三氧化二砷對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究

三氧化二砷對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制研究【摘要】本研究探討三氧化二砷在體外對(duì)骨髓瘤細(xì)胞系U266的生物學(xué)效應(yīng)及其機(jī)制。用MTT法觀察As2O3對(duì)U266細(xì)胞增殖的影響，用流式細(xì)胞術(shù)、DNA凝膠電泳法分析As2O3對(duì)U266細(xì)胞凋亡的影響，以RTPCR法檢測(cè)2μmol/LAs2O3不同處理時(shí)間對(duì)U266細(xì)胞人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶蛋白催化亞單位mRNA的表達(dá)變化，用Westernblot法檢測(cè)As2O3不同處理時(shí)間對(duì)U266細(xì)胞procaspase3、bcl2及hTERT蛋白水平的表達(dá)變化。結(jié)果表明：As2O3能明顯抑制U266細(xì)胞增殖，半數(shù)抑制濃度為2μmol/L；As2O3能誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間依賴性；2μmol/LAs2O3不同時(shí)間處理U266細(xì)胞后procaspase3蛋白及hTERTmRNA、蛋白表達(dá)呈時(shí)間依賴性降低,而bcl2蛋白表達(dá)未發(fā)生變化。結(jié)論：As2O3通過(guò)改變線粒體跨膜電位，觸發(fā)了U266細(xì)胞的線粒體凋亡途徑，導(dǎo)致了caspase3的活化，最終誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡；hTERT表達(dá)下調(diào)也是As2O3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的重要作用機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】骨髓瘤

MechanismsUnderlyingtheEffectofArsenicTrioxideonProliferationInhibitionandApoptosisInductioninMyelomaCellLineU266

AbstractTheaimofthisstudywastoexplorethemechanismsunderlyingeffectofarsenictrioxide(As2O3)onmyelomacelllineU266invitro.TheviabilityandapoptosisofU266cellswereobservedbyMTTassay,flowcytometryandDNAagarosegelelectrophoresis.TheexpressionofhTERTmRNAwasassessedbyRTPCRanalysis.Thevariationofprocaspase3,bcl2andhTERTproteinexpressionweredetectedbyWesternblot.TheresultsindicatedthattheAs2O3couldinhibitthegrowthofU266cellssignificantlyandtheconcentrationof50%growthinhibition(IC50)was2μmol/L.Aftertreatmentwithμmol/LAs2O3at24,48and72hours,adoseandtimedependentapoptosisofU266cellscouldbeobserved.AftertreatingU266cellswith2μmol/LAs2O3atdifferenttimepoints,atimedependentreductionofprocaspase3,hTERTmRNAandproteinwasfoundwithoutanychangeofbcl2expression.ItisconcludedthattheAs2O3canchangethemitochondrialtransmembranepotential,initiatingthemitochondialapoptosispathway,leadinginturntocaspase3activation,andinducingtheapoptosisofU266cells.ThesefindingssuggestthatthereductionofhTERTplaysacriticalroleintheapoptosisofU266cellsinducedbyAs2O3.

Keywordsarsenictrioxid;myeloma;U266cell;cellsapoptosis;caspase3;hTERT

多發(fā)性骨髓瘤是一種以骨髓中單克隆漿細(xì)胞惡性增殖并分泌大量單克隆免疫球蛋白為特征的漿細(xì)胞腫瘤，多引起廣泛骨質(zhì)破壞、反復(fù)感染、貧血、高鈣血癥、高粘滯血癥、腎功能不全等一系列臨床表現(xiàn)。目前，MM仍無(wú)法治愈。近幾年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道，三氧化二砷在復(fù)發(fā)和難治性MM的治療中取得了可喜的療效。相關(guān)基礎(chǔ)研究也發(fā)現(xiàn)，As2O3在體外通過(guò)使細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子P15、P16和P21重新表達(dá)或表達(dá)增強(qiáng)，下調(diào)癌基因cmyc的表達(dá)以及影響?zhàn)じ椒肿颖磉_(dá)等多種機(jī)制影響骨髓瘤細(xì)胞增殖周期，促進(jìn)其凋亡并影響其歸巢。但是，As2O3對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用機(jī)制尚未完全清楚［1-6］。因此，我們以骨髓瘤細(xì)胞株U266為體外模型，探討As2O3對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用及相關(guān)機(jī)制。

材料和方法

材料和試劑

As2O3為黑龍江伊達(dá)藥業(yè)公司產(chǎn)品，用注射用水稀釋至1×103μmol/L的儲(chǔ)存液，使用時(shí)用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋至工作濃度。MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit購(gòu)自美國(guó)Biovision公司。實(shí)驗(yàn)中使用的單克隆抗體及二抗均購(gòu)自SantaCruzBiotechnology公司。

骨髓瘤細(xì)胞株U266由上海第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院血液科侯健教授惠贈(zèng)。U266細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5％CO2、飽和濕度的孵箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

As2O3對(duì)U266細(xì)胞生長(zhǎng)影響的MTT法檢測(cè)

將不同濃度As2O3處理48小時(shí)及一定濃度的As2O3處理不同時(shí)間后的樣本置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)波長(zhǎng)492nm的吸光度，每組設(shè)6個(gè)平行孔，以對(duì)照組細(xì)胞增殖率為100％，按下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖率。

細(xì)胞增殖率＝×100%

細(xì)胞凋亡的DNA凝膠電泳檢測(cè)

調(diào)整U266細(xì)胞濃度至2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L，作用0、24、48、72小時(shí)后，將5×105細(xì)胞移入無(wú)菌的mlEppendorf管中，4℃2000r／min離心5分鐘，棄上清。加入20μl溶解緩沖液，用移液管尖混勻細(xì)胞沉淀。加10μlRNA酶A(500U/ml)，輕彈管尖混勻。37℃孵育90分鐘。加10μl蛋白酶K(20mg/ml)，輕彈管尖混勻，50℃孵育過(guò)夜。樣品于20g/L瓊脂糖凝膠，25V，電泳3小時(shí)后，在凝膠成像系統(tǒng)中成像觀察。

細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

收集細(xì)胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液接種于25ml培養(yǎng)瓶，細(xì)胞濃度為2×105/ml，加入As2O3使終濃度為2μmol/L和5μmol/L，空白對(duì)照組只含培養(yǎng)液，處理0、24、48、72小時(shí)后，收集處理后細(xì)胞，計(jì)數(shù)，然后按MitoCaptureMitochondrialApoptosisDetectionKit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作后,立即送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

hTERTmRNA表達(dá)的RTPCR檢測(cè)

收集2μmol/LAs2O3不同時(shí)間處理組細(xì)胞，提取總RNA,按照Promega公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA。hTERT基因及內(nèi)參βactin基因擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司合成。hTERT基因上游引物：5‘CGGAAGAGTGTCTGGAGCAA3‘，hTERT基因下游引物：5‘GGATGAAGCGGAGTCTGGA3‘,擴(kuò)增片段145bp。內(nèi)參βactin基因上游引物：5‘CGCTGCGCTGGTCGTCGACA3‘,βactin基因下游引物：5‘GTCACGCACGATTTCCCGCT3‘,擴(kuò)增片段為619bp。PCR條件：94℃變性30秒；60℃退火60秒；72℃延伸60秒；共30個(gè)循環(huán),產(chǎn)物在20g/L瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)顯示及分析結(jié)果。

procaspase3、bcl2、hTERT蛋白表達(dá)的Westernblot檢測(cè)

收集As2O3處理的U266細(xì)胞，提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度。每孔加等量的蛋白樣品，進(jìn)行不連續(xù)的SDSPAGE電泳，電轉(zhuǎn)移至NC膜，用5％脫脂奶粉PBS于室溫下封閉1小時(shí)，一抗作用1小時(shí),洗膜30分鐘,二抗作用1小時(shí),洗膜30分鐘，ECL顯色系統(tǒng)顯示蛋白條帶，曝光在柯達(dá)膠片上。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS統(tǒng)計(jì)處理軟件進(jìn)行方差分析，以為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

As2O3對(duì)U266細(xì)胞生長(zhǎng)和活力的影響

不同濃度的As2O3處理U266細(xì)胞48小時(shí)后，U266細(xì)胞的增殖率與藥物劑量呈負(fù)相關(guān)，IC50為2μmol/L。同時(shí)，用2μmol/LAs2O3處理U266細(xì)胞

Figure1.EffectofdifferentconcentrationsofAs2O3onthevitalityofthemyelomacelllineU266.

后，U266細(xì)胞的增殖率與藥物處理時(shí)間也呈負(fù)相關(guān)。

Figure2.Effectof2μmol/LAs2O3onthevitalityofmyelomacelllineU266atdifferenttimepoints.

As2O3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的能力

DNA電泳U266細(xì)胞經(jīng)2μmol/LAs2O3處理24小時(shí)即出現(xiàn)細(xì)胞凋亡特征性條帶，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞凋亡逐漸增加。

Figure3.DNAelectrophoresisofU266cellstreatedwith2μmol/LAs2O3atdifferenttimepoints.M:marker.Lane1:0hour.Lane2:24hours.Lane3:48hours.Lane4:72hours.

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2μmol/LAs2O3處理后，U266細(xì)胞凋亡率隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。2μmol/LAs2O3處理0、24、48、72小時(shí)后的凋亡率分別是%、%、%、%。同時(shí)，不同濃度As2O3處理48小時(shí)后，U266細(xì)胞凋亡率隨藥物劑量的升高而增加。0、2、5μmol/LAs2O3處理48小時(shí)的凋亡率分別是%、%、%。

As2O3對(duì)U266細(xì)胞caspase3及bcl2蛋白表達(dá)的影響

Westernblot檢測(cè)顯示，2μmol/LAs2O3處理后，U266細(xì)胞內(nèi)procaspase3蛋白表達(dá)下降，提示了caspase3的活化。同時(shí)，我們還觀察到在此過(guò)程中Bcl2蛋白的表達(dá)未發(fā)生明顯的變化。

Figure5.Expressionofprocaspase3andBcl2proteininU266cellstreatedwith2μmol/LAs2O3atdifferenttimepoints.Lane1:0hour.Lane2:6hours.Lane3:12hours.Lane4:24hours.

As2O3對(duì)U266細(xì)胞hTERTmRNA和蛋白表達(dá)的影響

2μmol/LAs2O3處理U266細(xì)胞，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，hTERTmRNA表達(dá)逐漸下降。同樣，hTERT蛋白的表達(dá)也隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。

討論

三氧化二砷(As2O3)俗稱砒霜，是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥，有上千年的用藥史。近幾年來(lái)，As2O3用于各類惡性腫瘤的治療是腫瘤防治研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外研究顯示，As2O3在體外對(duì)多種實(shí)體瘤和血液腫瘤，

包括MM，均有作用，但其機(jī)制尚未完全清楚。我們的研究也證實(shí)，As2O3在體外能抑制骨髓瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞的凋亡，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性［1、3-6］。

線粒體跨膜電位(Δψm)的變化是細(xì)胞凋亡的早期事件,它可以導(dǎo)致促凋亡因子，如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等的釋放，激活caspase家族成員，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)As2O3作用后U266細(xì)胞Δψm的改變，以反映U266細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果顯示，As2O3作用后U266細(xì)胞凋亡率與藥物處理時(shí)間和藥物劑量均呈正相關(guān)。同時(shí)，DNA凝膠電泳也顯示As2O3可以誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞出現(xiàn)典型的DNA梯形條帶的凋亡表現(xiàn)。

Caspase家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用，其中caspase3是關(guān)鍵的執(zhí)行分子，在細(xì)胞凋亡的線粒體、死亡受體途徑中發(fā)揮作用。Westernblot檢測(cè)顯示：As2O3處理U266細(xì)胞6小時(shí)后，procaspase3的表達(dá)就開(kāi)始減少，并隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸減少，說(shuō)明caspase3的激活參與了As2O3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

Bcl2蛋白是Bcl2家族的抑制凋亡成員之一。它定位于線粒體膜上，可以影響線粒體膜的穩(wěn)定性和PT通道開(kāi)放，抑制線粒體釋放促凋亡蛋白，如：細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子，抑制促凋亡成員Bax、Bak蛋白的細(xì)胞毒作用，從而抑制細(xì)胞凋亡，并可以降低腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。文獻(xiàn)報(bào)道，As2O3可以通過(guò)下調(diào)BclXL、Bcl2的表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［6、7］，但我們研究的結(jié)果顯示，As2O3激活caspase3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl2蛋白的表達(dá)未發(fā)生變化。因此，As2O3誘發(fā)的U266細(xì)胞線粒體跨膜電位的改變并不是通過(guò)改變Bcl2蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

端粒酶在細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化中起到關(guān)鍵作用，其活性調(diào)節(jié)和腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)密切相關(guān)。端粒酶催化亞單位hTERT是端粒酶活性的唯一限制性組分。有學(xué)者報(bào)道，端粒酶有抗凋亡的作用，抑制其活性可以誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡［8］。本研究的結(jié)果顯示：在As2O3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，隨著hTERTmRNA和蛋白水平的表達(dá)的逐漸下降，U266細(xì)胞的凋亡率逐漸增加。這一結(jié)果提示，As2O3可以通過(guò)抑制hTERT的表達(dá)，降低端粒酶的活性，從而誘導(dǎo)或促進(jìn)U266細(xì)胞的凋亡。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)，As2O3抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，是通過(guò)改變線粒體跨膜電位，觸發(fā)線粒體凋亡途徑，激活caspase3實(shí)現(xiàn)的。此外，As2O3可以通過(guò)下調(diào)U266細(xì)胞hTERT的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。As2O3誘導(dǎo)U266細(xì)胞凋亡是否通過(guò)下調(diào)bclXL、Mcl1等Bcl2家族中的其他抑制凋亡成員和/(或)上調(diào)促凋亡成員實(shí)現(xiàn)仍需我們進(jìn)一步研究。

【參考文獻(xiàn)】

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