乙肝疫苗生產(chǎn)發(fā)展簡(jiǎn)介

乙肝疫苗生產(chǎn)發(fā)展簡(jiǎn)介當(dāng)前第1頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)疫苗的生產(chǎn)

1，滅活死疫苗患者---分離出致病微生物（細(xì)菌或者病毒）-----通過培養(yǎng)細(xì)菌（培養(yǎng)基）或者病毒（細(xì)胞），獲得大量的致病微生物---用甲醛滅活（殺死）致病微生物---純化---鋁吸附-----滅活死疫苗。當(dāng)前第2頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)2，減毒活疫苗患者---分離出致病微生物（細(xì)菌或者病毒）-----通過改變培養(yǎng)條件，獲得不再致病微生物---培養(yǎng)不再致病微生物，獲得大量的不再致病微生物---鋁吸附-----減毒活疫苗。當(dāng)前第3頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)乙肝病毒的體外培養(yǎng)至今沒有成功前面，我們已經(jīng)講過，細(xì)菌要在培養(yǎng)基中繁殖，病毒要在細(xì)胞中繁殖，比如，流感病毒在雞胚細(xì)胞中生長(zhǎng)，狂犬病毒要在地鼠腎細(xì)胞中生生長(zhǎng)，乙腦病毒要在vero細(xì)胞中生長(zhǎng)?？墒且腋尾《驹谒袑?shí)驗(yàn)過的細(xì)胞中都不能生長(zhǎng)。乙肝疫苗的研究受到了嚴(yán)重的困難。人們不得不尋求其他的途徑去生產(chǎn)乙肝疫苗。當(dāng)前第4頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)乙肝抗原的來源1，乙肝患者的血液：血源性乙肝疫苗。2，利用DNA重組技術(shù)構(gòu)建重組微生物（酵母）表達(dá)（合成）乙肝抗原：基因工程乙肝疫苗當(dāng)前第5頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

乙肝疫苗發(fā)展歷史1,1963年Blumberg發(fā)現(xiàn)在血友病患者的血清中存在一種抗體，這種抗體能與澳大利亞土著人血液中的一種抗原起交叉反應(yīng)，這種抗原被命名為“澳大利亞”抗原。2,1968年P(guān)rince在血清型肝炎（乙型肝炎）患者血清中發(fā)現(xiàn)抗原性與澳大利亞抗原相同的病毒樣顆粒，進(jìn)而初步認(rèn)定澳大利亞抗原就是乙肝表面抗原。3,1970年Dane用電子顯微鏡在乙肝患者血清中發(fā)現(xiàn)直徑為42nm完整乙肝病毒顆粒及直徑為22nm的球形和桿形的乙肝表面抗原。當(dāng)前第6頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)4,1971年Krugman發(fā)現(xiàn)加熱處理的急性期乙肝患者的血清能部分預(yù)防乙肝感染。5,1981年Merck公司在世界上首次研制成功第一代乙肝疫苗——血源性乙肝疫苗。6,1985年北京生物制品研究所在國(guó)內(nèi)首次研制成功血源性乙肝疫苗.7,1986年Merck公司在世界上首次研制成功第二代乙肝疫苗-----重組酵母乙肝。當(dāng)前第7頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)8,1989年北京生物制品研究所與Merck公司簽訂合同，引進(jìn)重組酵母乙肝疫苗工業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)。1993年5月開始試生產(chǎn)。9,90年代德國(guó)萊茵生物技術(shù)公司發(fā)展了一種甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母---漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng),其乙肝表面抗原表達(dá)水平可達(dá)到500-1000mg/L.南韓綠十字疫苗公司應(yīng)用該表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了重組漢遜酵母乙肝疫苗的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。當(dāng)前第8頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)10,大連高新（漢信）生物制藥有限公司從1998年開始重組漢遜酵母乙肝疫苗的研制工作，在2002年6月獲得了國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的“新藥證書”，在2003年開始商業(yè)化生產(chǎn)。

11,華蘭生物在2009年也將開始重組漢遜酵母乙肝疫苗的生產(chǎn)。當(dāng)前第9頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

乙肝疫苗的發(fā)展歷史第一代乙肝疫苗；血源性乙肝疫苗。第二代乙肝疫苗；基因工程乙肝疫苗。當(dāng)前第10頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

基因工程乙肝疫苗1，CHO細(xì)胞乙肝疫苗。2，重組釀酒酵母乙肝疫苗。

(第一代重組酵母乙肝疫苗）3，重組漢遜酵母乙肝疫苗。

(第二代重組酵母乙肝疫苗）當(dāng)前第11頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

乙肝疫苗的發(fā)展歷程：n80年代初期-----血源性乙肝疫苗（第一代乙肝疫苗）。1995年停產(chǎn)。n80年代中期----基因工程乙肝疫苗（第二代乙肝疫苗）。包括：重組釀酒酵母乙肝疫苗，表達(dá)水平不理想—50mg/L。5ug/0,5ml的成人劑量偏低，抗體滴度偏低。重組CHO細(xì)胞乙肝疫苗，表達(dá)水平低，2-5mg/L，母嬰阻斷效果不理想重組牛痘病毒乙肝疫苗。表達(dá)水平低，1-3mg/L，無法實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。n90年代初期---重組漢遜酵母乙肝疫苗。更先進(jìn)的基因工程乙肝疫苗。當(dāng)前第12頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)國(guó)外主要的乙肝疫苗生產(chǎn)廠家

廠家

疫苗美國(guó)默克公司Merck重組釀酒酵母乙肝疫苗比利時(shí)史克公司Smithkline重組釀酒酵母乙肝疫苗法國(guó)巴斯德研究所PasteurMerieux重組CHO細(xì)胞乙肝疫苗德國(guó)萊茵公司下屬的韓國(guó)綠十字疫苗公司GreenCross重組漢遜酵母乙肝疫苗當(dāng)前第13頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)國(guó)內(nèi)主要的乙肝疫苗生產(chǎn)廠家

廠家

疫苗北京天壇生物制品股份有限公司(北京生物制品研究所）重組釀酒酵母乙肝疫苗深圳康泰生物制品公司重組釀酒酵母乙肝疫苗華北藥廠和長(zhǎng)春生物制品研究所等重組CHO細(xì)胞乙肝疫苗大連高新(漢信）公司和華蘭生物疫苗公司重組漢遜酵母乙肝疫苗當(dāng)前第14頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)國(guó)內(nèi)乙肝疫苗生產(chǎn)廠家工藝比較廠家種菌發(fā)酵細(xì)胞破碎粗純精純吸附北京深圳啤酒酵母四級(jí)發(fā)酵高壓破碎硅膠吸附疏水層析原位吸附大連漢信漢遜酵母四級(jí)流加球磨破碎PEG硅膠吸附DEAE分子篩區(qū)帶普通吸附華蘭生物漢遜酵母四級(jí)流加高壓破碎硫酸銨沉淀疏水DEAE分子篩普通吸附當(dāng)前第15頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)公司菌種的表達(dá)水平純化的收率北京深圳50mg/L20%大連漢信150-200mg/L15%華蘭生物200-300mg/L20%當(dāng)前第16頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)新鄉(xiāng)華蘭，大連漢信，北京天壇華蘭：菌種好，表達(dá)水平高，純化收率高，所以，總體而言，華蘭公司的技術(shù)更為先進(jìn)。當(dāng)前第17頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)北京生物制品研究所(天壇生物)生產(chǎn)的乙肝疫苗的基本情況：生產(chǎn)技術(shù)：從美國(guó)MERCK公司引進(jìn)。年產(chǎn)量：1000萬人份，3000萬支。生產(chǎn)設(shè)備：從美國(guó)購(gòu)進(jìn)。當(dāng)前第18頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)基本技術(shù)資料：菌種：重組釀酒酵母表達(dá)水平：50mg/L表達(dá)效率：1,35%(表面抗原蛋白/酵母總蛋白）純化收率：20%發(fā)酵罐工作體積：500L一次發(fā)酵所得抗原量：50mg/Lх500L=25g純化后所得抗原量25gх20%=5g可生產(chǎn)疫苗量5,000,000/5=1,000,000支當(dāng)前第19頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)北京天壇的弱項(xiàng)和不足：表達(dá)水平低，抗原數(shù)量少，每劑疫苗只含5微克或10微克的抗原，比華蘭疫苗抗原含量少一倍，所以抗體滴度低和抗體持續(xù)時(shí)間較短。當(dāng)前第20頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

北京天壇和新鄉(xiāng)華蘭表達(dá)

水平和抗原產(chǎn)量的比較 表達(dá)水平抗原產(chǎn)量北京天壇50微克低新鄉(xiāng)華蘭300微克高當(dāng)前第21頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)北京天壇和新鄉(xiāng)華蘭疫苗

抗原含量和抗體反應(yīng)的比較

每劑疫苗抗原含量抗體滴度抗體持續(xù)時(shí)間北京天壇5微克（兒童）10微克（成人）低短華蘭公司

10微克（兒童）20微克（成人）高長(zhǎng)當(dāng)前第22頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)大連漢信和新鄉(xiāng)華蘭

純化步驟和純化收率的比較純化步驟純化收率

大連漢信多低于20%新鄉(xiāng)華蘭少高于20%當(dāng)前第23頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)漢遜酵母和啤酒酵母的比較當(dāng)前第24頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

重組漢遜酵母的特點(diǎn)

（甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母）甲基營(yíng)養(yǎng)型酵母：以甲醇為唯一能源和炭源的酵母。1,多個(gè)HBsAg基因拷貝被整合到染色體中，遺傳穩(wěn)定性好。2,發(fā)酵過程中不產(chǎn)生乙醇，黏度小，可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)。當(dāng)前第25頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)3,高效表達(dá)HBsAg400-1000mg/L。

4,發(fā)酵過程中均使用化學(xué)合成培養(yǎng)基，不使用酵母粉等營(yíng)養(yǎng)成分，生產(chǎn)成本低。

5，生物安全性好，漢遜酵母是存在于土壤，水中的一種酵母種群。它不含人和動(dòng)物的病原體，不產(chǎn)生內(nèi)毒素。按照國(guó)外基因技術(shù)法規(guī)，漢遜酵母被列為基因操作生物安全性1組。與釀酒酵母屬同一生物安全等級(jí)。國(guó)外生物安全委員會(huì)還將漢遜酵母選為典型的工業(yè)菌株的研究模型。當(dāng)前第26頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)重組漢遜酵母乙肝疫苗生產(chǎn)工藝

菌種小三角瓶

大三角瓶

種子發(fā)酵罐生產(chǎn)發(fā)酵罐

細(xì)胞破碎當(dāng)前第27頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

去除細(xì)胞碎片

疏水層析

離子交換層析

凝膠過濾除菌過濾

鋁吸附當(dāng)前第28頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)種子批系統(tǒng)

SEEDLOTSYSTEM在乙肝疫苗的生產(chǎn)過程中采用種子批系統(tǒng)，即由原始種子批制備主代種子批，由主代種子制備工作種子批，每次發(fā)酵都由工作種子批中取一支菌種接種三角瓶.種子批保存在液氮或－80℃的冰箱中。其目的是為了批與批之間菌種的差別降至最低。當(dāng)前第29頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

重組漢遜酵母乙肝疫苗的人體試驗(yàn)結(jié)果A，小學(xué)生：選擇348名健康小學(xué)生（HBsAg,抗-HBs,抗-HBc陰性）年齡在6-9歲之間，隨機(jī)分為3組，每組接種1批疫苗，免疫劑量為10ug/0,5ml,免疫程序?yàn)?，1，6，第1劑免疫后3，7，12月采血樣，用Abbott試劑盒檢測(cè)抗-HBs，并觀察副反應(yīng)。結(jié)果如下：當(dāng)前第30頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小

學(xué)生抗體陽轉(zhuǎn)率和抗體GMT

疫苗批號(hào)

人數(shù)3個(gè)月7個(gè)月12個(gè)月抗體陽轉(zhuǎn)率%抗體GMT抗體陽轉(zhuǎn)率%抗體GMT抗體陽轉(zhuǎn)率%抗體GMT50111497,87230,598,25897,1100,0791,650210795,19246,6100,0915,6100,0875,1503127100,0311,699,21932,596,77867,6當(dāng)前第31頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)結(jié)論：1，重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小學(xué)生后副反應(yīng)輕微。

2，重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫小學(xué)生后抗體陽轉(zhuǎn)率和抗體水平較高。當(dāng)前第32頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

重組漢遜酵母乙肝

疫苗的人體試驗(yàn)結(jié)果B，母嬰傳播：

選擇HBsAg,HBeAg雙陽性母親所生新生兒45名，按0，1，6免疫程序接種10ug/0,5ml重組漢遜酵母乙肝疫苗,采集第1劑免疫后3，7月血樣，并檢測(cè)。同時(shí)，還免疫了41名健康母親所生的新生兒和5名HBsAg陽性,HBeAg陰性母親所生的新生兒做比較。其結(jié)果如下：當(dāng)前第33頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

重組漢遜酵母乙肝疫苗

免疫新生兒后的抗體反應(yīng)

母親新生兒數(shù)

抗-HBs陽轉(zhuǎn)率（%）

抗-HBsGMTHBsAgHBeAg3個(gè)月7個(gè)月3個(gè)月7個(gè)月++4591,1141/4593,3342/45236,6615,5+-5100,04/4100,05/5223,9677,3--4185,3735/41100,041/41344,3634,5當(dāng)前第34頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)重組漢遜酵母乙肝疫苗免疫新

生兒的阻斷母嬰傳播保護(hù)效果

母親

人數(shù)HBsAg陽轉(zhuǎn)率保護(hù)率HBsAgHBeAg3個(gè)月7個(gè)月

陽性

陽性452,22(1/45)4,44(2/45)95,07%

陽性

陰性50,00(0/4)0,00(0/4)

陰性

陰性412,44(1/41)0,00(0/41)當(dāng)前第35頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)結(jié)論：阻斷母嬰傳播的效果好，保護(hù)率達(dá)到較高水平，（95,07%）。當(dāng)前第36頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

由于重組漢遜酵母表達(dá)水平高，使重組漢遜酵母乙肝疫苗含有足夠量的抗原，抗原濃度比其它乙肝疫苗高出一倍，成人：20ug/ml,嬰兒，兒童：10ug/0,5ml。因而，免疫后產(chǎn)生的抗體不僅滴度高，而且抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。當(dāng)前第37頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)

重組漢遜酵母乙肝疫苗

的特點(diǎn)：

三高1，抗體陽轉(zhuǎn)率高。2，抗體滴度高。3，母嬰阻斷率高。

當(dāng)前第38頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)用重組漢遜酵母表達(dá)產(chǎn)物—乙肝表面抗原制備的重組漢遜酵母乙肝疫苗是新一代的乙肝疫苗，它在臨床實(shí)驗(yàn)中有優(yōu)秀的"三高”表現(xiàn)，，即抗體陽轉(zhuǎn)率高，抗體滴度高，母嬰阻斷率高。

當(dāng)前第39頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)乙型肝炎病毒感染的預(yù)防：

I，被動(dòng)免疫：

免疫球蛋白（ImmuneGlobulin)

免疫球蛋白是將HBsAg陰性供血者的血液經(jīng)低溫乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量不確定，所以預(yù)防乙型肝炎病毒感染的作用也是不明確的。使用免疫球蛋白的唯一理由是當(dāng)時(shí)無法獲得特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）當(dāng)前第40頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)乙型肝炎病毒感染的預(yù)防：

特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）特異性乙肝免疫球蛋白是將anti-HBs陽性供血者的血液經(jīng)低溫乙醇分段法而制成，其中anti—HBs的含量是確定的，所以對(duì)乙肝病毒暴露后的預(yù)防作用也是確定的。經(jīng)低溫乙醇分段法而制備的特異性乙肝免疫球蛋白是安全的，沒有證據(jù)表明它會(huì)傳播AIDS。當(dāng)前第41頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的使用

什么情況下使用特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）1，傷口和黏膜意外暴露于HBsAg—陽性血液。2,HBsAg—陽性母親所生的新生兒。注意：在注射特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）后，還應(yīng)同時(shí)注射乙肝疫苗。當(dāng)前第42頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)特異性乙肝免疫球蛋白（HBIG）的注射劑量和注射途徑；傷口，黏膜意外暴露，0,06ml/kg.最大劑量：5ml.HBsAg—陽性母親所生的新生兒。0,5ml。肌肉內(nèi)注射。

.當(dāng)前第43頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)乙肝疫苗的接種劑量:

分組RecombivaxHB（默克）EngerixB（史克）劑量(ml)劑量(ml)HBsAg(-)母親的嬰兒<11yrs的兒童2,5(ug)0,510,0(ug)0,5HBsAg(+)母親的嬰兒5,0(ug)0,510,0(ug)0,511`--19yrs青少年5,0(ug)0,520,0(ug)1,0>20yrs成年人10,0(ug)1,020,0(ug)1,0透析患者40,0(ug)1,040,0(ug)2,0當(dāng)前第44頁\共有52頁\編于星期六\21點(diǎn)母嬰阻斷1，HBIG+HBVaccine被證明是母嬰阻斷的有效措施。90%左右的嬰兒可被保護(hù)（母親，HBsAg+,HBeAg+)2，0,5ml的HBIG在出世12小時(shí)內(nèi)肌肉內(nèi)注射。3，嬰兒離開醫(yī)院前，HBVaccine肌肉內(nèi)注射。當(dāng)前第45頁\共有