酶標(biāo)記和免疫層析法技術(shù)課件

酶標(biāo)記和免疫層析法技術(shù)黃陂區(qū)人民醫(yī)院酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELSA)今1、1簡介:基本概念:抗原:抗原是指進(jìn)入人或動物機(jī)體后,可刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答,從而引起動物產(chǎn)生抗體或形成致敏淋巴細(xì)胞,并能和抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)?？贵w:是由抗原刺激動物的免疫系統(tǒng)后,由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生分泌的能和相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白?？乖贵w的基本特性:a、反應(yīng)的特異性;b、反應(yīng)的等比例性1.2、ELSA方法簡介今ELSA屬于標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)的一種,1971年由荷蘭和瑞典的學(xué)者提出,由于其操作過程簡單易行并可以定量,從而使其在醫(yī)學(xué)檢驗中得到了廣泛的應(yīng)用13、ELSA方法的原理基于抗原抗體反應(yīng)的特異性和等比例性,以聚苯乙烯塑料微孔板為載體,在適當(dāng)?shù)募夹g(shù)條件下使抗原或抗體包被(吸附)在酶標(biāo)板微孔的內(nèi)壁上成為包被抗體或抗原,沒有被吸附的抗原或抗體通過洗滌除去,然后直接加入酶標(biāo)記抗體或抗原形成酶標(biāo)記的抗原一抗體復(fù)合物固定在微孔內(nèi),沒有吸附的酶標(biāo)記物洗滌去除,在微孔中加入底物溶液,復(fù)合物上的酶催化底物使其水解、氧化或還原成為有色的底物。復(fù)合物上酶的量和酶產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤成正比,因此可以用酶標(biāo)儀進(jìn)行測定,從而計算出參與反應(yīng)的抗原和抗體的量。今14、ELSA方法的分類ELSA可以分為直接法、間接法和夾心法等幾種直接法:直接法是指酶標(biāo)抗原或抗體直接與包被在酶標(biāo)板上的抗體或抗原結(jié)合形成酶標(biāo)抗原一抗體復(fù)合物,加入酶反應(yīng)底物,測定產(chǎn)物的吸光值,計算岀包被在酶標(biāo)上的抗體或抗原的量。見圖2-17(a)間接法◆是將酶標(biāo)記在二抗上,當(dāng)抗體(一抗)和包被在酶標(biāo)板的抗原結(jié)合形成復(fù)合后,再以酶標(biāo)二抗和復(fù)合物結(jié)合,通過測定酶反應(yīng)產(chǎn)物的顏色可以反應(yīng)一抗和抗原的結(jié)合情況,進(jìn)而計算出抗原或抗體的量。見圖2-17(b)夾心法令是先將未標(biāo)記的抗體包被在酶標(biāo)板上,用于捕獲抗原,在用酶標(biāo)的抗體與抗原反應(yīng)形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物;也可以象間接法一樣應(yīng)用酶標(biāo)二抗和抗體-抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合形成抗體-抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物,見圖2-17(C)。前者稱為直接夾心法,后者稱為間接夾心法。ELSA原理及分類(圖217)①抗體包被l、x小*+平②抗原包被)問接法▲▲▲▲▲人人人人人①直接夾心法丫丫②間接夾心法代表抗質(zhì)↓代表框標(biāo)抗丫代表抗體大代表標(biāo)沉體員代表產(chǎn)物圖2-17ELISA原理圖引自于善謙等今上述三種方法又可以分為競爭法和非競爭法。下面對接法中的酶標(biāo)抗原競爭法作重點說明。在進(jìn)行測定時首先將包被了抗體的酶標(biāo)板的微孔分為測定孔和對照孔,在對照孔中加入系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液和酶標(biāo)記物;在測定孔中同時加入酶標(biāo)記物和非酶標(biāo)抗原(通常來自于待測樣品),酶標(biāo)記物和樣品互相競爭包被抗體的結(jié)合點,經(jīng)過溫浴后,沒有結(jié)合到包被抗體上的酶標(biāo)記物和樣品經(jīng)過洗滌去除。拍干后加入底物溶液,經(jīng)溫育后洗滌拍干,顯色、終止,用