhuǎn)移到無菌的離心管中，蓋緊膠蓋，平衡后離心（1000r/min）5min。3.在超凈工作臺中吸去上清液，加入適量新培養(yǎng)液，用吸管吹打細(xì)胞，制成懸液。4.使用臺盼藍(lán)計數(shù)，按照結(jié)果進(jìn)行分裝，并在培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，注明代號、日期，輕輕搖勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)。5.24h后觀察的生長情況。第十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞計數(shù)法是細(xì)胞學(xué)實驗的一項基本技術(shù)，是用于了解培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)，測定培養(yǎng)基、血清、藥物等物質(zhì)對細(xì)胞發(fā)揮作用的重要手段。

血球計數(shù)板計數(shù)法

電子細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)法

第四節(jié)細(xì)胞計數(shù)第十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一方法和步驟1.取酒精棉球清潔計數(shù)板和專用蓋玻片，并用絲綢布或擦鏡紙輕輕拭干。2.用胰酶消化分散貼壁細(xì)胞或直接收集懸浮細(xì)胞制成均勻分散的單細(xì)胞懸液，必要時應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尰驖饪s。3.混勻后直接取少許細(xì)胞懸液，沿計數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液。加樣量以充滿不外溢為宜，也不要過少或出現(xiàn)氣泡。第二十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一4.統(tǒng)計四個大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動計數(shù)板，分別數(shù)出四角的四個大格（每個大格含有16個中格）中的細(xì)胞數(shù)。對壓邊線細(xì)胞：計上不計下，計左不計右

第二十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一計算：一般以每毫升含細(xì)胞數(shù)來表示大方格的面積為1mm2，室深為0.1mm，則體積為0.1mm3。推算得0.1mm3×104，才為1ml體積。所以計算公式為：細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（

四個大格子細(xì)胞數(shù)/4)

×104

×稀釋倍數(shù)計數(shù)中，如果細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度過高，必須稀釋后再計；如果細(xì)胞數(shù)太少,可離心濃縮后再計。每個細(xì)胞懸液至少滴樣兩次求平均值。不要漏計，不要重復(fù)，細(xì)胞懸液應(yīng)混合均勻，濃度不可過高也不可過低。第二十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一第二十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞生長曲線的繪制細(xì)胞生長曲線(cellgrowthcurve)是觀測細(xì)胞在一代生存期內(nèi)的增生過程的重要指標(biāo)，可根據(jù)細(xì)胞生長曲線分析細(xì)胞增殖速度，確定細(xì)胞傳代、細(xì)胞凍存或具體實驗的最佳時間。它以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)作坐標(biāo)圖。第二十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一制作方法：1.培養(yǎng)細(xì)胞

首先在2４孔培養(yǎng)板內(nèi)分別接種相同數(shù)量的細(xì)胞。計數(shù)并記錄接種的細(xì)胞懸液之密度。接種時間記為0h。2.計數(shù)細(xì)胞密度

從接種時間算起，每隔24h計數(shù)３孔內(nèi)的細(xì)胞密度，算出平均值。為提高準(zhǔn)確率，對每孔細(xì)胞可計數(shù)2～3次。如此操作至第七天結(jié)束。3.繪制曲線以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，將全部結(jié)果在坐標(biāo)紙上繪圖，即得所培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線。培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線第二十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一第五節(jié)活細(xì)胞的染料排除檢測法原理：由于死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，某些染料可大量進(jìn)入?yún)s不被排出，因而細(xì)胞呈色。而活細(xì)胞反之，能排出進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的染料，因而不易著色。此法的原理即是利用死、活細(xì)胞對染料的不同反應(yīng)而區(qū)分開兩種細(xì)胞。最常用的為“臺盼藍(lán)排除檢測法”第二十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一

實驗方法：1、將細(xì)胞懸液以0.5ml加入試管中。

2、加入0.5ml0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

4、鏡下取幾個任意視野分別計死細(xì)胞和活細(xì)胞數(shù)，計細(xì)胞活力。

死細(xì)胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細(xì)胞，活細(xì)胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。臺盼藍(lán)染細(xì)胞時，時間不宜過長。否則，部分活細(xì)胞也會著色，會干擾實驗結(jié)果。第二十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一

1776年，

“冷”處理對“細(xì)胞”生命活動影響的報道。

1900年前后，基本上肯定了生物成分(如精子)能夠在零下溫度貯存。

1949年，發(fā)現(xiàn)了甘油對低溫下貯存細(xì)胞的保護(hù)作用。

1959年，發(fā)現(xiàn)了一種新的化學(xué)保護(hù)劑，這就是現(xiàn)在常用的二甲基亞砜(DMSO)。

當(dāng)前低溫液氮凍存貯存細(xì)胞已是細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)性通用技術(shù)，貯存時間幾乎是無限的。

第七節(jié)、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇第二十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一一、培養(yǎng)物的冷凍保存與復(fù)蘇原理冷凍保存(cryopreservation)：將體外培養(yǎng)物懸浮在加有冷凍保護(hù)劑的溶液中，以一定的冷凍速率降至零下某一溫度(一般是低于-70℃的超低溫條件)，并在此溫度下對其長期保存的過程。復(fù)蘇(thawing)：是以一定的復(fù)溫速率將凍存的培養(yǎng)物恢復(fù)到常溫的過程。

第二十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一細(xì)胞凍存時，存在兩種損傷：冰晶損傷溶質(zhì)損傷

冰晶損傷：由于溫度下降，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會結(jié)冰，所形成的冰晶會造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞并引起細(xì)胞死亡。這種因細(xì)胞內(nèi)、外結(jié)冰而致的細(xì)胞損傷被稱為細(xì)胞的冰晶損傷。冰晶損傷是由冷卻速度過快造成，冷卻速度越快，冰晶損傷越大。

第三十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一溶質(zhì)損傷：因保存溶液溶質(zhì)濃度增高而致的細(xì)胞損傷被稱為溶質(zhì)損傷。細(xì)胞懸浮在溶液中，隨著溫度的下降，細(xì)胞外部的水分會先結(jié)冰，從而使得未結(jié)冰的溶液中電解質(zhì)的濃度升高。如果將細(xì)胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長，細(xì)胞膜上脂質(zhì)會受到損壞，細(xì)胞便發(fā)生滲漏。

溶質(zhì)損傷是由冷卻速度過慢，使細(xì)胞在高濃度的溶液中暴露的時間過長而造成，冷卻速度越慢，此損傷越嚴(yán)重。第三十一頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一如果在溶液中加入冷凍保護(hù)劑時，則可保護(hù)細(xì)胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。保護(hù)機(jī)理：冷凍保護(hù)劑易同溶液中水分子結(jié)合，從而降低冰點，減少冰晶的形成；通過其摩爾濃度降低未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，使細(xì)胞免受溶質(zhì)的損傷，細(xì)胞得以在超低溫條件下保存。

第三十二頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一影響冷凍效果的因素有以下幾點：

1.冷凍速率

當(dāng)冷凍速度過慢時，細(xì)胞脫水嚴(yán)重，細(xì)胞體積嚴(yán)重收縮，超過一定程度時即失去活性。冷凍速度過慢，還會引起細(xì)胞外溶液部分結(jié)冰，從而使細(xì)胞外未結(jié)冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷。當(dāng)冷凍速度過快時，細(xì)胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較大冰晶,造成細(xì)胞膜及細(xì)胞器的破壞，產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷。2.冷凍保存溫度：液氮溫度(-196℃)是目前最佳冷凍保存溫度。應(yīng)用-70℃～-80℃條件冷凍保存細(xì)胞，短期內(nèi)對細(xì)胞活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長，細(xì)胞存活率明顯下降。

第三十三頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一4.冷凍保護(hù)劑（滲透性

非滲透性）：

滲透性常用甘油、DMSO

滲透到細(xì)胞內(nèi)，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷；同時，細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲，避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。甘油和DMSO并不能防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。在使用該類冷凍保護(hù)劑時，需要一定的時間進(jìn)行預(yù)冷。目前，DMSO的應(yīng)用比甘油更為廣泛。

第三十四頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一非滲透性冷凍保護(hù)劑不能滲透到細(xì)胞內(nèi)，一般是些大分子物質(zhì)。該類保護(hù)劑主要包括聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及羥乙基淀粉等。大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中水分子相結(jié)合，降低溶液中自由水的含量，使冰點降低，減少冰晶的形成；使溶液中電解質(zhì)濃度降低，從而減輕溶質(zhì)損傷。第三十五頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一二、使用逐級降溫法進(jìn)行凍存1.主要材料(1)儀器設(shè)備：普通冰箱、-30℃低溫冰箱和-70～-80℃超低溫冰箱、液氮凍存罐、離心機(jī)等。(2)凍存管：容量為2ml。(3)冷凍保護(hù)液：一般是以含20%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液與二甲基亞砜1份以9：1混合而成。現(xiàn)配現(xiàn)用，或配制后放入普通冰箱冰盒內(nèi)冷凍保存。使用前，于室溫下水浴融解。(4)待凍存細(xì)胞。第三十六頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一2.細(xì)胞處理過程(1)按常規(guī)方法消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)物,制備成單細(xì)胞懸液,計算細(xì)胞總數(shù)。(2)將細(xì)胞懸液以800～1000r／min離心5min，棄上清液。(3)向沉淀物中加入冷凍液。輕輕吹吸均勻，使細(xì)胞密度達(dá)1×106～1×107個/ml。(4)按每管1～1.5ml的量，分裝于凍存小管內(nèi)。擰緊管蓋。(5)在凍存小管上做標(biāo)記，包括細(xì)胞代號及凍存日期。第三十七頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一3.分級冷凍：（1）標(biāo)準(zhǔn)程序為-25℃以上時，下降-2～-1℃/min；-25℃以下時，下降-10～-5℃/min；溫度達(dá)到-100℃時，可迅速放入液氮（2）實際可采用普通冰箱冷藏層(4～8℃)，約40min；普通冰箱冷凍層(-10～-20℃)，30～60min；在-70～-80℃下過夜；最后將凍存小管投入液氮保存。凍存的細(xì)胞存活率可達(dá)90%以上。可使用細(xì)胞凍存盒進(jìn)行一次性冷凍。第三十八頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一注意事項：在使用DMSO前，不需要對其進(jìn)行高壓滅菌，因其本身就有滅菌作用。

在常溫下，DMSO對人體有毒，故在配制冷凍保護(hù)劑時最好帶手套。凍存管投入液氮時，動作要小心、輕巧，以避免液氮從液氮罐內(nèi)濺出。勿將凍存的細(xì)胞放置在0～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過長時間，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度范圍內(nèi)。第三十九頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一三、細(xì)胞復(fù)蘇1.主要材料(1)儀器設(shè)備：恒溫水浴箱、普通離心機(jī)。(2)培養(yǎng)用液：完全培養(yǎng)液（20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液）第四十頁，共四十四頁，編輯于2023年，星期一2.復(fù)蘇過程(1)將恒溫水浴箱的溫度調(diào)至37～40℃。(2)從液氮中取出凍存小管，立即投入37～