生物技術的免疫原性和免疫毒性培訓課程課件

生物技術藥物生物技術藥物包括體內診斷、治療與預防用途；來源于細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞蛋白質、多肽及其衍生物、核酸如細胞因子、生長因子、融合蛋白、酶、激素、單抗、載體等特殊性結構、生產工藝、保存條件、同源性、作用靶點明確等固有的特點免疫毒性/免疫原性免疫毒性是指受試品引起免疫抑制或增強、過敏反應或自身免疫反應，可能與藥理活性相關（如抗排斥藥物）或不相關（如部分抗腫瘤藥物）。免疫原性指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質。研究意義意義重大：如免疫抑制，感染↑，腫瘤↑免疫增強，放大自身免疫反應或過敏反應。免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。但在規(guī)范及指導原則方面，缺乏共識，實驗方法也不統(tǒng)一免疫毒性研究內容一常規(guī)的免疫毒性指標包括：

白細胞總數及其分類計數球蛋白和白/球比值補體水平淋巴器官/組織的大體解剖胸腺和脾臟的器官重量免疫病理：胸腺、脾臟、引流淋巴組織免疫毒性研究內容二額外的免疫毒性試驗（additionalstudies），如

(1)常規(guī)免疫毒性檢測結果提示免疫毒性，感染↑

(2)受試品的結構，與已知免疫調節(jié)劑相似

(3)藥代動力學結果:原型藥或代謝產物在免疫組織蓄積

(4)適應癥:如用于抗HIV藥物

(5)藥理作用：常對免疫系統(tǒng)有影響常規(guī)的免疫毒性檢測結果

—引流淋巴組織檢查圖猴經口免疫HIV-BPV假病毒后回腸粘膜下集合淋巴小結ＡＢＡ：對照組，Ｂ：高劑量組常規(guī)的免疫毒性檢測

—免疫抑制/增強全血細胞變化、白細胞變化或淋巴細胞變化等。免疫器官重量改變或組織學檢查顯示相關器官或組織細胞密度變化血清免疫球蛋白變化用藥組感染發(fā)生率升高用藥組腫瘤發(fā)生率增多(除遺傳毒性、激素效應或肝酶誘導外)額外的免疫毒性試驗內容

免疫功能檢測如T細胞依賴的抗體反應、NK細胞活性、CTL活性、細胞因子表達、巨噬細胞/中性粒細胞功能、皮膚超敏反應、宿主抵抗力研究）免疫表型檢測依據免疫學理論和具體靶分子種類額外的免疫毒性試驗方案增設衛(wèi)星組、增加免疫學指標或改變給藥方案等。發(fā)育免疫毒性：在成年動物中發(fā)現免疫抑制作用后，需要評價發(fā)育免疫毒性作用，如觀察母代暴露于藥物后仔代的淋巴系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、細胞因子等，兩種以上功能檢測等。不僅是免疫抑制！常規(guī)階梯或分層或標準試驗組合不一定合理，需個體化額外的免疫毒性試驗方法

免疫功能檢測

Macrophage/Neutrophil熒光標記的膠珠觀察phagocytosis等NK反映天然免疫功能TDARSRBCor鑰孔血藍蛋白(KLH），用ELISA等CTL51Cr釋放法，ELISPOT法CytokinesELISA法及胞內細胞因子檢測額外的免疫毒性試驗方法免疫功能檢測hypersensitivity目前預測IV型變態(tài)反應

Buehler試驗、豚鼠最大化試驗（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗、小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)autoimmunity

PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）hostresistance抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%抗體中和活性的檢測

—CPE法數據呈非正態(tài)分布，取對數后達正態(tài)分布，需用幾何均數表示Ⅰ期臨床試驗方案的教訓：僅10min間隔引起這些變化的劑量與產生其他毒性的劑量關系抗體與藥代/藥效和安全關系的評價抗體滴度、抗體的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化、抗體的中和活性、。數據呈非正態(tài)分布，取對數后達正態(tài)分布，需用幾何均數表示—受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現嚴重不良反應（多器官衰竭）。額外的免疫毒性試驗方法CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件的教訓免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價?！幮詫φ昭逡话阈鑿?5只動物或50人中抽取ImmatureTcells一般從1：10開始稀釋或對樣品進行處理。生物技術藥物臨床前安全性評價研究進展。ImmatureTcells同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等免疫增強，放大自身免疫反應或過敏反應。中國新藥雜志,2007,16(3):181-188額外的免疫毒性試驗方法免疫表型檢測常用流式細胞儀檢測，檢測表達水平和比例

SurfacemarkersIg+PanBcellsThy1.2+orCD3+PanTcells、CD4+CD8-THelper/delayed-typehypersensitivitycellsCD8+CD4-TSuppressor-cytotoxiccellsCD8+CD4+ImmatureTcells免疫功能檢測

—分泌IFNγ細胞圖猴經口免疫HIV-BPV假病毒后外周血p24特異性的分泌IFN－γ的淋巴細胞數量免疫細胞表型檢測

—CD22陽性比例圖食蟹猴靜脈注射SM03嵌合抗體后CD22標記陽性細胞率的變化

CD22陽性細胞比例（%）免疫細胞表型檢測

—CD4/CD8比例CD4/CD8比例圖獼猴iv4周LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例免疫毒性試驗結果分析統(tǒng)計學意義與生物學意義（尤其單一指標）變化程度與劑量/暴露關系與擬用臨床劑量的關系療程關系涉及動物種屬數量和受影響的終點可能繼發(fā)于其他因素(e.g.,stress,）可能的細胞靶點和（或）作用機制引起這些變化的劑量與產生其他毒性的劑量關系可逆性免疫毒性靶器官的分析線索靶分子在免疫器官或組織的分布受試品或其代謝產物的分布相關指標的變化

—常規(guī)免疫指標、細胞因子變化等。免疫毒性機制推測受體或藥靶直接引起的毒性反應（on-target)—如干擾素引起骨髓抑制受體或藥靶介導的間接毒性反應

—如rhIL-12能誘導干擾素的分泌非特異機制

—如rhTNK-tPA引起肝細胞劑量依賴性的脂肪變性。免疫原性研究內容免疫原性(immunogenicity)

指誘導宿主產生免疫應答的能力，具有這種能力的物質稱為免疫原(immunogen）。產生特異性抗體或致敏淋巴細胞能力。影響因素

分子大小，10000，5000～10000，1000～5000

分子結構，蛋白質＞多糖＞核酸＞類脂宿主因素、免疫方式免疫原性研究意義免疫原性影響重復給藥毒性試驗結果的分析：中和藥物活性、改變藥物的清除、半衰期和組織分布（neutralizedrugactivityandalterdrugclearance,plasmahalf-life,andtissuedistribution）建立免疫分析方法，供臨床試驗應用免疫原性研究內容抗體檢測方法學驗證免疫反應檢測抗體滴度、抗體的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化、抗體的中和活性、?？贵w與藥代/藥效和安全關系的評價同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測方法ELISA-橋法包被藥物，用標記的藥物檢測。ELISA-直接法包被藥物，用標記抗體檢測。

（缺點：包被時可能會掩蓋或改變藥物的表位，僅檢測單一亞型，有種屬特異性，多次洗滌時丟失低親和力抗體，參考品與樣本之間試劑可能不同）額外的免疫毒性試驗內容免疫功能檢測

—分泌IFNγ細胞液相法，不需結合物（酶標記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各亞型抗體中國新藥雜志,2007,16(3):181-188生物技術藥物臨床前安全性評價研究進展。Safetyevaluationofrecombinantstaphylokinase.Buehler試驗、豚鼠最大化試驗（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗、小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)產生特異性抗體或致敏淋巴細胞能力。免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（ToxicolinVitr）。胸腺和脾臟的器官重量猴并非一定是相關動物，動物記憶T細胞少。圖猴皮下連續(xù)注射rhTPO2g.受體或藥靶直接引起的毒性反應（on-target)抗體中和活性的檢測

—CPE法—受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.—強調規(guī)范，分析與毒性反應等關系CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件目前預測IV型變態(tài)反應ImmatureTcells免疫增強，放大自身免疫反應或過敏反應?？贵w檢測方法間接法包被單抗或生物素，再加藥物。放射免疫沉淀法（RIP）液相法，中等或高通量水平表面等離子體共振液相法，不需結合物（酶標記抗體），能檢測到不同親和力的抗體和各亞型抗體電化學發(fā)光法液相法，可檢測各種抗體亞型抗體檢測方法考察方法學考察

—靈敏度：500-1000ng/ml，低滴度抗體檢出

—受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.15μg/ml，則難以檢測到抗受試物抗體。一般從1：10開始稀釋或對樣品進行處理。長效?

—精確度：利用陽性對照品重復測量

—陰性對照血清一般需從15只動物或50人中抽取免疫復合物在肝腎的沉積Ａ：溶劑對照組猴腎組織Ｂ：重組葡激酶大劑量組腎組織ＡＢ圖獼猴iv重組葡激酶４周后腎組織的免疫組織化學染色抗體檢測結果描述抗體滴度結果表示數據呈非正態(tài)分布，取對數后達正態(tài)分布，需用幾何均數表示抗體檢測結果抗體的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化抗體中和活性檢測常用依賴細胞株抗病毒致細胞病變（CPE）克隆細胞株靶基因檢測等。游離或與抗體結合的受試品對中和活檢測的干擾（偶聯(lián)抗體的瓊脂糖凝膠珠吸附）抗體中和活性的檢測

—CPE法圖猴經口免疫HIV-BPV假病毒后血清對HIV-1HN024的中和活性抗體中和活性檢測方法

—靶基因表達抗體產生對藥效相關指標的影響圖注射表達EPO基因裸質粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測抗體產生對藥代的影響臨床上連續(xù)應用重組水蛭素5ｄ以上可使74%的患者產生抗水蛭素抗體（AHAb）。抗體產生對藥代的影響0481317210.010.1110TPO(ng/mL）-)時間(天)圖猴皮下連續(xù)注射rhTPO2g.kg-1.d-120d后血清rhTPO濃度(實測值和抗體滴度(,血清稀釋倍數的倒數）抗體產生對毒性反應的影響圖食蟹猴sc2周和4周PEG-IFN后白細胞計數、抗體滴度和血清中和活性*****************中和抗體產生對給藥方案的意義中和抗體影響了大多數動物的藥理和（或）毒性反應，則可以考慮終止給藥。中和抗體水平，在體外能中和安全劑量達到的血藥濃度的作用時，可以考慮終止給藥。需結合藥動學資料?？偨Y生物技術藥物免疫毒性評價

—重視，個體化原則，采用新方法生物技術藥物免疫原性評價

—強調規(guī)范，分析與毒性反應等關系CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現嚴重不良反應（多器官衰竭）。熒光標記的膠珠觀察phagocytosis等圖獼猴iv4周LHRHA-PE38后外周血CD4/CD8比例包被藥物，用標記的藥物檢測。免疫毒性靶器官的分析線索(1)常規(guī)免疫毒性檢測結果提示免疫毒性，感染↑免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（ToxicolinVitr）。球蛋白和白/球比值51Cr釋放法，ELISPOT法依據免疫學理論和具體靶分子種類PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時）ImmatureTcellsautoimmunity數據呈非正態(tài)分布，取對數后達正態(tài)分布，需用幾何均數表示PanTcells、抗體與藥代/藥效和安全關系的評價臨床上連續(xù)應用重組水蛭素5ｄ以上可使74%的患者產生抗水蛭素抗體（AHAb）。德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現嚴重不良反應（多器官衰竭）。分子結構，蛋白質＞多糖＞核酸＞類脂Ａ：溶劑對照組猴腎組織CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件研究發(fā)現注射受試品后很快導致前炎癥因子釋放（細胞因子風暴），心肺功能衰竭。猴長毒：CD4+和CD8+T細胞一過性升高,血清IL-2、IL-5、IL-6中度升高，但沒有出現細胞因子釋放綜合征。CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件的教訓Ⅰ期臨床試驗方案的教訓：僅10min間隔免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（ToxicolinVitr）。猴并非一定是相關動物，動物記憶T細胞少。主要參考文獻EMEA.GuidelineonComparabilityofMedicinalProductsContainingBiotechnology-derivedProteinsasActiveSubstance:NonclinicalandClinicalIssuesICH.

preclinicalsafetyevaluationof

biotechnology-derivedpharmaceuticals

s6ICH.immunotoxicitystudiesforhumanpharmaceuticalss8FDA.ImmunotoxicologyEvaluationofInvestigationalNewDrugs呂秋軍等.生物技術藥物臨床前安全性評價研究進展。中國新藥雜志，2001，10（4）：252-256LuQiujun,etal.Safetyevaluationofrecombinantstaphylokinase.ToxicologicPathology,2003，31（1）：14-21呂秋軍.生物技術藥物免疫原性的評價及面臨的挑戰(zhàn).中國新藥雜志,2007,16(3):181-188謝謝！免疫毒性/免疫原性免疫毒性是指受試品引起免疫抑制或增強、過敏反應或自身免疫反應，可能與藥理活性相關（如抗排斥藥物）或不相關（如部分抗腫瘤藥物）。免疫原性指藥物刺激機體形成特異性抗體或致敏淋巴細胞的性質。研究意義意義重大：如免疫抑制，感染↑，腫瘤↑免疫增強，放大自身免疫反應或過敏反應。免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。但在規(guī)范及指導原則方面，缺乏共識，實驗方法也不統(tǒng)一額外的免疫毒性試驗方法免疫功能檢測hypersensitivity目前預測IV型變態(tài)反應

Buehler試驗、豚鼠最大化試驗（GPMT）、小鼠耳腫脹試驗、小鼠局部淋巴結試驗(LLNA)autoimmunity

PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）hostresistance抗感染或抗腫瘤發(fā)生（整體，必要時）注：GPMT與人一致性約70%，LLNA約72%免疫原性研究內容抗體檢測方法學驗證免疫反應檢測抗體滴度、抗體的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化、抗體的中和活性、?？贵w與藥代/藥效和安全關系的評價同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等抗體檢測結果描述抗體滴度結果表示數據呈非正態(tài)分布，取對數后達正態(tài)分布，需用幾何均數表示抗體檢測結果抗體的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化抗體中和活性的檢測

—CPE法圖猴經口免疫HIV-BPV假病毒后血清對HIV-1HN024的中和活性—常規(guī)免疫指標、細胞因子變化等?！鐁hTNK-tPA引起肝細胞劑量依賴性的脂肪變性。(1)常規(guī)免疫毒性檢測結果提示免疫毒性，感染↑hostresistance15μg/ml，則難以檢測到抗受試物抗體?？贵w的出現時間、出現抗體的動物數、劑量關系、抗體滴度的動態(tài)變化ImmatureTcells—受試物干擾：如有文獻報道，如血清中受試物濃度大于0.圖食蟹猴sc2周和4周PEG-IFN后白細胞計數、抗體滴度和血清中和活性—精確度：利用陽性對照品重復測量受體或藥靶直接引起的毒性反應（on-target)—如rhTNK-tPA引起肝細胞劑量依賴性的脂肪變性。涉及動物種屬數量和受影響的終點ImmatureTcells免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等—強調規(guī)范，分析與毒性反應等關系Ｂ：重組葡激酶大劑量組腎組織PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現嚴重不良反應（多器官衰竭）。中和抗體產生對給藥方案的意義來源于細菌、酵母、昆蟲、植物和哺乳動物細胞抗體產生對藥效相關指標的影響圖注射表達EPO基因裸質粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測生物技術藥物免疫毒性評價猴并非一定是相關動物，動物記憶T細胞少。常規(guī)的免疫毒性檢測

—免疫抑制/增強德國公司研制的抗CD28超級激動劑TGN1412（人源化單抗）用于治療白血病等，在1期臨床試驗中，單次靜脈注射12-16h，6例均出現嚴重不良反應（多器官衰竭）。(5)藥理作用：常對免疫系統(tǒng)有影響免疫器官重量改變或組織學檢查顯示相關器官或組織細胞密度變化液相法，中等或高通量水平額外的免疫毒性試驗內容常規(guī)的免疫毒性檢測

—免疫抑制/增強是指受試品引起免疫抑制或增強、過敏反應或自身免疫反應，可能與藥理活性相關（如抗排斥藥物）或不相關（如部分抗腫瘤藥物）。GuidelineonComparabilityofMedicinalProductsContainingBiotechnology-derivedProteinsasActiveSubstance:NonclinicalandClinicalIssues15μg/ml，則難以檢測到抗受試物抗體?？贵w與藥代/藥效和安全關系的評價圖注射表達EPO基因裸質粒8周后貧血大鼠HCT、EPO水平及中和活性的檢測CD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件生物技術藥物免疫原性的評價及面臨的挑戰(zhàn).免疫毒性的種屬差異及免疫毒性評價和分析的重要性（ToxicolinVitr）。51Cr釋放法，ELISPOT法ImmatureTcells淋巴器官/組織的大體解剖PLNA（報告抗原TNP-Ficoll、TNP-Ovalbumin）免疫原性，是藥物本身具有的性質，有免疫原性不一定導致毒性，但可以影響對藥物毒性、毒代或藥效的客觀評價。分子大小，10000，5000～10000，1000～5000ImmatureTcellsCD28激動劑TGN1412的Ⅰ期臨床試驗事件目前預測IV型變態(tài)反應同期的藥效/藥代（毒代）/毒性反應的變化、補體激活與否、免疫復合物在肝腎的沉積、是否需要終止給藥、臨床意義分析等—重視，個體化原則，采用新方法常規(guī)階梯或分層或標準試驗組合不一定合理，需