高效液相色譜法

高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatograph------HPLC)藥物分析教研室1當前第1頁\共有83頁\編于星期六\11點

HPLC法以經(jīng)典LC為基礎(chǔ)，引入GC的理論與技術(shù)，并加以改進而發(fā)展起來的一種分離分析方法。是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，用高壓輸液系統(tǒng)，將流動相泵入色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。2當前第2頁\共有83頁\編于星期六\11點【示例10-1】現(xiàn)行《中國藥典》二部阿司匹林片劑的含量測定。色譜條件：用十八烷基鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（20：5：5：70）為流動相；檢測波長為276nm。取片劑20片用1%冰醋酸-甲醇溶液精密制成100mL，精密配制阿司匹林0.lg/L對照品溶液，分別精密取供試品與對照品溶液10μL，進行測定。按外標法以峰面積計算，即得。3當前第3頁\共有83頁\編于星期六\11點HPLC與經(jīng)典LC的比較相同點：均有四種色譜機理液固吸附色譜(HPLSC)

液液分配色譜(HPLLC)

離子交換色譜(HPIEC)

凝膠色譜(HPGPC)4當前第4頁\共有83頁\編于星期六\11點不同點:

LCHPLC

固定相

全多孔表面多孔型的無定型全多孔微粒

粒度不均勻不耐高壓均勻耐高壓

操作壓力常壓、低壓高壓

柱效

10-100/m104-106/m

柱長

1-2m10-25cm

柱內(nèi)徑

2-5cm0.2-0.5cm

5當前第5頁\共有83頁\編于星期六\11點不同點:

LCHPLC

樣品用量

1-10g10-6-10-2g分析時間長1-20h10-幾十min

裝置間斷連續(xù)、自動化非儀器儀器化精度低精度高6當前第6頁\共有83頁\編于星期六\11點

10.1高效液相色譜法類型10.2常用固定相與流動相10.3高效液相色譜儀10.4高效液相色譜條件選擇10.5應(yīng)用與實例7當前第7頁\共有83頁\編于星期六\11點

HPLC特點三高、兩廣、一少

高效化、高速化、高靈敏度分析范圍廣、流動相選擇范圍廣樣品用量少色譜柱可反復(fù)使用、流出組分易收集、安全8當前第8頁\共有83頁\編于星期六\11點HPLC類型按實驗?zāi)康?/p>

分析型（?1～6：4.6、2.1mm）

制備型（?10～500mm）按分離機制9當前第9頁\共有83頁\編于星期六\11點按分離機制10當前第10頁\共有83頁\編于星期六\11點HPLC類型反相鍵合相色譜法反相離子抑制色譜法反相離子對色譜法手性色譜法親和色譜法11當前第11頁\共有83頁\編于星期六\11點

液-固吸附色譜固定相

HPLC固定相主要用硅膠。（1)無定形全多孔硅膠：YWG(2)球形全多孔硅膠：YQG(3）堆積硅珠：YQG高分子多孔微球：YSG12當前第12頁\共有83頁\編于星期六\11點化學(xué)鍵合相色譜固定相將固定液的官能團鍵合在載體的表面而構(gòu)成化學(xué)鍵合相。以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法稱為化學(xué)鍵合相色譜法(BPC)，簡稱鍵合相色譜法。

13當前第13頁\共有83頁\編于星期六\11點化學(xué)鍵合相的形成14當前第14頁\共有83頁\編于星期六\11點性能指標1）覆蓋率指參與反應(yīng)的硅醇基數(shù)目占硅膠表面硅醇基總數(shù)的比例。覆蓋率的大小決定鍵合相是分配還是吸附占主導(dǎo)。（2）含碳量(C%)表示鍵合相的鍵合量，與鍵合反應(yīng)及表面覆蓋率有關(guān)。高碳、中碳及低碳型15當前第15頁\共有83頁\編于星期六\11點

特點機理：吸附&分配化學(xué)鍵合相色譜法（BPC）化學(xué)鍵合相的優(yōu)點：使用過程不流失，耐溶劑沖洗化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，柱子不嬌

熱穩(wěn)定性好載樣量大適用于梯度洗脫16當前第16頁\共有83頁\編于星期六\11點

化學(xué)鍵合相的類型全多孔硅膠為基體鍵合相的表面結(jié)構(gòu)：單分子鍵合Si-O-C，Si-O-Si-C

聚合鍵合Si-O-Si-C結(jié)合的化學(xué)鍵類型：

Si-O-C、Si-N、Si-C、Si-O-Si-C極性：非極性、中等極性、極性

17當前第17頁\共有83頁\編于星期六\11點

1)非極性鍵合相：表面基團為非極性烴基，C18、C8、甲基、苯基等，用作反相色譜的固定相。最常用的非極性鍵合相是十八烷基鍵合相（ODS鍵合相），洗脫劑多為強極性溶劑，如水、醇、乙腈或無機鹽緩沖液。常用CH3OH—H2O作流動相，極性大先出峰，極性小后出峰。18當前第18頁\共有83頁\編于星期六\11點反相色譜常用的微粒鍵合相

官能團

載體

顆粒直徑十八烷基

Zorbax3~10um辛烷基

Nucleosil100A3~10um苯基

mporasil~7um二甲硅烷

Lichrosorb3~10um19當前第19頁\共有83頁\編于星期六\11點

2)中等極性鍵合相常用的有醚基鍵合相，既可作正相又可作反相色譜的固定相，視流動相的極性而定。20當前第20頁\共有83頁\編于星期六\11點

3)極性鍵合相常用氨基、氰基鍵合相?？捎米髡嗌V的固定相，洗脫劑常用非極性或弱極性溶劑，加入適量的極性溶劑，以調(diào)節(jié)洗脫強度。極性小的先出峰，極性大的后出峰。21當前第21頁\共有83頁\編于星期六\11點正相色譜常用固定相結(jié)構(gòu)氰基

-(CH2)3C=N氨基

-(CH2)nNH2(n=3or4)二醇

-(CH2)3OCH(OH)CH2OH二甲氨基

-(CH2)3N(CH3)2二氨基

-(CH2)3NH(CH2)2NH2當前第22頁\共有83頁\編于星期六\11點常用流動相及其選擇選擇流動相：（1）化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。（2）粘度小。（3）溶劑的純度要高。（4）沸點低（制備型）。（5）與色譜系統(tǒng)的適應(yīng)性好。23當前第23頁\共有83頁\編于星期六\11點液固色譜流動相選擇原則極性大的試樣用極性強的洗脫劑極性小的試樣用極性弱的洗脫劑洗脫劑的極性強弱可用溶劑強度(ε0)參數(shù)來衡量；分離復(fù)雜試樣，采用梯度洗脫。24當前第24頁\共有83頁\編于星期六\11點液固色譜中流動相的選擇(1)強溶劑

與硅膠表面活性位置結(jié)合能力強的溶劑，洗脫溶質(zhì)分子的能力也強。(2)弱溶劑

與硅膠表面活性位置結(jié)合能力弱的溶劑，洗脫溶質(zhì)分子的能力也弱。(3)結(jié)合能eoeo值越大，溶劑為強溶劑。常用：正已烷、異辛烷、氯仿、異丙醇、乙腈等。(4)eo的特點

溶劑強度與溶劑的體積百分比不成線性關(guān)系。(5)含水量的控制

通過有機修飾劑的調(diào)節(jié)，控制硅膠的含水量。25當前第25頁\共有83頁\編于星期六\11點反相色譜流動相注意：A緩沖離子不能產(chǎn)生沉淀。B溶劑的紫外切點必須小于所使用的檢測波長。C避免使用鹵族離子。DpH調(diào)節(jié)在2~7.5之間。不能超過7.5，否則硅膠將被溶解！26當前第26頁\共有83頁\編于星期六\11點反相色譜的流動相最常用：水、甲醇、乙腈、丙酮、異丙醇、四氫呋喃等。主要組成是水，極性和表面張力最高，最弱的流動相，以此洗脫非極性組分時，表現(xiàn)出的滯留時間最長。甲醇和乙腈，是最常用的調(diào)節(jié)劑。（因為甲醇和乙腈的紫外切點相對較低，且粘度較小，及易于提純。）規(guī)律：水量越高，保留時間越長。27當前第27頁\共有83頁\編于星期六\11點規(guī)律①組分分子結(jié)構(gòu)對保留值的影響：組分的保留值與其分子中非極性部分的總表面積越大，保留值也越大。②烷基鍵合相的特性對保留值的影響：隨碳鏈的加長，組分的保留值增加，對組分分離的選擇性也增加。③流動相性質(zhì)對保留值的影響：流動相的表面張力越大、介電常數(shù)越大，其極性越強，流動相的洗脫強度越弱，組分的保留值越大。28當前第28頁\共有83頁\編于星期六\11點正相色譜的流動相

正相色譜的流動相最常用的是烷烴溶劑。如：正戊烷、正己烷、正庚烷、環(huán)已烷等。

流動相的極性越強洗脫能力越強，也就是強溶劑。反之為弱溶液劑。當前第29頁\共有83頁\編于星期六\11點

當前第30頁\共有83頁\編于星期六\11點液-固色譜的應(yīng)用(1)主要用于脂溶性化合物的分離：如磷脂、甾體化合物、脂溶性維生素、前列腺素等。(2)分離幾何異構(gòu)體：

如維生素A的幾何異構(gòu)體。(3)分類分離（族的分離）：從非極性很強的甾醇化合物到極性很強的磷脂酸。一般來講，溶解于有機溶劑的樣品可得到最佳分離，而強極性或離子型樣品常常得不到令人滿意的結(jié)果。31當前第31頁\共有83頁\編于星期六\11點反相色譜的應(yīng)用可分離極性到非極性的各種化合物。A氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)的分離。B堿基、核苷和核苷酸的分離。C甾體化合物的分離。D其它：兒茶酚胺、組胺、糖類、維生素、酶等。

32當前第32頁\共有83頁\編于星期六\11點反相色譜的特點A適于分離帶有不同疏水基團的化合物。B可通過改變?nèi)軇┙M成和pH，來分離不同極性的化合物。C可分離從極性到非極性的寬范圍的化合物。33當前第33頁\共有83頁\編于星期六\11點正相色譜的應(yīng)用正相色譜適用于分離極性化合物。如：酚類、胺類、多環(huán)化合物、染料、炸藥、羥基化合物、氨基酸和藥物等。這些樣品在正己烷或其它烷烴溶劑中的溶解度很小，在極性溶劑中的溶解度良好。用正相色譜分離可得到較好的效果。

在使用正相色譜時一個值得注意的問題是在用氨基作固定相分離糖時，一些還原糖容易與固定相的氨基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生席夫堿（Schiffsbase)。當前第34頁\共有83頁\編于星期六\11點10.3

HPLC色譜儀HPLC儀組成主要部件及功能35當前第35頁\共有83頁\編于星期六\11點

HPLC儀組成高壓輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)36當前第36頁\共有83頁\編于星期六\11點HPLC的組成及工作流程1螺旋注射泵

2往復(fù)柱塞泵

3往復(fù)隔膜泵

4氣動放大泵1自動進樣器

2手動進樣器1液固

2液液

3離子交換

4空間排阻1紫外檢測器

2熒光檢測器

3示差折光檢測器

4電化學(xué)檢測器

5電導(dǎo)檢測器

6放射性檢測器色譜柱“心臟”37當前第37頁\共有83頁\編于星期六\11點38當前第38頁\共有83頁\編于星期六\11點

主要部件

(一)輸液泵

(二)進樣器

(三)色譜柱

(四)檢測器39當前第39頁\共有83頁\編于星期六\11點

(一)輸液泵高壓輸液系統(tǒng)泵的類別對泵的要求泵的保養(yǎng)40當前第40頁\共有83頁\編于星期六\11點1.高壓輸液系統(tǒng)

儲液罐脫氣裝置過濾器高壓輸液泵梯度洗脫裝置壓力脈動阻滯器關(guān)鍵41當前第41頁\共有83頁\編于星期六\11點

2.泵的類別螺旋注射泵往復(fù)柱塞泵往復(fù)隔膜泵氣動放大泵42當前第42頁\共有83頁\編于星期六\11點

3.對泵的要求流量恒定，精密度高±1%輸出壓力高，平穩(wěn)流量范圍寬0.01-10ml/min

制備液相流速較高耐高壓耐腐蝕泵體易于清洗43當前第43頁\共有83頁\編于星期六\11點

4.泵的保養(yǎng)如果流動相有酸、堿、鹽等緩沖體系，必須用水沖洗。如果壓力過大，混合器可用6mol/LHNO3超聲，再用水超聲。對儀器的拆卸應(yīng)在儀器負責(zé)人或廠家工程師的指導(dǎo)下進行。觀察有無漏液44當前第44頁\共有83頁\編于星期六\11點(二)進樣針

手動

高壓進樣閥注射器進樣自動

自動進樣器

圓盤式自動進樣器

鏈式自動進樣器45當前第45頁\共有83頁\編于星期六\11點六通閥手動進樣器

46當前第46頁\共有83頁\編于星期六\11點

（Load）

（Inject）

47當前第47頁\共有83頁\編于星期六\11點48當前第48頁\共有83頁\編于星期六\11點

(三)色譜柱色譜柱由柱管和固定相組成。對柱的要求:

承受高壓、對流動相呈化學(xué)惰性、對樣品的Rs大柱容量大、分析速度快49當前第49頁\共有83頁\編于星期六\11點

1.色譜柱尺寸2.色譜柱的裝填3.色譜柱柱效的評價4.色譜柱的保養(yǎng)5.柱溫箱50當前第50頁\共有83頁\編于星期六\11點1.色譜柱尺寸分析型：?5mm或4.6mm制備型：?＞5mm以上微徑柱：?<2mm柱長：10～25cm，30cm很少見柱體：直型優(yōu)質(zhì)不銹鋼柱管51當前第51頁\共有83頁\編于星期六\11點2.色譜柱的裝填1)方法干法裝柱、勻漿法裝柱2)裝柱要求均勻緊密、不破壞顆粒、不形成裂縫、顆粒粗細不可分級52當前第52頁\共有83頁\編于星期六\11點3.色譜柱柱效的評價最小理論塔板數(shù)n＞104分離度R≥1.5拖尾因子相對保留值的再現(xiàn)性53當前第53頁\共有83頁\編于星期六\11點4.色譜柱的保養(yǎng)注意流動相的純化防止堵塞和污染柱的操作壓力＜裝填柱的壓力應(yīng)該用進樣閥進樣防止柱的反沖貯存色譜柱時應(yīng)防止干涸使用保護（預(yù)）柱54當前第54頁\共有83頁\編于星期六\11點5.柱溫箱采用循環(huán)空氣浴周圍環(huán)境要保持恒定55當前第55頁\共有83頁\編于星期六\11點(四)檢測器對檢測器的要求檢測器分類56當前第56頁\共有83頁\編于星期六\11點

1.對檢測器的要求靈敏度高噪音低線性范圍寬重復(fù)性好適用化合物的種類廣57當前第57頁\共有83頁\編于星期六\11點2.檢測器分類選擇性檢測器

——組分性質(zhì)檢測器通用型檢測器

——總體性檢測器58當前第58頁\共有83頁\編于星期六\11點

紫外(UVD)

選擇性檢測器

熒光(FD)

電化學(xué)(ECD)

59當前第59頁\共有83頁\編于星期六\11點

通用型檢測器蒸發(fā)激光散射檢測器(ELSD)示差折光檢測器(RID)質(zhì)譜檢測器(MS)60當前第60頁\共有83頁\編于星期六\11點

(1)紫外檢測器(UVD)1)原理：被測組分對指定波長的紫外光的選擇性吸收固定波長型2)類型可變波長型

掃描型

光電二極管陣列(DAD)61當前第61頁\共有83頁\編于星期六\11點

3)特點:靈敏度高、噪音低；不破壞樣品、能與其他DET串聯(lián)，可用于制備；對溫度及流動相流速波動不敏感，可用于梯度淋洗4)弱點:只能檢測有UV吸收的樣品；流動相的選擇有一定的限制62當前第62頁\共有83頁\編于星期六\11點(2)蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)

1)原理：粒子對光的散射2)組成：噴嘴、漂移管、光電管3)定量依據(jù)：E=Kmn63當前第63頁\共有83頁\編于星期六\11點(3)熒光檢測器1)原理：物質(zhì)分子的熒光吸收2)優(yōu)點：固有的靈敏度和選擇性3)缺點：應(yīng)用不廣泛64當前第64頁\共有83頁\編于星期六\11點(4)其他檢測器示差折光檢測器(RID)電化學(xué)檢測器(ECD)紅外檢測器介電常數(shù)檢測器放射性檢測器

MS檢測器

NHM檢測器65當前第65頁\共有83頁\編于星期六\11點高效液相色譜條件選擇1、柱內(nèi)展寬

渦流擴散項A縱向擴散項B/u

提高柱效方法流動的流動相的傳質(zhì)阻力項Csmu靜態(tài)流動相的傳質(zhì)阻力項Csmu

固定相的傳質(zhì)阻力項Csu

2.柱外展寬提高柱效方法66當前第66頁\共有83頁\編于星期六\11點選擇流動相溶劑的原則k2的大小主要取決于流動相溶劑的極性

α主要取決于流動相溶劑的選擇性改善分離度的方法

67當前第67頁\共有83頁\編于星期六\11點實驗條件對分離的影響A溫度：反相色譜流動相當為含有機溶劑的水溶液時，粘度較高，最好在較高柱溫下操作，以減少粘度，柱溫一般在30~400C。最高可達800C。BpH值：對于可溶解的組分，改變流動相

pH值，可以改變分離的選擇性，采用一定pH值的緩沖溶液作流動相，可以抑制組分的離解。減少峰的拖尾。68當前第68頁\共有83頁\編于星期六\11點

注意流動相：物理性質(zhì)極性選擇性使用前處理69當前第69頁\共有83頁\編于星期六\11點

物理性質(zhì)（1）對檢測器的適應(yīng)性（2）溶劑的粘度和沸點（3）溶解特性70當前第70頁\共有83頁\編于星期六\11點

流動相的物理性質(zhì)（1）對檢測器的適應(yīng)性：

示差折光檢測器：流動相的折射率與樣品折射率有差別。折射率差別越大檢測器的靈敏度越高。

紫外檢測器：必須選擇紫外切點小于檢測器波長的溶劑作流動相。

熒光檢測器：流動相的紫外切點必須小于檢測器所使用的激發(fā)光波長，流動相不能引起熒光淬滅。71當前第71頁\共有83頁\編于星期六\11點流動相的物理性質(zhì)（2）溶劑的粘度和沸點：溶劑的粘度影響色譜分析的分辨率：在色譜分析中盡量選擇粘度小的溶劑，提高分辨率。但溶劑的粘度小往往沸點也低，容易揮發(fā)，在色譜過程中容易產(chǎn)生氣泡，干擾檢測器的工作；在使用兩種不同溶劑的混合物做流動相時，還容易改變不同溶劑的比例，降低分析結(jié)果的重現(xiàn)性。因此沸點過低的溶劑不適宜做流動相，流動相的沸點至少應(yīng)比色譜分析的溫度高30度。72當前第72頁\共有83頁\編于星期六\11點

如：

乙醇的價格雖低，但粘度較大沸點略高；

甲醇的粘度較小沸點最低，價格適中；

乙腈的粘度最小沸點較低，但價格較高；

在HPLC中常用甲醇作流動相。73當前第73頁\共有83頁\編于星期六\11點

流動相的物理性質(zhì)（3）溶解特性：

HPLC要求組成流動相的溶劑彼此能夠互相溶解。74當前第74頁\共有83頁\編于星期六\11點75當前第75頁\共有83頁\編于星期六\11點

溶劑的極性

溶劑的極性：溶劑分子與溶質(zhì)分子間的相互作用能力的大小。這種能力是