酶的分子修飾

第一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二什么是酶分子修飾？通過各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的某些特性和功能的技術過程稱為酶分子修飾。第二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一節(jié)酶的化學修飾廣義：凡涉及共價部分或部分共價的形成或破壞的轉(zhuǎn)變。狹義：較溫和的條件下，以可控的方式是一種蛋白質(zhì)同某些化學試劑起特異反應，從而引起單個氨基酸或其功能基團發(fā)生共價的化學改變。第三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二酶的化學修飾的功能1）催化機理的研究通過對特定基團側(cè)鏈的化學修飾，可比較方便的獲得有關必需基團的性質(zhì)，配合以保護手段還可以了解活性部位的信息。2）有目的對目標基團進行基團改造或保護，可有目的的改變酶的活性。3）改變酶的生理生化性質(zhì)，如穩(wěn)定性、最適pH、抗原性、實現(xiàn)特定目的的研究或應用目的。第四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二一、酶化學修飾方法及修飾劑修飾劑的要求反應條件的選擇酶修飾方法酶學性質(zhì)第五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二1、影響酶化學修飾的主要因素（1）影響酶蛋白功能基團反應性的因素①微區(qū)的極性②蛋白質(zhì)中酚基和羧基相互作用中，羧基pKa低于正常值，而酚基的pKa高于正常值。③靜電效應④位阻效應第六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、修飾劑的反應性選擇吸附靜電相互作用位阻因素催化因素第七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二二、修飾反應專一性的控制（1）試劑的選擇實驗目的不同，對專一性的要求也不同。（2）反應條件的選擇：不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性。有利于專一性修飾蛋白質(zhì)第八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）反應的專一性①利用蛋白質(zhì)分子中某些基團的特殊性②選擇不同的反應pH③利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性④親和標記⑤差別標記⑥利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異第九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二三、修飾程度和修飾部位的測定（1）光譜法（2）化學修飾數(shù)據(jù)的分析①化學修飾的時間進程分析②確定必要基團的性質(zhì)和數(shù)目第十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二設計酶化學反應時應注意酶性質(zhì)的了解酶活性部位情況

酶催化活性主要依賴于酶的活性中心。因此，對酶活性中心的組成，例如：酶蛋白中哪些氨基酸殘基或其側(cè)鏈基團參與了酶的活性中心．是否需要輔因子，為何種輔因子等情況，需要了解，此外，還需要了解酶的分子大小、形狀、寡聚酶的亞基組成等。

第十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二酶的穩(wěn)定條件、酶反應最適條件

酶的穩(wěn)定性被修飾酶對熱、對酸堿的穩(wěn)定性，作用溫度及pH范圍以及最適溫度、最適pH的情況，酶蛋白解離時的電學性質(zhì)，酶蛋白水解部位，抑制劑的性質(zhì)等應有所了解。酶分子側(cè)鏈基團的化學性質(zhì)及反應活潑性

酶側(cè)鏈基團的性質(zhì)及反應性選擇性修飾試劑必須要與多肽鏈中某—種特定的氨基酸殘基側(cè)鏈基團發(fā)生化學反應，并形成緊密共價結(jié)合。酶分子中經(jīng)常被修飾的氨基酸殘基側(cè)鏈基團有：巰基、氨基、羧基、咪唑基、羥基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫鍵等。第十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二反應體系中酶與修飾劑的分子比例。反應體系的溶劑性質(zhì)，鹽濃度和pH條件。反應溫度及時間。不造成蛋白的不可逆變性有利于專一性修飾要求3．反應條件的選擇第十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二二、酶分子側(cè)鏈基團的化學修飾酶分子側(cè)鏈基團的修飾是通過選擇性的試劑或親和標記試劑與酶分子側(cè)鏈上特定的功能基團發(fā)生化學反應而實現(xiàn)的。第十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二1、幾種重要的修飾反應（1）酰化及其相關反應試劑特點：含有?；Y(jié)構(gòu)，C上帶有部分正電荷。這類試劑作用于側(cè)鏈基團上的親核基團，使之酰基化，?；拥接H核原子上?？勺饔没鶊F包括：氨基，作用后形成酰胺；巰基：作用后形成巰酯；醇羥基（絲氨酸、蘇氨酸）：作用后形成酯；酚羥基（酪氨酸）：作用后形成酚酯。第十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二?；磻械腦既可以是鹵素，也可以是某些吸電基團，如咪唑基。第十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）烷基化反應試劑特點：烷基上帶有活潑鹵素，由于鹵素原子的電負性，使烷基帶有部分正電荷。該類試劑作用于側(cè)鏈基團的親核基團，使之烷基化，烷基連接在親核原子上?？勺饔没鶊F包括：氨基（賴氨酸、精氨酸），巰基（半胱氨酸）、羧基（天冬氨酸、谷氨酸），甲硫基（甲硫氨酸），咪唑基（組氨酸）第十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二試劑特點：具有氧化性或還原性這類試劑作用于側(cè)鏈基團，可被氧化的基團包括巰基，甲硫基，吲哚基（色氨酸）、咪唑基、二硫鍵等。而被還原的基團主要是二硫鍵。（3）氧化和還原反應第十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二連四硫酸鹽氧化巰基，DTT還原逆回，可用于保護巰基。第二十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（4）芳香環(huán)取代反應試劑：鹵（碘）化、硝化試劑。該類試劑作用于酪氨酸的OH鄰位。第二十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、特定氨基酸殘基側(cè)鏈基團的化學修飾通過選擇性的試劑或者親核試劑與酶上特定的側(cè)鏈基團進行化學修飾是酶分子化學研究的重要方法，也是改造酶的性質(zhì)和功能的重要手段。20種氨基酸的側(cè)鏈基團中只有極性氨基酸的側(cè)鏈容易被修飾，它們一般具有親核性。從酶動力學的角度，酶必需基團的化學修飾的過程是不可逆抑制（激活）過程。第二十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（1）巰基的化學修飾

巰基具有很強的親核性，采用巰基化學修飾劑與酶蛋白側(cè)鏈上的巰基結(jié)合，使巰基發(fā)生改變，從而改變酶的空間構(gòu)象、特性和功能。巰基修飾可以分為以下幾種：二硫鍵交換、重金屬化合物作用、烷基化、酰基化。第二十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二二硫鍵交換E-SH+R-S-S-R----E-S-S-R+R-SHE-SH+E-S-S-R----E-S-S-E+R-SH與-SH進行二硫鍵交換后，-SH被修飾，試劑的另一半以單體放出。

二硫鍵交換產(chǎn)生的單體在一定波長下有很大的光吸收，可用分光光度計進行連續(xù)監(jiān)測。第二十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二二硫鍵交換常用試劑DTNB5,5-二硫-2-硝基苯甲酸N-乙基馬來酰肼第二十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）氨基的化學修飾氨基具有很高的親核性，可用多種?；蛘咄榛噭┻M行修飾。①烷基化第二十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二②?；宜狒せ酋Ｂ龋―NS）第二十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二③還原烷基化一個常用的特異性修飾賴氨酸氨基的試劑磷酸吡哆醛第二十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）羧基的化學修飾修飾羧基的反應專一性差，一般選用合適的R和R’的水溶性碳化二亞胺修飾天冬氨酸和谷氨酸，屬烷基化反應。①水溶性碳化二亞胺第二十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二②酯化氟硼化三甲基金羊鹽（CH3)3OBF4第三十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（4）咪唑基的化學修飾通過對咪唑基上氮原子?；蛲榛揎椊M氨酸咪唑基。焦炭酸二乙酯（DPC）是最常用的試劑。第三十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二碘代乙酸也可以對咪唑基上的碳進行親核取代第三十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（5）胍基的化學修飾①二酮②環(huán)乙二酮③苯酰甲醛該反應本質(zhì)上是羰基對氨基?；Ｔ摲磻话憧赡?，需加硼酸鹽使產(chǎn)物與之反應而穩(wěn)定下來。但苯酰甲醛時反應不可逆，不需加硼酸鹽。第三十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第三十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（6）二硫鍵的化學修飾①氧化：過甲酸②還原：巰基乙醇第三十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二③DTT二硫蘇糖醇DTT是目前最常用的二硫鍵修飾劑和巰基保護劑。第三十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二三、酶的親和修飾親和標記是最有意義的一種化學修飾，這是因為它可以是很專一性的作用于酶的活性部位。親和標記是分步反應，修飾劑先可逆的結(jié)合在酶的活性部位，再不可逆的修飾該部位特定基團，一般是必需基團，而造成不可逆失活，親和標記修飾劑一般是底物類似物，和底物含有共同的結(jié)合于酶的基團，親和標記的作用符合飽和動力學特征，可以把親和標記過程看作是一次自殺性酶反應。第三十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二親和試劑一般是具有化學反應性的蛋白質(zhì)分子的底物或配體的類似物。親和標記試劑在酶上有特定的結(jié)合部位，其解離常數(shù)也易于測定，可以提供酶的結(jié)構(gòu)信息，是理論研究中一類常用的修飾劑。親和標記試劑一般在較低濃度下有效修飾酶，改變酶的活性，特別是專一性較強，是藥物等的優(yōu)良候選者，有廣泛的應用價值。第三十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二1、光親和標記特點：具有光反應基團。這種試劑先與酶活性部位在暗條件下發(fā)生特異性結(jié)合，然后被光照激活后，產(chǎn)生一個非常活潑的功能基團，其能與他們附近的幾乎所有基團反應，形成一個共價的標記物。第三十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、專一性的不可逆抑制劑

親和試劑可以專一性地標記于酶的活性部位，使酶不可逆失活，因此，稱為專一性的不可逆抑制。第四十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（1）Ks型抑制劑：根據(jù)底物的結(jié)構(gòu)設計，具有和底物的結(jié)構(gòu)相似的結(jié)合基團，同時也可以和酶的活性部位發(fā)生特異性結(jié)合，并且能夠?qū)钚圆课粋?cè)鏈基團進行修飾，導致酶不可逆失活。（2）Kcat型抑制劑：根據(jù)酶催化過程設計，它具有酶的底物性質(zhì)，還有一個潛在的反應基團在酶的催化活化后不可逆抑制酶的活性部位，因此也稱為“自殺性抑制劑”。第四十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二四、有機大分子對酶的化學修飾利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生某些精細的改變，從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾法，簡稱為大分子結(jié)合法。第四十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二1、聚乙二醇聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無毒性、無殘留、無免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。第四十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二天然SOD：半衰期6min右旋糖酐修飾后：半衰期7hPEG修飾：半衰期35h第四十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二過程：活化：修飾劑中含有的基團需要經(jīng)過活化，然后才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團進行反應。修飾：將帶有活化基團的大分子修飾劑與經(jīng)過分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、pH值等條件下反應一段時間，使修飾劑的活化基團與酶分子的某側(cè)鏈基團以共價鍵結(jié)合，對酶分子進行修飾。分離：需要通過凝膠層析等方法進行分離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶第四十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（1）三氯均嗪法三氯均嗪環(huán)上的氯原子很活潑，容易產(chǎn)生親核取代反應。當環(huán)上的一個氯原子被取代后，能夠穩(wěn)定其他的碳-氯鍵（第一個氯原子在4℃就能反應，第二個氯原子在25℃反應，第三個氯原子在80℃反應）。第四十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）疊氮法將PEG鏈端羥基轉(zhuǎn)化成疊氮基，然后與酶反應。PEG甲氧甲酰甲酯制備：PEG與氯醋酸酐及重氮甲烷發(fā)生反應生成PEG甲氧甲酰甲酯。PEG酰肼的制備：反應產(chǎn)物與肼反應生成相應的酰肼化合物。PEG羧甲基疊氮化物制備：PEG酰肼化合物經(jīng)亞硝酸作用生成活化PEG。第四十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）琥珀酸酐法二溴琥珀酸作為PEG的活化劑。PEG活化反應修飾反應第四十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（4）重氮法將修飾劑上有關基團轉(zhuǎn)變?yōu)橹氐鶊F，然后在弱堿條件下與酶分子上的酚基、咪唑基等反應，生成修飾酶。PEG活化反應修飾反應第四十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、右旋糖酐及右旋糖酐酯右旋糖酐屬于菌多糖，是由α-葡萄糖通過α-1,6糖苷鍵形成的高分子糖，具有較好的水溶性和生物相容性，可用作代血漿。（1）溴化氫法（2）高碘酸氧化法第五十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二3、糖肽糖肽一般是通過纖維蛋白酶或蛋白水解酶降解人纖維蛋白或γ-球蛋白而得。糖肽結(jié)構(gòu)上有氨基，經(jīng)活化后能與酶分子上氨基反應而產(chǎn)生共價結(jié)合。（1）異氰酸法（2）戊二醛法第五十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二4、具有生物活性的大分子物質(zhì)肝素是一種含硫酸酯的黏多糖，由氨基葡萄糖和兩種糖醛酸組成，平均分子量2000左右。肝素共價交聯(lián)酶后可增加酶的穩(wěn)定性，同時由于肝素在生物體內(nèi)還具有抗凝血、抗血栓、降血脂等活性。羧二亞胺法溴化氫法三均嗪法第五十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二5、蛋白質(zhì)類及其他血漿蛋白是血漿中的天然成分，它們和其他蛋白（包括酶類）的復合物在血液中可能被視為“自體蛋白”而被接受。第五十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二6、酶的化學交聯(lián)交聯(lián)劑是具有兩個反應活性部位的雙功能基團，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應。同型雙功能試劑異性雙功能試劑可被光活化試劑第五十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二五、修飾酶的性質(zhì)及特點1、熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性增加修飾劑與酶多點交聯(lián)，固定了酶的分子構(gòu)象，增強了酶的熱穩(wěn)定性。增強酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性減少了酶熱失活。

但PEG修飾后熱穩(wěn)定性沒有明顯提高，原因：PEG與酶是單點交聯(lián)，相對難以產(chǎn)生固定的酶分子結(jié)構(gòu)。

第五十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二

2、抗原性部分可消除。比較公認的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。3、最適pH值部分酶經(jīng)化學修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應用研究上有時具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應用上有較大意義。第五十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二4、酶學性質(zhì)的變化絕大多數(shù)酶經(jīng)過修飾后，最大反應速度沒有改變，但有些酶在修飾后，米氏常數(shù)會增大。5、對組織的分布能力變化對組織的分布能力有所改變，能在血液中被靶器官選擇性地吸收。第五十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第二節(jié)酶的分子定向進化

蛋白質(zhì)工程：利用基因工程手段對酶的蛋白質(zhì)分子改造，以期獲得性質(zhì)和功能更加完善的蛋白質(zhì)分子。酶分子的合理設計(rationaldesign)：利用各種生物化學、晶體學、光譜學等方法對天然酶或其突變體進行研究，從而獲得酶分子特征、空間結(jié)構(gòu)、結(jié)構(gòu)和功能之間關系以及氨基酸殘基功能等方面的信息，以此為依據(jù)對酶分子進行改造。如：化學突變、定點突變等酶分子的非合理設計：不需要準確的酶分子結(jié)構(gòu)信息而通過隨機突變、基因重組、定向篩選等方法進行改造。如:定向進化、雜合進化。第五十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二定向進化示意圖隨機突變+定向選擇＝目標突變體細菌誘發(fā)突變的因素50

0C培養(yǎng)突變體庫選擇壓力（溫度）溫度耐受型突變體最適生長溫度為370C最適生長溫度提高了！第五十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二自然進化是在整個有機體繁殖和存活的過程中自發(fā)出現(xiàn)的一個非常緩慢的過程。自然選擇使進化向有利于生物適應生存環(huán)境的方向發(fā)展。環(huán)境的多樣性和適應方式的多樣性決定了進化方向的多樣性。我們可以在實驗室中模仿自然進化的關鍵步驟—突變、重組和篩選,在較短時間內(nèi)完成漫長的自然進化過程,有效地改造蛋白質(zhì),使之適于人類的需要。第六十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第六十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二酶具有進化潛力的原因：生物體環(huán)境與實際運用環(huán)境不同希望具有更高的活性和穩(wěn)定性非生物體內(nèi)涉及的蛋白性質(zhì)第六十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理DNA模板DNA引物dNTPTaqDNA聚合酶1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍第六十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點1234522557294時間（min）溫度（℃）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復1~3步25~30輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95℃第六十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃引物1引物2DNA引物第六十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點50℃引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶第六十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第1輪結(jié)束95℃第2輪開始第六十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點95℃50℃72℃TaqTaqTaqTaq第六十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR的基本原理PCR反應條件PCR過程PCR的特點72℃第2輪結(jié)束第六十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二PCR反應條件PCR過程PCR的特點重復30輪后230=1,073,741,824模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增第6輪擴增理想拷貝數(shù)=2nn循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)nX平均效率,約為0.85n循環(huán)次數(shù)

第七十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二二、定向進化的策略1、以易錯PCR技術為代表的無性進化易錯PCR(errorpronePCR)是指在擴增目的基因的同時引入堿基錯配,導致目的基因隨機突變。然而,經(jīng)一次突變的基因很難獲得滿意的結(jié)果，由此發(fā)展出連續(xù)易錯PCR策略。即將一次PCR擴增得到的有用突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續(xù)反復地進行隨機誘變,使每一次獲得的小突變累積而產(chǎn)生重要的有益突變。遺傳變化只發(fā)生在單一分子內(nèi)部，故屬于無性進化。第七十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二化學誘變劑介導的隨機誘變體外隨機誘變也可在65℃下直接用羥胺處理帶有目的基因片段的質(zhì)粒，然后用限制性內(nèi)切酶切下突變了的基因片段，再克隆到表達載體中進行功能的篩選。第七十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二由致突變菌株產(chǎn)生隨機突變美國Strategen公司構(gòu)建了一株DNA修復途徑缺陷的大腸桿菌突變株XL1RED,它體內(nèi)的DNA突變率比野生型高五千倍。將帶有要突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到XL1RED菌株內(nèi)復制過夜,在此過程中會產(chǎn)生隨機突變。每兩千個堿基中通常約有一個堿基置換。將帶有突變過的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達系統(tǒng)中進行篩選。第七十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、以DNA改組技術為代表的有性進化（1）DNA改組1994年,Stemmer等首先使用DNA改組完成體外重組。DNA改組是將一群密切相關的序列(如多種同源而有差異的基因或一組突變基因文庫)在DNaseI的作用下隨機酶切成小片段,這些小片段之間有部分的堿基序列重疊,它們通過自身引導PCR延伸,并重新組裝成全長的基因,這一過程被稱為再組裝PCR。該過程所產(chǎn)生的相關序列間的交換歸因于模板的轉(zhuǎn)換。DNA改組過程中也可能引入新的點突變。因此,僅DNA改組就可以有效地從單一基因序列開始進行蛋白質(zhì)的定向進化。第七十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二DNAshuffling第七十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二體外定向進化第七十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二ＤＮＡ改組具有以下有用的特征:它可以利用現(xiàn)存的有利突變,快速積累不同的有利突變。重組可伴隨點突變同時發(fā)生?？梢詣h除個體中的有害突變和中性突變。第七十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）體外隨機引導重組1998年,Arnold提出了一種有效的新方法—隨機引導重組(RPR)。

RPR的原理是:用隨機序列的引物來產(chǎn)生互補于模板序列不同部分的大量的DNA小片段。由于堿基的錯誤摻入和錯誤引導,這些DNA的小片段中也因之而含有少量的點突變。DNA小片段之間可以相互同源引導和重組。在DNA聚合酶作用下,經(jīng)反復的熱循環(huán)可重新組裝成全長的基因,克隆到表達載體上,隨后篩選。

第七十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第七十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二與DNA改組相比，RPR技術具有以下優(yōu)點:RPR可直接利用單鏈DNA或ｍＲNA作模板，所需親代DNA比DNA改組所需的量少10—20倍。DNA改組利用DNaseI隨機切割雙鏈DNA模板,在DNA片段重新組裝成全長序列之前,DNaseI必須去除干凈。一般說來,RPR技術使基因的重新組裝更容易。合成的隨機引物長度一致并缺乏序列的偏向性,保證了點突變和交換在全長的后代基因中的隨機性。隨機引導的DNA合成不受DNA模板長度的影響,這給小肽的改造提供了機會。第八十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）交錯延伸技術1998年，Arnold等人又建立了一種新的體外重組方法—交錯延伸技術:用PCR同時擴增多個擬重組的模板序列時,在熱循環(huán)中大大縮短退火與聚合酶催化延伸的時間。在每一循環(huán)中,不斷延長的片段根據(jù)序列的互補性與不同模板退火,并進一步延伸。反復重復直到全長序列形成。由于模板的轉(zhuǎn)換,大多數(shù)多核苷酸含有不同親本的序列信息。該技術已成功地重組了由易錯PCR產(chǎn)生的5個熱穩(wěn)定的枯草桿菌蛋白酶Ｅ的突變體,得到了熱穩(wěn)定性進一步提高的重組酶。第八十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第八十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（4）SCRATCH技術SCRATCH技術是將DNA改組技術與增加片段化雜合酶法（ITCHY）相結(jié)合的技術。Stefan等用E.coli的甘氨酰胺核苷酸甲醛轉(zhuǎn)移酶基因和人甘氨酰胺核苷酸甲醛轉(zhuǎn)移酶基因分別構(gòu)建pDIMGPX質(zhì)粒，接著采用能增加斷點的核苷酸類似物的方法進行PCR擴增，構(gòu)建其文庫，然后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α進行PCR擴增和改組，再轉(zhuǎn)化到營養(yǎng)缺陷型E.coliTX680F’進行活性雜合子篩選，并對其DNA序列進行分析，主要特點：不依賴基因序列的同源性而產(chǎn)生多個DNA雜交位點。第八十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（5）臨時模板隨機嵌合生長RACHITT技術是與DNAshuffling概念上明顯不同的、改進的基因家族重組技術.它不包括熱循環(huán)、鏈轉(zhuǎn)移或交錯延伸反應,而是將隨機切割的基因片段雜交到一個臨時DNA模板上進行排序、修剪、空隙填補和連接.其中的懸垂切割步驟使短片段(比DNase消化片段還短)得以重組,明顯提高了重組頻率；如果在片段重組前后采用錯誤傾向PCR還可引入額外點突變。第八十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第八十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二CoCo等首次報道此法改造二苯并噻吩單加氧酶,產(chǎn)生的嵌合文庫平均每個基因含14個交叉,重組水平比DNAshuffling類方法(1～4個交叉)高出幾倍；并且可在短至5bp的序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生交叉。這種高頻率、高密度的交叉水平是DNAshuffling所難以達到的。第八十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（6）酵母增強組合文庫CLERY是一個真核基因家族shuffling策略.其原理是將體外DNAshuffling程序與接下來的酵母體內(nèi)重組締合起來,構(gòu)建高豐度低親本水平的重組文庫:直接以含目的基因的質(zhì)粒作為體外shuffling的模板;shuffling后基因產(chǎn)物與線性化的酵母表達載體共轉(zhuǎn)化酵母細胞啟動體內(nèi)重組事件，同時表達功能性重組子直接用于篩選。第八十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二3、通過基因嵌合獲得改性的雜合酶雜合酶是把來自不同酶分子中的結(jié)構(gòu)單元（二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、功能域）或整個酶分子進行組合或交換，以產(chǎn)生具有所需性質(zhì)的優(yōu)化酶雜合體。第八十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二4、核苷酸類似物在分子定向進化中的應用許多核苷酸類似物可與天然DNA/RNA中的相應堿基配對，并且由于這種特有的性質(zhì)被稱為通用堿基。第八十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二漸增切割法產(chǎn)生雜和酶Benkovic研究組建立了漸增切割法產(chǎn)生雜和酶(incrementaltruncationforthecreationofhybridenzymes)及ThioITCHY(α-硫代磷酸核苷酸介導的ITCHY)方法來產(chǎn)生不依賴于ＤＮＡ序列同源性的重組文庫。

ITCHY的基本原理是：控制核酸外切酶Ⅲ的切割速度不大于10堿基/min，然后間隔很短時間連續(xù)取樣終止反應,以獲得一組依次有一個堿基缺失的片段庫；然后將基因Ａ的一組隨機長度的5′端片段與基因Ｂ的一組隨機長度的3′端片段隨機融合產(chǎn)生雜合基因文庫。第九十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第九十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二但由于該方案冗長繁瑣，Lutz等又提出了ThioITCHY方法：首先將待重組的兩基因串聯(lián)在同一載體上,然后通過PCR反應或單鏈模板引伸反應將α-硫代磷酸核苷酸隨機引入產(chǎn)物中,由于其抗核酸外切酶Ⅲ的切割,接下來的切割反應會在此處隨機終止,連接切割產(chǎn)物即產(chǎn)生隨機交叉文庫.該法操作便利,同時也可引入隨機點突變。此外，ITCHY/ThioITCHY不依賴ＤＮＡ序列同源性,可在非序列同一區(qū)內(nèi)產(chǎn)生活性融合子，迭代ITCHY或?qū)ζ湮膸爝M行shuffling還可以創(chuàng)造多個交叉。第九十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二三、基因文庫的構(gòu)建與篩選1、構(gòu)建理想的基因文庫要考慮的因素（1）基因文庫的質(zhì)量具體反映在文庫的代表性和突變基因片段的序列的完整性。①文庫的代表性：指文庫中包含的DNA分子是否能完整地反映出源基因的全部可能的變化和改變，它是體現(xiàn)文庫質(zhì)量的最重要指標。②突變基因片段的序列完整性（2）文庫篩選可選擇的方法第九十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二2、突變體基因的構(gòu)建策略（1）DNA隨機酶切片段拼接（2）單鏈DNA隨機拼接（3）限制性酶切片段隨機拼接第九十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二(1)DNA隨機酶切片段連接將兩個高度同源的基因經(jīng)DNAaseI酶隨機剪切得到大量的酶切片段，接著采取“無引物”PCR擴增法將同源片段隨機重組，然后通過特異性引物PCR擴增全長基因。重組---擴增---篩選第九十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）單鏈DNA隨機拼接單鏈DNA為模板鏈，以此制備片斷化得DNA片段，然后進行同源片段隨機拼接重組。第九十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）限制性酶切片段隨機拼接采用特定的限制性酶切片段對DNA進行切割，產(chǎn)生的都是特異的限制性酶切片段，不存在親代基因自身同源酶切片段隨機拼接現(xiàn)象。第九十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二3、構(gòu)建突變基因文庫的載體系統(tǒng)λ噬菌體載體系統(tǒng)：片段裝載量大，適合長期保存，篩選方法有限。質(zhì)粒載體系統(tǒng)：適合大部分基因突變，可進行功能性篩選，但容量小，轉(zhuǎn)化效率偏低。第九十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二4、文庫的篩選

建立有效的搜索蛋白質(zhì)文庫的方法是影響定向進化成功與否的關鍵。突變體基因文庫中包含性能改進的酶基因，必須構(gòu)建大容量，多樣化的至少106以上庫容量的突變文庫。當突變體酶可賦予宿主細胞生長或存活的優(yōu)勢時,很容易搜尋含有106以上個蛋白質(zhì)突變體的文庫。然而,這類情況并不多見。當感興趣的功能可產(chǎn)生可見的信號時,簡單的肉眼可見的篩選方法被廣泛地應用。例如,菌落分泌出有活性的蛋白酶可在含有酪蛋白的瓊脂平板上產(chǎn)生清晰的水解圈,其大小與水解活性成正比。第九十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二另外,易被觀察的菌落表型也可用于快速篩選。盡管根據(jù)顏色或水解圈形成的篩選方法快速高效,但也有明顯的局限性。它是非定量的,而且經(jīng)常對性狀的微小變化不靈敏。高通量96孔板適合自動定量篩選,能鑒定出酶對底物的特異性、熱穩(wěn)定性、對映體選擇性及其他特定性狀等。第一百頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百零一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（1）篩選與優(yōu)選策略

screeningSelection：典型的策略是構(gòu)建代謝缺失型的宿主菌株第一百零二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（2）基于表型觀察的篩選

目前，陽性克隆的篩選一般都依賴于克隆的表型（營養(yǎng)缺陷型或抗生素抗性）篩選，這是一種定性的篩選方法，而DNA隨機拼接需要在突變體基因文庫中篩選出性狀更優(yōu)的突變酶，因此很多情況下實際上是一種定量的篩選過程，需要將基因表達產(chǎn)物的活性和轉(zhuǎn)化子的表型定量聯(lián)系起來。第一百零三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二（3）基于基因編碼蛋白質(zhì)的檢測篩選

①噬菌體表面展示技術②酵母雙雜交系統(tǒng)③酵母單雜交系統(tǒng)第一百零四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二①噬菌體表面展示技術

噬菌體表面展示技術：是將外源蛋白質(zhì)或多肽的基因表達產(chǎn)物與噬菌體衣殼蛋白融合,并在其表面展示,同時將其遺傳密碼信息整合到個體噬菌體的基因組中。這個技術的最大優(yōu)點是直接將可現(xiàn)的表達型與其基因型聯(lián)系在一起,再利用其配體的特異性親和力,將所感興趣的蛋白質(zhì)或多肽挑選出來。第一百零五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百零六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百零七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二優(yōu)點特異、有效地從龐大的重組噬菌體群體中富集到極稀少的表面展示蛋白與配基結(jié)合的重組噬菌體克隆。篩選時，獲得編碼這一表型的目的基因。可塑性。第一百零八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二②酵母雙雜交系統(tǒng)

將編碼某一蛋白X的DNA序列與DNA結(jié)合域BD的編碼序列融合形成一個雜交體，將編碼另一蛋白Y的DNA序列與DNA激活域AD的編碼序列融合形成另一個雜交體，當兩個雜交體共轉(zhuǎn)化酵母細胞（此酵母細胞上游有DNA結(jié)合位點的報告基因），若X和Y沒有相互作用，則單獨不能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄；若X和Y可相互作用，則使BD和AD靠近形成一個有效的轉(zhuǎn)錄激活子，激活報告基因的轉(zhuǎn)錄。因此可通過檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。第一百零九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二酵母雙雜交模型DNA-BindingDomainBaitProteinPreyProteinTranscriptionActivatingRegionReporterGeneDNA-BindingSite第一百一十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二模型第一百一十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二文庫篩選的步驟將待測基因與Gal4或LexA或其他合適蛋白的DNA結(jié)合域融合構(gòu)建誘餌質(zhì)粒將誘餌質(zhì)粒轉(zhuǎn)化缺乏報告基因啟動子的酵母細胞株中，選擇被轉(zhuǎn)化的酵母再將文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母中通過報告基因的功能篩選相互作用的蛋白第一百一十三頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十四頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十五頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十六頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十七頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十八頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百一十九頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二③酵母單雜交系統(tǒng)真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由一個DNA特異性結(jié)合功能域和一個或多個其他調(diào)控蛋白相互作用的激活功能域組成。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨立地發(fā)揮作用。據(jù)此，我們可將GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域置換為文庫蛋白編碼基因，只要其表達的蛋白能與目的基因相互作用，同樣可通過轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域激活RNA聚合酶，啟動下游報告基因的轉(zhuǎn)錄。第一百二十頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二第一百二十一頁，共一百三十三頁，編輯于2023年，星期二酵母單雜交的基本操作過程

(1)設計含目的基因(稱為誘餌)和下游報告基因的質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)入酵母細胞。

(2)將文庫蛋白的編碼基因片段與GAL4轉(zhuǎn)錄激活域融合表達的cDNA文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化人同一酵母中。(3)若文庫蛋白與目的基因相互作用，可通過報告基因的表達將文庫蛋白的編碼基因篩選出來。在這里作為誘餌的目的基因就是啟動子DNA片段，文庫基因所編碼的蛋白就是啟動子基因結(jié)合蛋白。第一百二十二頁，共一百三十三頁，編輯于2023