單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基本概念瑞客

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組基本概念易生信，畢生緣；培訓(xùn)。易生信(

)——最懂你的生信培訓(xùn)，學(xué)習(xí)生信更容易易生信，畢生緣；培訓(xùn)。易生信2單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組與群體轉(zhuǎn)錄組什么不同？單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的操作流程3易生信單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展4易生信易生信單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的關(guān)鍵步驟單細(xì)胞分離和捕獲

轉(zhuǎn)錄本的捕獲和擴(kuò)增RNA測(cè)序需要0.1-1.0ugtotal

RNA單細(xì)胞里面有1-50

pgRNA，捕獲效率10%DNA測(cè)序需要1

ng

DNA易生信，畢生緣；培訓(xùn)。6單細(xì)胞分離和捕獲易生信

易生信，畢生緣；培訓(xùn)

。

7易生信單細(xì)胞分離和捕獲–微孔易生信，畢生緣；培訓(xùn)。8微孔：先用移液管或者激光切割或FACS的方式分離細(xì)胞并放到微孔中。適合有目的細(xì)胞集或細(xì)胞量很少的情況。易生信單細(xì)胞分離和捕獲–微流微流型平臺(tái)，比如Fluidigm’s C1，提供了一個(gè)更加整合的系統(tǒng)，同時(shí)可以捕獲細(xì)胞和完成文庫構(gòu)建的準(zhǔn)備過程。比微孔型平臺(tái)通量更高只能捕獲10%的細(xì)胞，不適合處理稀有細(xì)胞或細(xì)胞量量很少的情況。易生信，畢生緣；培訓(xùn)。9(17)30049-7易生信單細(xì)胞分離和捕獲–液滴易生信，畢生緣；培訓(xùn)

。

10液滴型方法是將單獨(dú)的細(xì)胞和一個(gè)包含建庫所需酶的珠粒(bead)包裹在一個(gè)納米級(jí)液滴里面。特殊地，每個(gè)珠粒(bead)包含一段獨(dú)特的條形碼序列(barcode)，會(huì)加到所有來自于液滴里面這個(gè)細(xì)胞的序列上，用于區(qū)分不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本。(17)30049-7易生信，畢生緣；培訓(xùn)。易生信11單細(xì)胞分離和捕獲–液滴易生信單細(xì)胞分離和捕獲–Microwell細(xì)胞懸液加到凝膠微孔模具上，利用重力使細(xì)胞落入微孔，通常一個(gè)微孔只能容納一個(gè)細(xì)胞，一塊板子可以同時(shí)捕獲約10000個(gè)單細(xì)胞。每一步操作都可視、可控制，doublets可以通過鏡檢洗除。隨后每個(gè)孔加入包含107-8特定探針集的與孔徑大小匹配的磁珠，標(biāo)記每個(gè)細(xì)胞中的mRNA。易生信，畢生緣；培訓(xùn)。12易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。13單細(xì)胞分離和捕獲–Magnetic

beadCellnumber/ExperimentExperimentscaleupGenenumberLibrarycost($)Equipmentcost($)Microwell-seq5000-10000Twolargearrays(4Xareas)atthesametime500-50000.02Template:0.1KDrop-seq5000-10000Installmultiplepumpsystems500-50000.1Pumps:5KMARS-seq384-1536Difficult500-50001.3Around400K10XGenomics5000-10000Run8channelsinoneexperiment1000-60000.5Around100KC1-HT600-800Difficult3000-70005Around400K易生信，畢生緣；培訓(xùn)。14易生信不同單細(xì)胞捕獲方法的成本比較易生信156個(gè)常用scRNA-seq實(shí)驗(yàn)方法易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。16單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用到的3種序列–cell

barcodeCell

barcode: 10-41 bp，來源于一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄本理論上都有相同的call

barcode。不同的barcode代表來源于不同的細(xì)胞。易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。17單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用到的3種序列-UMIUMI(unique

molecular

identifier):

反轉(zhuǎn)錄過程中添加到轉(zhuǎn)錄本上的4-10bp的隨機(jī)條形碼序列，使得測(cè)序reads可以對(duì)應(yīng)到單個(gè)轉(zhuǎn)錄本，去除擴(kuò)增噪聲和偏好性。ERCC

spike-in:易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。18單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用到的3種序列-UMI因?yàn)閁MI的序列種類遠(yuǎn)少于細(xì)胞中RNA分子數(shù)，每個(gè)UMI條形碼可能會(huì)連接到多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，需要借助條形碼序列和reads比對(duì)位置兩個(gè)條件鑒定起始的轉(zhuǎn)錄本分子。易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。19單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組用到的3種序列–spike-inERCC

spike-in:

External

RNA

Control

Consortium，92 poly-A

transcript,

length 250-2000

nt,

GCcontent

5-51%.可以與細(xì)胞RNA混合，一起測(cè)序，作為陰性對(duì)照，評(píng)估技術(shù)噪音。但使用時(shí)需謹(jǐn)慎，其特性與內(nèi)源

RNA畢竟不同，直接用于標(biāo)準(zhǔn)化需要多加注意。真實(shí)轉(zhuǎn)錄本拷貝數(shù)鑒定易生信20易生信，畢生緣；培訓(xùn)。易生信21檢測(cè)到的基因數(shù)和準(zhǔn)確性的比較10.1016/j.molcel.2017.01.023

測(cè)序飽和度比較22易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)

。

10.1016/j.molcel.2017.01.023

更多方法的準(zhǔn)確性和敏感性比較23易生信易生信24易生信，畢生緣；培訓(xùn)。液滴型單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的比較易生信25易生信，畢生緣；培訓(xùn)。液滴型單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的比較易生信26易生信，畢生緣；培訓(xùn)。捕獲效率：10X可用細(xì)胞比例最高，近50%易生信27易生信，畢生緣；培訓(xùn)。圖示Cell

barcode

和UMI的使用易生信可捕獲的細(xì)胞的數(shù)目理論值：萬-百萬級(jí)易生信，畢生緣；培訓(xùn)。The

effective

barcode

size

is

5x104

for

inDropandat

least

1x106for

Drop-seq

and

3x105

for10X.10X有最少的cell

barcode錯(cuò)配。鑒定含有細(xì)胞的液滴–文庫大小拐點(diǎn)法29scRNA-seq方法中只有一小部分的液滴包含珠狀物和一個(gè)完整細(xì)胞。然而生物實(shí)驗(yàn)不會(huì)那么理想，有些RNA會(huì)從死細(xì)胞或破損細(xì)胞中漏出來。所以沒有完易生信鑒定含有細(xì)胞的液滴–文庫大小拐點(diǎn)法30易生信易生信10X和inDrop拐點(diǎn)更明顯易生信，畢生緣；培訓(xùn)。大多數(shù)方法使用每個(gè)barcode對(duì)應(yīng)的總分子數(shù)(如果是UMI)或總reads數(shù)的分布來尋找一個(gè)“break

point”區(qū)分來自于真實(shí)細(xì)胞的較大的文庫和來自于背景的較小的文庫。易生信34易生信，畢生緣；培訓(xùn)。10X檢測(cè)到的基因數(shù)目相對(duì)多易生信35易生信，畢生緣；培訓(xùn)。10X有最高的有效reads比例易生信36易生信，畢生緣；培訓(xùn)。10X有最高的檢測(cè)敏感性和穩(wěn)定性易生信37易生信，畢生緣；培訓(xùn)。10X具有最低的技術(shù)噪音測(cè)序飽和度評(píng)估易生信，畢生緣；培訓(xùn)。38易生信所有3個(gè)方法都可以在少于10

K

reads時(shí)檢測(cè)超過1000

UMI。10X在20

K reads時(shí)可以檢測(cè)1萬UMI，而Drop-seq需要50

K

reads，InDrop卻只能檢測(cè)3k

UMI。10X需要200

K reads接近飽和，Drop-seq需要80

K

reads，inDrop需要60

K

reads?；驍?shù)目比轉(zhuǎn)錄本數(shù)目（uMI數(shù)）更容易達(dá)到飽和。20

K有效reads，準(zhǔn)確性達(dá)到飽和。易生信易生信，畢生緣；培訓(xùn)。39Drop-基于的技術(shù)評(píng)估結(jié)果總結(jié)商業(yè)系統(tǒng)10X穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、敏感性最好，技術(shù)噪音最小，但費(fèi)用也最高。($50,000+$0.5/cell)Drop-seq敏感性和準(zhǔn)確性弱一些，但價(jià)格也便宜些，適用于大量細(xì)胞。($30,000+$0.1/cell)inDrop完全開源版本的10X，但試劑和步驟還有優(yōu)化的潛力，適用于非標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)開發(fā)。($50,000

+$0.25/cell)10

X

Genomics

技術(shù)易生信，畢生緣；培訓(xùn)。10X

單細(xì)胞操作流程41易生信10X流程42易生信，畢生緣；培訓(xùn)。易生信10X

beads

and

oligos43易生信10X

微流控芯片8通道適用于大量細(xì)胞44易生信10

X

GEM內(nèi)序列捕獲、反轉(zhuǎn)、模板轉(zhuǎn)換45易生信裂解GEMs釋放標(biāo)記好的cDNA46易生信所有細(xì)胞cDNA一起PCR擴(kuò)增47易生信10X測(cè)序獲得的reads，barcode+轉(zhuǎn)錄本48易生信10X測(cè)序深度：每個(gè)細(xì)胞至少2萬條reads49易生信Cellranger分析流程50易生信同一個(gè)樣品，同一個(gè)文庫適用count52易生信多個(gè)文庫適用count+aggr53易生信易生信10X樣品準(zhǔn)備注意事項(xiàng)完全解離的單細(xì)胞懸液，最小化細(xì)胞聚集、非細(xì)胞核酸和反轉(zhuǎn)抑制因子細(xì)胞懸液包含多于90%的有活力細(xì)胞，避免細(xì)胞受損或死亡產(chǎn)生過多游離RNA操作溫柔加載細(xì)胞濃度在700-1200

cells/ul，總量在500-10,000細(xì)胞。易生信，畢生緣；培訓(xùn)。55評(píng)估需要測(cè)序的細(xì)胞數(shù)56易生信scRNA-seq測(cè)序分析流程總覽58易生信易生信單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的局限性微操作分離細(xì)胞依賴于特殊設(shè)備或勞力需求多；酶處理細(xì)胞形成懸液影響細(xì)胞活力和轉(zhuǎn)錄狀態(tài)細(xì)胞原始的空間信息和所處的環(huán)節(jié)丟失每個(gè)細(xì)胞只能捕獲大約10%的轉(zhuǎn)錄本，難以檢測(cè)低豐度轉(zhuǎn)錄本只能檢測(cè)poly-A的RNA59易生信，畢