規(guī)?；鰵馊苣z中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光定量RT-PCR PCR檢測技術(shù)規(guī)程

規(guī)?；鰵馊苣z中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛傳染性鼻氣管炎病毒實時熒光定量RT-PCR/PCR檢測技術(shù)規(guī)程范圍本文件規(guī)定了規(guī)模化牛場氣溶膠中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒熒光定量RT-PCR/PCR檢測技術(shù)。本文件適用于畜舍環(huán)境及疫區(qū)環(huán)境氣溶膠中口蹄疫病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T27401實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義?？s略語下列縮略語適用于本文件。FMD：口蹄疫FMDV：口蹄疫病毒BVDV：牛病毒性腹瀉病毒IBRV：牛傳染性鼻氣管炎病毒PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)DNA：脫氧核糖核酸RNA：核糖核酸cDNA：與信使RNA鏈呈互補的堿基序列的單鏈DNAAGI：全玻璃液體沖擊式采樣器PBS：磷酸鹽緩沖生理鹽水試劑或材料除非另有說明，在檢測中使用的試劑均為分析純，水應(yīng)符合GB/T6682要求。所用液體試劑均需使用無DNA/RNAase的容器進行分裝。體積比25:24的酚：氯仿溶液，應(yīng)2?℃～8?℃保存見A.1。體積比24:1的氯仿：異戊醇溶液，應(yīng)2?℃～8?℃保存見A.2。0.1?%DEPC水。無水乙醇，應(yīng)-20?℃預(yù)冷。75?%乙醇，配置見A.5，應(yīng)-20?℃預(yù)冷。TE緩沖液，配制見A.6。2?mol/LNaAc溶液，配制見A.7。陽性、陰性對照。陽性對照：分別為帶有FMDV5′-UTR基因、BVDV5′-UTR基因和IBRVgD基因的質(zhì)粒，制備見附錄B。陰性對照：分別為已知FMDV、BVDV陰性氣溶膠樣本的cDNA和IBRV陰性氣溶膠樣本DNA。儀器設(shè)備空氣微生物采樣箱。熒光PCR檢測儀及配套反應(yīng)管（板）。高速冷凍離心機，最高轉(zhuǎn)速應(yīng)不低于13?000?r/min。冰箱，2?℃～8?℃和-20?℃兩種。微量移液器及配套吸頭，量程規(guī)格應(yīng)包含5?L、10?L、100?L和1?000?L。1.5?mL離心管，應(yīng)無DNAase和RNAase。電熱恒溫水槽（室溫至100?℃）。渦旋振蕩器。天平（精密度千分之一以上）。Ⅱ級生物安全柜A型。氣溶膠樣品氣溶膠樣品的采集、滅活處理應(yīng)用空氣微生物采樣箱，使用國際標(biāo)準(zhǔn)的AGI采集樣本。樣品采集后立即用1?%甲醛溶液滅活處理。采集方法與注意事項應(yīng)按照附錄C。樣品貯運樣品采集后，放入密閉的自封袋內(nèi)（一個采樣點的樣品，放一個自封袋），于保溫箱中加冰、密封，24?h內(nèi)送實驗室。樣品保存樣品在2?℃～8?℃條件下保存不應(yīng)超過24?h，若長期保存應(yīng)置-70?℃以下，應(yīng)避免反復(fù)凍融（凍融不超過三次）。實驗步驟實驗室規(guī)范熒光RT-PCR檢測方法的實驗室規(guī)范應(yīng)符合GB19489和GB/T27401要求，整個實驗過程中均須使用無DNAase/RNAase的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前須250?℃干烤4?h以上，以徹底去除DNAase/RNAase。樣品病毒核酸RNA和DNA提取所提取物為氣溶膠采集液，可能含有病毒。操作者必須帶口罩和一次性手套，RNA提取盡量在人少時進行，防止空氣中RNAase的污染。所用物品也應(yīng)無RNAase。樣品病毒核酸RNA提取在1.5?mL的離心管中加入樣品上清液200?μL，再加入TRIzol1?mL，充分混勻，室溫放置10?min。加入200?μL的氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象），室溫放置10?min。4?℃離心、13?000?r/min、15?min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。加入等體積異丙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10?min。離心4?℃、13?000?r/min、15?min，用槍小心吸去所有上清。加1?mL75?%乙醇洗一遍，離心4?℃、8?000?r/min、10?min，用槍小心吸去所有上清，重復(fù)此步驟，在超凈XX干燥5?min。加入50?μLTE緩沖液溶解RNA，-20?℃保存?zhèn)溆?。可采用?jīng)驗證的病毒RNA提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取RNA。樣品病毒核酸DNA提取在1.5?mL的離心管中加入樣品上清液200?μL，加入450?μL裂解緩沖液，再加入20?μL蛋白酶K，充分混勻，55?℃15?min。加入700?μL的酚：氯仿，蓋緊離心管蓋，用力震蕩離心管（溶液充分乳化，成乳白狀，無分相現(xiàn)象），室溫放置10?min。13?000?r/min、15?min，取上層液相移入另一管（切忌吸動白色中間相）。加入等體積氯仿：異戊醇（24:1），輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10?min。13?000?r/min、15?min，取上清液相移入另一管。加入1/10體積2?mol/LNaAc和等體積預(yù)冷的無水乙醇，輕輕顛倒離心管充分混勻液體，室溫放置10?min。13?000?r/min、5?min，用槍小心吸去上清，加1?mL75?%乙醇洗一遍，8?000?r/min、10?min，用槍小心吸去所有上清，重復(fù)此步驟，在超凈XX干燥5?min。加入50?μLTE緩沖液溶解DNA，-20?℃保存?zhèn)溆?。可采用?jīng)驗證的病毒核酸提取試劑盒，按照試劑盒使用說明書提取DNA。實時熒光定量RT-PCR/PCR擴增擴增試劑準(zhǔn)備在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行。設(shè)所需PCR管數(shù)為n（n=樣本數(shù)+1管陰性對照+2管陽性對照），每個測試反應(yīng)體系需要20?μL熒光RT-PCR反應(yīng)液。根據(jù)所檢測的病毒選擇引物，見表D.1。按D.2配制反應(yīng)液，為避免移液器取樣損失，建議按n+1個反應(yīng)配制，計算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積小管中，充分混合均勻后，向每個PCR管中各分裝20?μL，轉(zhuǎn)移至樣品處理區(qū)。加樣在樣品處理區(qū)進行。分別向上述PCR管中加入樣本核酸提取步驟中制備的RNA溶液5?μL和中制備的DNA溶液2?μL，蓋緊管蓋，500?r/min離心30?sec，轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)在檢測區(qū)進行，選擇檢測模式：SYBRGreenI。將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，反轉(zhuǎn)錄42?℃/15?min；第二階段，預(yù)變性95?℃/30?sec；第三階段，94?℃/15?sec，61?℃/30?sec，40個循環(huán)。最后40?℃2?min。熒光收集在第三階段每次循環(huán)的61?℃延伸時進行。可根據(jù)不同品牌PCR儀器說明書等效設(shè)置參數(shù)。實時熒光定量PCR反應(yīng)在檢測區(qū)進行，選擇檢測模式：SYBRGreenI。將加樣后的PCR管放入熒光PCR檢測儀內(nèi)，作好標(biāo)記。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，預(yù)變性94?℃/3?min；第二階段，94?℃/15?sec，61?℃/30?sec，40個循環(huán)。最后40?℃2?min。熒光收集在第二階段每次循環(huán)的61?℃延伸時進行?？筛鶕?jù)不同品牌PCR儀器說明書等效設(shè)置參數(shù)。結(jié)果判定結(jié)果分析條件的設(shè)定閾值設(shè)定原則：根據(jù)儀器噪聲情況進行調(diào)整，以閾值線剛好超過陰性對照樣品擴增曲線的最高點為準(zhǔn)。質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)陰性對照無Ct值并且無擴增曲線。陽性對照的Ct值應(yīng)小于等于28，并出現(xiàn)典型的擴增曲線。如陰性和陽性對照不滿足以上條件，此次實驗視為無效。結(jié)果判定陰性檢測通道均無Ct值，且無特征性擴增曲線，表明樣品中無FMDV、BVDV、IBRV核酸。陽性若檢測通道出現(xiàn)特征性擴增曲線，且Ct值≤30.0，表示相應(yīng)管內(nèi)樣本中分別存在FMDV、BVDV、IBRV核酸?？梢扇魴z測通道Ct值在30.0～38.0區(qū)間，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品，建議復(fù)驗。復(fù)驗仍出現(xiàn)上述結(jié)果的，判為陽性，否則判為陰性。

（資料性）

溶液配制體積比25：24的酚：氯仿溶液取Tris-飽和酚有機相（下層溶液）50?mL和氯仿48?mL混勻，2?℃～8?℃保存。體積比24:1的氯仿：異戊醇溶液取氯仿48?mL和異戊醇2?mL混勻，2?℃～8?℃保存。0.5?mol/LTris-HCl（pH8.0）溶液稱取6.055?gTris置于100?mL燒杯中，加入80?mL0.1?%DEPC水，用濃HCl調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至100?mL，高壓滅菌后室溫保存待用。0.5?mol/LEDTA（pH8.0）溶液稱取18.61?gNa2EDTA·2H2O置于100?mL燒杯中，加入80?mL0.1?%DEPC水，用10?%的NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至8.0，定容至100?mL，高壓滅菌后室溫保存待用。75?%乙醇量取75?mL無水乙醇，加入25?mL0.1?%DEPC水。TE緩沖液將0.5?mL的10?mmol/LTris-HCl（pH8.0）、0.1?mL的0.5?mol/LEDTA（pH8.0）加入到容量瓶中，調(diào)pH8.0，加0.1?%DEPC水定容至50?mL，高壓滅菌后，降至室溫，4?℃保存。2?mol/LNaAc（PH5.2）溶液稱量16.4?g無水NaAc置于100?mL燒杯中，加入約40?mL的去離子水?dāng)嚢枞芙?；加入冰醋酸調(diào)節(jié)PH至5.2，加去離子水將溶液定容至100?mL。

（資料性）

陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備引物引物序列表見表B.1。引物序列表病毒名稱序列名稱序列（5’-3’）口蹄疫病毒上游引物CGTTGCACTCCACACTTAC下游引物GACCAAGTAGGCGGAAAG牛病毒性腹瀉病毒上游引物ATGACACAGGAAAACATTCCGG下游引物CTTCGGTTTGACATCATACACAC牛傳染性鼻氣管炎病毒上游引物GGGCGACTAGAGATACACTCGCC下游引物GTTTCGAGAACCAGCAGTCCPCR反應(yīng)液配方PCR反應(yīng)液配方見表B.2。PCR反應(yīng)液配方組分口蹄疫病毒牛病毒性腹瀉病毒牛傳染性鼻氣管炎病毒1個反應(yīng)體系的加入量10×LABuffer（Mg2+Plus）5.0?μL5.0?μL2×GCBuffer（Mg2+Plus）25.0?μL2.5?mMdNTPs8.0?μL8.0?μL8.0?μL5?U/μLLATaq0.5?μL0.5?μL0.5?μL口蹄疫病毒上游引物（10?μmol/L）0.5?μL口蹄疫病毒下游引物（10?μmol/L）0.5?μL牛病毒性腹瀉病毒上游引物（10?μmol/L）0.5?μL牛病毒性腹瀉病毒下游引物（10?μmol/L）0.5?μL牛傳染性鼻氣管炎病毒上游引物（10?μmol/L）0.5?μL牛傳染性鼻氣管炎病毒下游引物（10?μmol/L）0.5?μL滅菌超純水33.5?μL33.5?μL13.5?μL口蹄疫病毒cDNA2.0?μL牛病毒性腹瀉病毒cDNA2.0?μL牛傳染性鼻氣管炎病毒DNA2.0?μL合計50?μL50?μL50?μL口蹄疫病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備取已加入TRIzol的口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)物200?μL，參照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)液見表B.2。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置：第一階段，95?℃/5?min；第二階段，94?℃/15?sec，58?℃/30?sec，72?℃/30?sec，33個循環(huán)；第三階段，72?℃/5?min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%X脂糖凝膠電泳，回收目的片斷后克隆至pEAST-T3載體，藍(lán)白斑篩選重組質(zhì)粒，進行DNA測序，將測序結(jié)果在s:///Blast.cgi網(wǎng)站進行BLAST比對，正確的重組質(zhì)粒命名為pEAST-T3-FMDV，作為檢測口蹄疫病毒的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。牛病毒性腹瀉病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備取牛病毒性腹瀉病毒細(xì)胞培養(yǎng)物200?μL，參照7.2.1提取病毒RNA，RNA按照FermentasRevertAidTMFirstStrandcDNASynthesisKit說明書進行反轉(zhuǎn)錄cDNA。以cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)液見B.2。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置同B.3。PCR產(chǎn)物凝膠電泳、回收、pEAST-T3載體克隆、重組質(zhì)粒篩選、DNA測序及測序結(jié)果BLAST比對同B.3，正確的重組質(zhì)粒命名為pEAST-T3-BVDV，作為檢測牛病毒性腹瀉病毒的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。牛傳染性鼻氣管炎病毒陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備取牛傳染性鼻氣管炎病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物200?μL，參照7.2.2提取病毒DNA。以牛傳染性鼻氣管炎病毒的DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應(yīng)液見B.2。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置同B.3。PCR產(chǎn)物凝膠電泳、回收、pEAST-T3載體克隆、重組質(zhì)粒篩選、DNA測序及測序結(jié)果BLAST比對同B.3，正確的重組質(zhì)粒為陽性，將其命名為pEAST-T3-IBRV，作為檢測牛傳染性鼻氣管炎病毒的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

（規(guī)范性）

牛場環(huán)境氣溶膠樣本的采集方法和注意事項采樣環(huán)境環(huán)境溫度≥5?℃。試劑0.9?%滅菌生理鹽水和橄欖油。儀器與耗材空氣微生物采樣箱，Porton空氣微生物采樣器，三角支架，滅菌注射器（10?mL），一次性口罩，一次性手套，一次性無菌隔離服。采樣人員要求現(xiàn)場采樣的工作人員要穿工作服和膠鞋、戴上口罩、防風(fēng)眼鏡和一次性乳膠手套，做好個人安全防護。采樣工具采集氣溶膠用的氣溶膠采樣器、生理鹽水分別包裝并提前121?℃高壓滅菌消毒，并準(zhǔn)備好充足的無菌離心管、消毒的密封袋、一次性注射器、膠布、保溫箱、記號筆等物品。使用前要仔細(xì)檢查離心管、密封袋，若有破損者不得使用。氣溶膠樣品采樣設(shè)備安裝：首先安裝三腳架，空氣微生物采樣器放置高度為距地面1.5?m，將30?mL滅菌生理鹽水注入，同時滴加一滴橄欖油，放入三腳固定支架內(nèi)固定。橡膠連接管的一端接到空氣微生物采樣箱主機入氣口上，另一端連接到Porton空氣微生物采樣器的出氣口上。收集參數(shù)：采用液體沖擊式采樣方式，采樣流量為12.5?L/min，采樣時間為30?min。收集標(biāo)準(zhǔn)：每個牧場一般在產(chǎn)房、動物房、運動場和奶廳4個位置分別采集2份樣本。樣品的滅活處理與分裝：氣溶膠采樣器采集結(jié)束后，直接將30?mL樣本收集到50?mL離心管內(nèi)，采樣器立即用70?%乙醇溶液滅活處理，放入密封袋封口。氣溶膠采集液立即用1?%甲醛溶液滅活處理，蓋好離心管蓋，膠布封口，然后裝入密封袋封口，在離心管壁和密封袋上記錄采樣牛場、位置、采樣時間、采樣人。將裝有氣溶膠樣本的離心管豎直口朝上和冰袋一塊放入保溫箱，蓋好蓋子，膠帶封口。派車專程送往有條件的實驗室進行熒光定量PCR檢測，采集的兩份樣品，一份用于直接檢測，另一份-20?℃保存用于復(fù)檢。樣品運送：在樣品運送過程中，裝樣品的保溫箱不得傾倒，以防液體外溢。到達(dá)目的地后，對車體應(yīng)全面消毒。采樣現(xiàn)場用具處理氣溶膠現(xiàn)場采集完畢后，立即對空氣微生物采樣箱、三角支架用70?%乙醇溶液消毒。

（資料性）