淺論改良組織塊法培養(yǎng)細針活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細胞

淺論改良組織塊法培養(yǎng)細針活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細胞【摘要】【目的】探討體外分離培養(yǎng)細針活檢滑膜組織成纖維樣滑膜細胞(FLS)的方法。【方法】滑膜組織來自接受盲式細針滑膜活檢術(shù)的活動期類風濕關(guān)節(jié)炎患者，分別采用消化酶培養(yǎng)法、組織塊培養(yǎng)法和改良組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)FLS。采用臺盼藍染色進行細胞計數(shù)及活性鑒定，并應用倒置相差顯微鏡、透射電鏡、免疫細胞化學染色、流式細胞術(shù)對第3～4代FLS進行鑒定。【結(jié)果】3種原代分離培養(yǎng)的方法均可成功培養(yǎng)出FLS。臺盼藍染色示FLS細胞計數(shù)約(±)×105/瓶，活細胞百分率95%。傳代可使FLS達到形態(tài)學上的純化要求，倒置相差顯微鏡、透射電鏡觀察均符合FLS的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，免疫細胞化學染色示Vimentin陽性、CD68陰性、CK陽性，流式細胞術(shù)檢測示CD55+細胞占(±)%。改良組織塊法培養(yǎng)FLS成功率較高，細胞游出時間較早，所需傳代時間較短。【結(jié)論】改良組織塊法特別適合于細針滑膜活檢標本FLS的培養(yǎng)，第3～4代細胞的數(shù)目、活性及純度符合進一步實驗的要求。

【關(guān)鍵詞】成纖維樣滑膜細胞;細胞培養(yǎng);細針活檢

Abstract：【Objective】Toexploretheculturemethodforfibroblast-likesynoviocytes(FLS)fromneedlebiopsiedsynoviumtissue.【Methods】Synoviumtissueobtainedfrompatientswithactiverheumatoidarthritisbyblindneedlesynoviumbiopsywereculturedwiththreedifferentmethods(digestiveenzymeculture，tissuecultureandmodifiedtissueculture).Cellcountandthepercentageofviablecellswereobservedbytrypanbluestaining.FLSwereidentifiedbymorphology，immunocytochemicalstainingandflowcytometry.【Results】AllthreemethodscouldcultureFLSsuccessfully，ofwhichmodifiedtissueculturemethodwasbetterthantheothertwomethods.FLScellcountwas(±)×105perflaskwithmorethan95%viablecellsbyTrypanbluestaining.FLSofthethirdorforthgenerationshowedtypicalmorphologicalcharactersunderinvertedphasecontrastmicroscopeandtransmissionelectronmicroscopewithVimentin+/CD68-/CK+stainingand(±)%CD55+cells.Modifiedtissueculturemethodhashighersuccessfulratewithearlierandmorequicklycellemigrationfromsynoviumtissue.【Conclusion】ModifiedtissueculturemethodisespeciallysuitableforFLScultureinvitrofromneedlebiopsiedsynoviumtissue.Thecellcount，thepercentageofviablecells，andpurityofFLSofthethirdorforthgenerationmeettherequirementformolecularbiologyexperiments.

類風濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎癥為特征的慢性自身免疫性疾病，滑膜細胞增生并向周圍組織侵襲形成血管翳在RA的發(fā)病、慢性炎癥的維持及骨與軟骨的破壞中起重要作用。成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-likesynoviocyte，F(xiàn)LS)是滑膜組織最活躍的組成細胞，可通過自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生大量的炎性細胞因子及免疫反應介質(zhì)，是參與RA發(fā)病的重要細胞[1]。FLS體外培養(yǎng)模型的建立對于研究FLS的功能、進一步探討RA的發(fā)病機制及體外篩選治療RA的藥物具有重要意義。目前用于FLS體外培養(yǎng)的滑膜多來自關(guān)節(jié)開放性手術(shù)、關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、從滑液中分離及細針滑膜活檢等方法，其中細針滑膜活檢局麻下操作，技術(shù)簡單，并且獲取的滑膜組織常較少混有其它成分，有利于原代細胞培養(yǎng)的純化和操作。然而，細針活檢獲取的滑膜組織體積較小，標本總量較開放手術(shù)少，若采用經(jīng)典的消化酶培養(yǎng)法或組織塊培養(yǎng)法進行原代培養(yǎng)，成功率偏低，細胞生長速度緩慢。為此，本實驗探討細針活檢滑膜組織FLS體外培養(yǎng)的最佳方法，為有效進行下一步實驗做準備。

1材料與方法

材料

滑膜組織

來自接受盲式細針滑膜活檢術(shù)的確診活動期RA患者，RA診斷符合1987年美國風濕病協(xié)會(AmericanCollegeofRheumatology，ACR)修訂的診斷標準。

主要試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)、g/L胰酶-g/LEDTA(美國GIBCO公司);I型膠原酶、PBS緩沖液、臺盼藍(廣州威佳生物有限公司);鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CD68單克隆抗體、生物素化羊抗鼠IgG、DAB反應顯色試劑盒(武漢博士德公司)、鼠抗人CK單克隆抗體(北京中杉)、鼠抗人CD55單克隆抗體(BDPharmingen公司)。

方法

消化酶培養(yǎng)法

①將活檢的滑膜組織剪碎，加入I型膠原酶(1mg/mL)并充分混勻，置37℃、體積分數(shù)5%CO2細胞培養(yǎng)箱中消化4～6h;②用100目細胞濾網(wǎng)過濾、離心，棄上清，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，移入細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng);③每2～4d更換一次含100mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。

組織塊培養(yǎng)法

①將活檢的滑膜組織剪成1mm3大小，以5mm間距均勻排列在培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，使培養(yǎng)面斜向上置細胞培養(yǎng)箱;②孵育4h待組織塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng);③每2～4d更換一次含100mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液。待組織塊周圍FLS成片生長后，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。

改良組織塊培養(yǎng)法

①將活檢的滑膜組織剪成1mm3大小，加入I型膠原酶并充分混勻，置細胞培養(yǎng)箱中消化4～6h;②細胞濾網(wǎng)過濾、離心，棄上清，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸細胞，移入細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng);③收集細胞濾網(wǎng)上的組織碎屑，以5mm間距均勻排列在另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面，加入含200mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液4mL及I型膠原酶1mL，使培養(yǎng)面斜向上置細胞培養(yǎng)箱;④孵育4h待組織塊貼附后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng);⑤24h后更換含100mL/LFBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，以后每2～4d更換一次培養(yǎng)液，待FLS成片生長后，去除組織塊繼續(xù)培養(yǎng)。

FLS的傳代培養(yǎng)

待細胞長至融合度約70%～80%時進行細胞傳代，g/L胰酶-g/LEDTA消化，待細胞突起逐漸收縮、細胞變圓、細胞間距增大時終止消化，離心后按1：3進行傳代培養(yǎng)。

臺盼藍染色FLS計數(shù)及活性鑒定

將第3～4代FLS消化離心重懸后，取等體積細胞懸液和5g/L的臺盼藍染液混勻，靜置染色3～4min后計數(shù)。死細胞被染成淡藍色，活細胞拒染。根據(jù)以下公式進行細胞計數(shù)：細胞總數(shù)/毫升=(4大格細胞總數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)。活細胞百分率(細胞活性)=(4大格活細胞總數(shù)/4大格細胞總數(shù))×100%。

倒置相差顯微鏡

觀察細胞原代及傳代后的形態(tài)及生長狀況。

透射電鏡

第3～4代細胞細胞消化離心后，25g/L戊二醛、20g/L多聚甲醛混合液前固定，10g/L鋨酸后固定，乙醇、丙酮梯度脫水，Epon包埋劑包埋，超薄切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染，PhilipsCM10透射電鏡觀察。

Vimentin、CD68、CK免疫細胞化學染色

將第3～4代細胞爬片用40g/L多聚甲醛液固定，加一抗(鼠抗人Vimentin單克隆抗體、鼠抗人CD68單克隆抗體、鼠抗人CK單克隆抗體，1∶100稀釋)、加生物素化羊抗小鼠IgG，DAB顯色，蘇木素輕度復染，乙醇梯度脫水，中性樹膠封片。PBS作為陰性對照。

流式細胞術(shù)檢測CD55+細胞百分率

第3～4代細胞經(jīng)消化重懸制成1×105/mL的單細胞懸液，加入鼠抗人CD55單克隆抗體進行免疫熒光染色，流式細胞術(shù)檢測細胞表面CD55表達并計算其陽性率。

2結(jié)果

三種體外培養(yǎng)FLS方法的比較

共行24例次細胞培養(yǎng)，其中消化酶培養(yǎng)法10次，成功6次;組織塊培養(yǎng)法5次，成功4次;改良組織塊法9次，成功9次。采用消化酶培養(yǎng)法，F(xiàn)LS約24h貼壁，初期生長較慢，約2周長滿瓶底20%～30%，之后生長較快，約4周長滿瓶底的70%～80%(圖1)。采用組織塊培養(yǎng)法，2～3d可見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，兩周后細胞迅速生長，約3～4周長滿瓶底的70%～80%(圖2)。采用改良組織塊培養(yǎng)法，分為2瓶原代細胞，1瓶為膠原酶所消化下來的細胞，其生長速度與消化酶法相近;另1瓶為組織塊，1～2d后見長梭型FLS從組織塊邊緣游走生長，并逐漸增多呈放射狀，1周后細胞迅速生長，約2～3周長滿瓶底的70%～80%(圖3)。

FLS計數(shù)及活性鑒定

3種方法培養(yǎng)出的FLS長滿25cm2培養(yǎng)瓶時細胞總數(shù)為(±)×105/瓶，活細胞百分率95%。

FLS的鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察可見FLS呈三角形、梭形，細胞核成卵圓形，位于細胞中央，核仁清晰，細胞周圍可見分泌物聚集。Vimentin、CD68、CK免疫細胞化學染色結(jié)果顯示第3～4代FLSVimentin染色陽性，胞漿內(nèi)見大量棕黃色顆粒，CD68染色陰性，CK染色陽性，胞漿可見棕黃色顆粒(圖4)。透射電鏡下觀察可見FLS核染色質(zhì)較疏松，呈細顆粒狀分布在核周圍，核仁明顯，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞漿突起長而粗，胞漿中往往缺乏高爾基復合體，可見少量小泡和囊泡(圖5)。流式細胞術(shù)檢測3～4代FLSCD55+細胞百分率為(±)%(圖6)。

3討論

滑膜包括襯里層和襯里下層，襯里層主要有巨噬樣滑膜細胞和FLS，襯里下層為結(jié)締組織，RA尤其是病程長的患者其滑膜襯里下層含較多的纖維組織。FLS在慢性炎癥過程中被激活后，出現(xiàn)細胞表型的顯著改變，具有不完全轉(zhuǎn)化細胞的特性，即使脫離炎癥環(huán)境仍持續(xù)活化，增殖能力升高，逃脫接觸抑制，呈現(xiàn)腫瘤樣增殖，并具有侵襲能力。FLS體外培養(yǎng)模型的建立對于研究包括RA在內(nèi)的多種滑膜關(guān)節(jié)病變的發(fā)病機制具有重要意義。

目前用于FLS體外培養(yǎng)的滑膜多來自關(guān)節(jié)開放性手術(shù)、關(guān)節(jié)鏡手術(shù)、從滑液中分離及細針滑膜活檢等方法。前兩種方法所獲取的滑膜組織較大，采用消化酶培養(yǎng)法或組織塊培養(yǎng)法往往都能成功培養(yǎng)出FLS[5-6]。然而，開放手術(shù)對患者的創(chuàng)傷大，多用于晚期RA患者，切取的滑膜組織可能混有較多其它組織成分;關(guān)節(jié)鏡手術(shù)則實現(xiàn)了可視下滑膜活檢，是目前獲取滑膜標本的“金標準”，但需專門設(shè)備、價格昂貴、技術(shù)難度高。從滑液中分離得到的滑膜或滑膜細胞數(shù)量有限，且脫落至關(guān)節(jié)腔的滑膜或滑膜細胞的生物學特性可能與關(guān)節(jié)表面的滑膜或滑膜細胞的生物學特性不完全一致。細針滑膜活檢術(shù)操作安全、簡便，成功率高，可用于早中期的RA患者。本實驗采用盲式細針滑膜活檢術(shù)獲取滑膜組織，其體積往往較小，滑膜組織數(shù)量不如關(guān)節(jié)開放性手術(shù)及關(guān)節(jié)鏡手術(shù)多。因此利用這種細針活檢滑膜組織進行FLS體外培較困難。

經(jīng)典的細胞原代培養(yǎng)包括消化酶培養(yǎng)法和組織塊培養(yǎng)法。消化酶培養(yǎng)法屬于化學法，需要的滑膜標本量較多，且消化酶活性不夠穩(wěn)定，不利于有效消化分離滑膜纖維組織，細胞不易游離出來，加上所用的消化酶對細胞有一定的毒性，因此該方法FLS體外培養(yǎng)的成功率不高，細胞生長速度緩慢。組織塊培養(yǎng)法雖然適合滑膜標本量較少的情況，細胞生長可定位觀察，換液次數(shù)少，減少了污染的機會，但種植的組織塊不易成活，簇狀方式長出的細胞時間間隔較長，細胞生長緩慢。我們根據(jù)細針活檢滑膜組織的特點，對上述傳統(tǒng)的方法進行了改良，將消化酶法及組織塊培養(yǎng)法有機地結(jié)合起來，既具有組織塊培養(yǎng)法的優(yōu)點，又避免了消化酶培養(yǎng)法的缺點，尤其適合滑膜標本量較少時。

在FLS體外分離培養(yǎng)過程中，可能同時混雜巨噬樣滑膜細胞以及少量的內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞等。巨噬樣滑膜細胞(A型滑膜細胞)呈卵圓形，胞周有短突起，核仁清晰;內(nèi)皮細胞光鏡下呈三角形或梭形，長滿時呈鋪路卵石狀排列;樹突狀細胞多為懸浮，光鏡下細胞體積較大，形狀不規(guī)則，并且有毛刺狀突起，這三種細胞的形態(tài)學及生長特性與FLS有差異。研究顯示，第一代的滑膜細胞中約40%～50%為巨噬樣滑膜細胞，50%～60%為FLS，而第三代則99%以上為均一的FLS[10]。這主要是由于巨噬樣滑膜細胞不具有增殖能力，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞漸漸衰老至失去活性，在體外僅可存活約10d[11]。FLS在含100mL/LFBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)的分裂增殖迅速，呈長梭狀極向排列，能以傳代培養(yǎng)的方式在體外培養(yǎng)較長時間。因此用自然純化、酶消化及反復貼壁傳代相結(jié)合對細胞進行分離和純化，可逐步獲得較純的FLS。

分離純化FLS之后還必須對其進行鑒定，包括形態(tài)學和細胞表面標記物的檢測。值得注意的是細胞表面標記物的檢測。FLS較特異的細胞表面標記有UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55、鈣粘蛋白-11(Cadherin-11)、Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶、CD44等[12]，其中Vimentin、Thy-1/CD90、脯氨酸羥化酶是各種成纖維細胞的標記，而UDPGD、VCAM-1/CD106、DAF/CD55是襯里層FLS的特異標記。其中CD55為補體衰退加速因子(DAF)，在與血液接觸的細胞中都有低表達，而在組織空腔襯里的間充質(zhì)細胞、濾泡狀樹突狀細胞有高表達[13]，在關(guān)節(jié)腔滑膜組織中FLS也有較高的表達，可與其它成纖維細胞相鑒別。CD68是巨噬細胞的表面標志，巨噬樣滑膜細胞陽性表達。

另外，本實驗分離培養(yǎng)的FLS還可能同時混雜襯里下層的纖維母細胞或成纖維細胞。襯里層的FLS具有上皮樣表型如E-Cadherin的表達[14]，而襯里下層的纖維母細胞或成纖維細胞來源于間充質(zhì)細胞，Vimentin陽性而不表達DAF/CD55，說明襯里層和襯里下層的成纖維樣細胞亞群之間表型及功能不同[15]。新近研究發(fā)現(xiàn)，RA滑膜襯里層的FLS不但具有成纖維細胞形態(tài)，而且具有不依賴支持物生長、細胞連接粘附分子消失、Vimentin表達增高等間充質(zhì)細胞特點，表明RA-FLS存在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)[16]。EMT不僅可能是RA-FLS大量增多的原因之一，而且還可能與RA滑膜浸潤破壞軟骨有關(guān)[14，16]。本文體外分離純化的細胞通過細胞表面標記檢測發(fā)現(xiàn)其Vimentin、DAF/CD55、CK均陽性，CD68陰性，表明分離純化的細胞為襯里層同時具有上皮和間充質(zhì)細胞特點的FLS而不是襯里下層僅有間充質(zhì)細胞表型特點的纖維母細胞或成纖維樣細胞。

本實驗對RA滑膜體外培養(yǎng)的第3～4代細胞行形態(tài)學及細胞表面標記檢測，結(jié)果顯示，培養(yǎng)出的細胞為FLS，純度95%。由于第1～2代FLS的純度不夠，而第5代之后的FLS出現(xiàn)老化現(xiàn)象，增殖活性明顯降低，細胞形態(tài)變化較大，至第8代完全失去增殖活性，因此采用第3～4代FLS進行后續(xù)實驗。

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