LFY類基因在莖端分生組織形成中的作用_第1頁
LFY類基因在莖端分生組織形成中的作用_第2頁
LFY類基因在莖端分生組織形成中的作用_第3頁
LFY類基因在莖端分生組織形成中的作用_第4頁
LFY類基因在莖端分生組織形成中的作用_第5頁
已閱讀5頁,還剩10頁未讀 繼續(xù)免費(fèi)閱讀

下載本文檔

版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)

文檔簡介

LFY類基因在莖端分生組織形成及其活動(dòng)中的作用ExpressionPatternofLFY-likeGeneanditsFunctioninShootApicalMeristemActivity98級(jí)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物與遺傳學(xué)系劉曼摘要LFY類基因在植物形態(tài)建成過程中具有重要作用,根據(jù)其突變體的特征,曾一度被認(rèn)為是在花分生組織和花序分生組織中特異表達(dá)的“分生組織特征決定基因”,控制花序分生組織向花分生組織的轉(zhuǎn)變。但隨著研究的深入,人們發(fā)現(xiàn)其在營養(yǎng)分生組織甚至胚胎發(fā)生過程中都有所表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)試圖通過啟動(dòng)子活動(dòng)特點(diǎn)研究、mRNA水平上原位雜交分析等各種方法,對(duì)其功能進(jìn)行深入地探討,以期全面地認(rèn)識(shí)該類基因在植物發(fā)育中的作用。Abstract認(rèn)根跪LF虛Y-旁li進(jìn)ke綱g吉en戒es怎p魂la家y雪im侵po教rt錫an月t危ro鼻le丸i松n年pl暢an誰t瘦de章ve括lo臣pm倡en鞠t,鏈w送he習(xí)n抓th聚ey驚w茂er愧e度fi櫻rs快t拖is臘ol木at孩ed效f蘿ro億m供mu玻ta傭nt右s小of閣A噴nt劈ir杰rh形in舉um傷a延nd鴨A政ra互bi獎(jiǎng)do炕ps尿is狗,狡th心ey拔w綱er曠e辣th染ou在gh圾t梢to跨b啞e煤“S恩AM貓-s勸pe女ci者fi膀c-坦de缺te孟rm銳in煩at因in綿g-簽ge然ne榮s”播,售re姐gu皮la逗ti秤ng蘭t保he庫t享ra精ns褲it淺io廟n團(tuán)fr搞om職i賺nf從lo降re韻sc辨en麗ce曾t憐o糖fl圾ow伐er傲m栗er效is輸te征m.津H疫ow窗ev湊er仰,舒fu煩rt傳he踏r嚼re壘se續(xù)ar癢ch辱r退ev遵ea耐le竟d炒th逮at纖L翼FY鴉-l駱ik件e凍ge泥ne伶s’但a南ct言iv醉it救y熱ca瓣n撕be邊f(xié)者ou孤nd招i喂n臟em毀br挖yo跑ge鞭ne蘿si狐s,貧s話ho龜ot酬a逐pi匪ce暴s洞an耍d踢ax火il速la嗎ry巷b廚ud裙s挑at易d宿if承fe糕re瘦nt脹s章ta蚊ge爆s拘as伐w養(yǎng)el膏l(xiāng)庭as扯i賴n結(jié)fl崇ow兇er君p停ri紛mo帶rd虧ia贊l.置W泉e引ch犬a(chǎn)r擁ac揚(yáng)te雄ri沸ze徑d攏LF馳Y架pr槽om句ot耍er載’s樣a塞ct刃iv踏it脈y奇an查d遼in笑ve是st撿ig壺at釘ed魯L通FY囑m糖RN豪A車ex攝pr妨es宇si濾on棗w對(duì)it少h畝Wh鏡ol攔e-咽mo屯un沃t徒in除s祖it霞u注Hy激br纏id碧iz尚at凱io攻n,殼i輕n辟or挑de涌r證to洪m見ak激e受th仗ei托r厭fu腥nc姑ti滴on襯c告le稀ar畏er焰.引言厲植患物形盯態(tài)建卷成有衫與動(dòng)卷物形欄態(tài)建效成完徹全不糾同的監(jiān)特點(diǎn)羅:其柴完成鋤生活爹周期地所需應(yīng)的地準(zhǔn)上部找分基囑本器聾官類帆型都覆是由躍莖端劈分生危組織右(列sh夾oo癢t禿ap劃ic機(jī)al瀉m鵲er瑞is皆te魔m,梢S格AM宰)的抖活動(dòng)鏡而逐知步形蒜成的陽。因蝦此,倒莖端銳分生組組織坦在植縮物形大態(tài)建征成中丑的重疑要性給是不累言而閘喻的召。但蹈長期老以來獻(xiàn),雖盯然人炭們始藥終在驕努力軋,而孤且近春十年架來出黨現(xiàn)了晉分離抓得到槍莖端隨分生葉組織娃活動(dòng)房相關(guān)佳基因沙等重辦大的伸突破三[1贈(zèng)],粒可目較前在著莖端罰分生悶組織沃的形專成變慮化及言其終幅結(jié)方三式等辨基本認(rèn)問題弊方面迎卻仍栽然沒斑有得繼到合去乎邏細(xì)輯的啟解釋掠。根眠據(jù)突功變體竊研究址的早嫂期結(jié)毫果,嚷人們昏形成雄了目執(zhí)前占窗主導(dǎo)君地位法的觀獵點(diǎn),機(jī)即莖寒端分頭生組待織在螺“醬胚胎余發(fā)生牌”淺過程局中形評(píng)成,卷隨后歲在刮“能胚后騙發(fā)生爸”窗的過條程中團(tuán),被垃一些焦“拉分生股組織雅特征夕決定矩基因竊”倡控制法,逐序步由些“擁營養(yǎng)承分生漆組織城”煉改變草為條“撈花序焰分生鍬組織簡”零和哨“?;ǚ譂u生組鉤織遮”瀉[2總]。老但隨煙著研象究的竹深入正,人這們逐留漸發(fā)暴現(xiàn),傭一些威過去冬被認(rèn)斷為是宋在爺“慈花分仆生組新織蒜”缺和伸“嘉花序德分生蜘組織暗”雖中特稠異表賊達(dá)的王“液分生角組織橡特征剖決定呢基因梯”草,大串部分凱都不押用程最度地風(fēng)在雁“巖營養(yǎng)勵(lì)分生選組織晚”爐甚至插“映胚胎息發(fā)生肺”女過程挎中表撿達(dá)[搜3-報(bào)7]損。這漠些現(xiàn)斥象是冒現(xiàn)有獻(xiàn)的假若說所錄無法攏解釋儉的。醉顯然鏈,這曲些新勸的發(fā)羞現(xiàn)對(duì)姿現(xiàn)有限的觀截點(diǎn)提譯出了燈不可屯回避達(dá)的挑恢戰(zhàn)。釋只有糊通過瞞對(duì)這液些基熄因表擋達(dá)特示征及援其功福能的揮深入盆研究隆,我句們才揭有可輩能真杜正從瓜分子更水平懲上逐侮步解散釋莖環(huán)端分陪生組典織形哀成、波活動(dòng)正及其革終結(jié)裂的分態(tài)子機(jī)元理并床從中繳逐步誼揭示調(diào)莖端辭分生野組織題在植班物形呈態(tài)建牌成中系所扮坐演的雖角色律。恥奧熱LF雞Y攻類基琴因正稻是上完述基愛因中爽的一掛種。濾它的抓突變倍導(dǎo)致勁植物夠表型激發(fā)生睛一系為列的冤變化剃。在淺野生嘴型植斷物體范中應(yīng)炎發(fā)育乞成花塊的部帳位,英在挽lf復(fù)y功突變別體中軋則發(fā)鎖育出套花序午,或亞是僅狼由萼符片和休花瓣捎組成除的異膨常花撞。而粒且裕LF韻Y談和A佳PE躁TA襪LA近1或已AP賊ET般AL眾A2奇的雙廁重突廟變體桑會(huì)導(dǎo)挪致植奸物的吧花完宜全喪隙失野囑生型砌花所羽具有凈的縮賢短節(jié)雷間、偷頂端辣有限神生長夕等特曉點(diǎn)。嘉根據(jù)絹以上梁種種爐現(xiàn)象溜,當(dāng)輛LF洪Y痛類基截因從暮金魚撫草和恰擬南乞芥的翼有關(guān)魚突變?nèi)荔w中些分離浙出來睜時(shí),桂被認(rèn)肉為其愈在植艙物發(fā)卸育中郵控制晶莖端佳分生濱組織魯從花壺序分衣生組花織轉(zhuǎn)嚇變?yōu)閼倩ǚ謧M庸織[或2,梁8]撥。但網(wǎng)隨著植該基炕因的妨同源眨序列按從其崖他植籍物中揭被陸亂續(xù)分菠離,診人們邊發(fā)現(xiàn)擱在煙傳草、楊鳳仙左花、治豌豆失、矮肉牽牛蘆、水塌稻、奉松樹杠等植扮物中股,悄LF聽Y口類基緒因的拳表達(dá)著并不燒局限堪于花貴分生蓋組織腫,而箱是廣手泛地?zé)岽嬖诜庞诓荒就l(fā)報(bào)育階貢段的計(jì)莖端噴分生撈組織籌[3享-6唐,9顆,1金0]友。更底重要乎的是胳,后帝來的雄研究谷表明獅,即扎使在永擬南專芥中顫,削LF慚Y斥基因掉實(shí)際悄上在陡其早暗期的攀發(fā)育晴階段糾,即退在花擁序分咳生組灣織形井成之貼前,滿已經(jīng)堆在莖咐端分車生組謎織中糾表達(dá)封[1獸1]挪。同奪時(shí),宋轉(zhuǎn)基傭因?qū)嵱膀?yàn)表焰明,械LF增Y斬基因累表達(dá)勻量越業(yè)大,冶植物殃開花撈越早謀[1剝2,絹13促]。背因此邪,對(duì)宮該基堪因的等功能烏又有塊了一賣種新償?shù)恼J(rèn)丑識(shí),供即它晨不僅施決定裝花序憑分生嶼組織花轉(zhuǎn)變妖為花襖分生展組織窮,而格且還掘影響賴開花聽的早烘晚。托白急書農(nóng)補(bǔ)教授磚等在脅進(jìn)行依另一宋種擬貍南芥可突變珠體弓em倆f布的研巴究中脖,曾守注意隸到省LF狼Y夢(mèng)基因俊在植數(shù)物早蠟期發(fā)頁育階禽段表秋達(dá)中逗的特俯點(diǎn),集并曾顆利用灑LF憶Y:舌:G儀US惑轉(zhuǎn)基每因植團(tuán)物為逝材料泡,對(duì)柏其在任植株至“偉營養(yǎng)秒生長析”喉階段眾的表副達(dá)特樸點(diǎn)進(jìn)械行過館系統(tǒng)陣的研克究[蒜白書鉛農(nóng)等縫,未插發(fā)表政資料牛,1景99渴8]繭。發(fā)援現(xiàn)芹LF引Y齒基因即的啟助動(dòng)子敢不僅搖在種矮子萌先發(fā)后課不同禁階段除的莖遼端分鑄生組營織和挽幼小蒙的器牢官原屆基中厲表達(dá)辱,而嗎且在翅早期河胚胎故發(fā)生林過程突中也加有表匹達(dá)。猜最為北引人拐注目鏟的是崗,黎LF污Y誓基因案啟動(dòng)威子的吉活動(dòng)?jì)屌c由灶根外錯(cuò)植體惑再生座植株紋過程熊中莖草端分辭生組削織的塔形成盟及其竹活動(dòng)自存在藝直接忙的相呆關(guān)。身據(jù)此箭白書睜農(nóng)教跟授等心提出殺,中LF胡Y侮基因樓的表憶達(dá)很利可能壺與莖公端分爹生組行織的挨形成醫(yī)及其透活動(dòng)松有關(guān)渴,而剝它表宜達(dá)量氣的增該長水傘平和收開花綠相關(guān)潔聯(lián)。俱但葡是,紛有研畜究表恨明,厭以稈GU冒S涉等報(bào)賤告基延因所岸顯示倒的啟起動(dòng)子慈活動(dòng)劉模式勒可能囑并不戚一定夸反映介該啟俗動(dòng)子京對(duì)其避原有杰基因綱表達(dá)帶的時(shí)晝空調(diào)猾節(jié)模警式。程因?yàn)槿阑蚝Y的表亮達(dá)不廢單需聰要啟均動(dòng)子驢的活租動(dòng),銷還和柄一些鞭其他藏因子握,例瀉如內(nèi)慨含子鳴等有寧關(guān)。壞因此其,要污真正緣了解熟LF長Y悟基因女在分脫生組爛織形踩成與網(wǎng)活動(dòng)漂過程饞中的牽表達(dá)癥特點(diǎn)伸,還振應(yīng)有媽對(duì)其凝轉(zhuǎn)錄通產(chǎn)物記即勝mR跳NA毯進(jìn)行讀原位爭檢測堂的證亮據(jù)。脖本課肚題即井是在簡本實(shí)藝驗(yàn)室倉過去首工作舟的基它礎(chǔ)上麻,試蒙圖從匪正常榴植株束與組陪培過貸程再酸生植夠株中碧LF塞Y罩啟動(dòng)筆子活屑動(dòng)方營式的揭檢測擔(dān)和產(chǎn)LF肯Y刺基因攔轉(zhuǎn)錄滋產(chǎn)物茶的直滿接檢就測兩鳳個(gè)方什面,躬對(duì)涂LF讓Y拍類基趟因早賤期表彼達(dá)特降點(diǎn)及皇其可勻能的涂功能賓等關(guān)律鍵問諷題進(jìn)長行進(jìn)慰一步卻地探畢討。每本課漆題研領(lǐng)究中嶄主要蜂涉及瓦兩種勞基因糕表達(dá)冷的檢漂測技示術(shù)。讀當(dāng)研灰究斑LF趟Y淺啟動(dòng)膊子活暫動(dòng)方言式時(shí)宣,我重們采疾用報(bào)找告基扮因的勢表達(dá)紋分析袋方法未。報(bào)市告基由因通譽(yù)常編旦碼一疲個(gè)在精離體字條件艇下易鴨于檢佛測的豈酶,最或者傾編碼郵可以幣在活偉體條價(jià)件下聞進(jìn)行匯組織道化學(xué)咸定位鏈的蛋創(chuàng)白,申這樣扯就可寇以提歲供基挖因表婚達(dá)定招量的鏡和定匹性的童信息嫂。蒼gu擁sA叢基因卻是從忙大腸連桿菌斃(E淚sc撫he饑ri睛ch看ia災(zāi)c閱ol另i)顛中分語離出尾來的刺,并祝且目摘前有取一些泄基因籍盒可附以允蠻許在壯gu棕sA嚴(yán)基因稍的附購近插無入啟弟動(dòng)子摧區(qū),腿產(chǎn)生朽轉(zhuǎn)錄樸融合啦基因禽或翻指譯融欣合基偵因。匠我們恐實(shí)驗(yàn)且所用瘡的蓮Pl幸fy杏::穗GU死S刺擬南文芥和召Pl頸fy扛::草GU護(hù)S豪煙草凡、掏Pn餐fl棒::態(tài)GU絹S橫煙草億即是睬在薯gu擔(dān)sA稻基因排前插剖入變LF家Y陵或革NF攤L墳基因辰的啟惰動(dòng)子獻(xiàn)(嬸Pl久fy偉或仍Pn醒fl啟),棍當(dāng)槐Pl挖fy丘或脅Pn耐fl慨活動(dòng)毛時(shí),乏帶動(dòng)桃gu紹sA層表達(dá)敢,利襯用一忙個(gè)簡鐮單的魔組織證化學(xué)念檢測支就可泊以精冠確地壁分析滿gu紙sA者融合畏基因美的時(shí)么空表闊達(dá)模鮮式。遼用5吩-溴堪-4完-氯優(yōu)-3紋-吲囑哚葡贊糖苷廳酸(詢X去-抓gl終uc謎)作澆為底綁物可環(huán)以精肢確地援進(jìn)行慨GU嘆S舌活性扭的定辦位,滅這一夫反應(yīng)婚分兩公步進(jìn)圖行:選首先但是切讓割葡佛糖醛女酸部字分,曾產(chǎn)生責(zé)無色減的吲損哚氧替基中惰間產(chǎn)舍物,恰隨后聽吲哚皆氧基倘中間與產(chǎn)物涌氧化忠成為探不溶遵的藍(lán)棍色沉刑淀。瓜用撤GU改S電進(jìn)行申這類無實(shí)驗(yàn)毫有如占下優(yōu)遇點(diǎn):明(1班)在談大多洲數(shù)植溉物組掛織中性GU腹S噸活性忘的本傘底低腹;(膏2)中反應(yīng)柄產(chǎn)物妙不擴(kuò)此散,犯在表謊達(dá)基游因的謙植物船細(xì)胞尺內(nèi)積膜累;旁(3市)通枯過簡喚單的銜擴(kuò)散駱或真尸空滲漸入,浸底物插易被寶植物爆細(xì)胞姻吸收缺。當(dāng)?shù)谌唬i也存種在一紅些缺泥點(diǎn):五(1銀)組綿織化迅學(xué)染炎色后福植物黑失去旁繼續(xù)牛培養(yǎng)貴的可麻能,盞這樣擱不能給跟蹤把檢測曲同一娃株植陰物不障同時(shí)甩期的燙基因驅(qū)活動(dòng)辭情況??;(亞2)持由于岸酶和永產(chǎn)物棉非??浞€(wěn)定材,因振而不澤能真便實(shí)的倘反映丟出殖GU流S浮替代狹的那集個(gè)蛋均白在擁穩(wěn)定翁狀態(tài)縱下的煌豐度鼓;(明3)讀人們變發(fā)現(xiàn)攝在蹦GU幻S筍表達(dá)嫌水平閱很高碰的組除織中編會(huì)發(fā)巴生無寶色反臭應(yīng)中想間產(chǎn)鳴物滲它漏的爪現(xiàn)象牽,但爹是,釀這可愈以通恨過在泄底物講溶液額中加嶄入氧耗化劑醉高鐵慘氰化壽鉀或邀亞鐵順氰化惹鉀或減者二兼者都段加(構(gòu)終濃秧度為蛾5圾mm津ol斤/L其),予來使屢這種雖滲漏炸減至椒最少系(彼St亭om跨p虎19頁90劑;仆Ma斬sa苦re難nh科as巨和問Ha嘉mi鑼lt嘉on塞1意99剛2粉);準(zhǔn)(4罰)同給所有刺的組凝織化方學(xué)方沃法一晉樣,謊其檢姿測結(jié)拳果不紀(jì)是定較量的夸。而容且,失最致像命的卷缺點(diǎn)弱是,辭啟動(dòng)證子的在分析臘不一多定總拋能反半映基礎(chǔ)因的若真實(shí)撇活動(dòng)傲情況釣(如場前文廊所述征),潑這是仇在運(yùn)峰用報(bào)琴告基密因方鍋法進(jìn)序行基杯因表咽達(dá)特朱征分瑞析時(shí)甜必須存注意攪的一呈個(gè)問紫題。拾當(dāng)檢每測蜂LF菊Y易基因步的轉(zhuǎn)把錄產(chǎn)胳物時(shí)囑,我孔們用著到了午原位錦雜交搜(死in俊s屠it摸u撥H誰yb罪ri鞠di扭za糠ti糾on盈,單簡稱天IS憂H)礙技術(shù)誦。該拒技術(shù)靠最早兩是由慕Ga傘ll排和腹Pa管rd劈ue新胞(1標(biāo)9摟69勢)及秋Jo種hn淡等的(1燒9是69元)獨(dú)被立發(fā)茶明的核。其固基本姑原理繪是根株據(jù)核灶酸分壇子堿刑基互夾補(bǔ)配憐對(duì)的港原則玉(洪A-貨T,跡C餃-G網(wǎng)),芳將有跨放射瓣性或寺非放殘射性廁標(biāo)記澇的外費(fèi)源核輔酸窗(探秩針:師Pr姐ob這e舍)與飲染色牲體上租經(jīng)過終變性教后的滑單鏈扛DN帽A熟互補(bǔ)弓配對(duì)蹄,蛙結(jié)合孟成專歇一的盡核酸杯雜交呼分子庭,業(yè)再經(jīng)寇一定炎的檢翠測手凳段防,將紫待測奴核酸廟在染晨色體生上的冰位置頁顯示奴出來址。站我們丈采用亂的其mR巷NA政水平彩的原激位雜言交技詳術(shù),廚是將撈含有域目的領(lǐng)基因螺cD輔NA伐的質(zhì)霉粒分壽別用頭限制酸性內(nèi)汁切酶鞭從目撲的片峰斷的響兩端翠單切監(jiān),使勸質(zhì)粒牲線性亂化。周然后竊從兩挖端用主不同壘的轉(zhuǎn)概錄酶承按照戴A-狠U,御C撿-G余的互府補(bǔ)配舅對(duì)原排則合販成一戶段咐RN袋A濕片斷門,其雞中童UT醬P清上標(biāo)絞記地扛高辛謀,這貫標(biāo)記震上的祝RN怠A穿片斷牌即為陷探針吹。當(dāng)今目的森基因頃表達(dá)話時(shí),翻mR毅NA餃能和豪反義等探針強(qiáng)特異姨性結(jié)江合,咐在底歌物的數(shù)作用早下顯倘色。日而正厲義探刊針為掌負(fù)對(duì)香照。矮由于殿R悶NA襯原位橡雜交廳技術(shù)寄能夠肥精確奶確定槽基因布表達(dá)仇的時(shí)忘空分醋布,待而植槍物基碌因的另時(shí)空侍表達(dá)健研究腫是探航討植點(diǎn)物生炎長發(fā)危育機(jī)脹制的辯重要即手段趣,所潤以在趨以研婆究植究物發(fā)擇育機(jī)庸制為魂主的屠本實(shí)蒸驗(yàn)室方,原簡位雜姨交成如為一是項(xiàng)主元要的唇并十澆分關(guān)阻鍵的跳技術(shù)拴。泰目前勒植物富研究稍中,另原位舒雜交倒得到彈了越什來越療廣泛萬的應(yīng)誓用,忍主要哥有橋3種嘴方法朗:損一是根常規(guī)闊組織撞切片濱RN柔A籮原位閉雜交躍,廣戒泛適呆用于芽各種拾組織茶;備二是觸大量賄細(xì)胞洗的整連體R獸NA潑原位碑雜交蔑,耗已應(yīng)遺用于悔花粉誕管和辨藻類去合子你;三泊是微符量細(xì)聽胞的岡整體繳RN梯A原堤位雜丹交冬,用膀于分桂離胚殼囊。飄我所商使用問的整盈體原聾位雜戚交技藏術(shù),糕是一振種較壤新的遲組織塊RN聾A柔原位間雜交監(jiān)方法籍。該干方法鋼的實(shí)脈驗(yàn)材淺料是家具有撒完整限形態(tài)椅結(jié)構(gòu)當(dāng)?shù)闹不匚锲髻|(zhì)官或愚其組壯合,炮如花覺、花摩序等民。該弦技術(shù)奸能夠份直接景從整寬體結(jié)嫌構(gòu)上缸觀察顯到基蜻因表旺達(dá)的劣空間瓦特征齊,具頁有易龍操作競、周芽期短脆等特省點(diǎn),既并避莖免了的一般歉在切奔片上具原位忠雜交賊所需映的三胡維重適構(gòu)步非驟。酷材料灶和方擠法雨實(shí)驗(yàn)蛋材料召騎植物漲材料徹野生巨型擬妖南芥符種子浪(仿Co爐lu街mb占ia錦)沒Pl奧fy哄::歪GU瞧S稀轉(zhuǎn)基系因擬互南芥泉種子睛(由旦De走tl渴ef哨W贈(zèng)ei搭ge側(cè)l起提供伙)芝野生蠅型煙現(xiàn)草種納子(堵Ni希co駝ti白an示a誕ta奪ba億cu拌n加va已r.毅W怎is跌co積ns劫in爪3牌8異)衰Pl哪fy毅::騎GU奇S刑轉(zhuǎn)基挪因煙滑草種女子(慈由本闖實(shí)驗(yàn)輛室畢誠業(yè)博乞士生蜓劉復(fù)騙權(quán)構(gòu)秤建、愈提供壺)楚宿菌種立和質(zhì)傍粒院大腸偷桿菌擾DH租5購ɑ緊質(zhì)粒囑:黃Pn增fl于::析GF殃P(guān)著猶(K薄an勉敞R那)描Pl猾fy鏟::敘an付ti薄LF筆Y(桃Ka幼n遼劣R潑)昏PD盆W1概24沈-L逗FY辰(噸Am太p魯R五寧)男以上惕質(zhì)粒氧均由勒本實(shí)投驗(yàn)室難已畢掌業(yè)博習(xí)士生緒劉復(fù)川權(quán)構(gòu)消建,婚本實(shí)駱驗(yàn)室父保存朋。職砌婆柴太站案分子會(huì)生物宋學(xué)和授生化目試劑擔(dān)各種夫限制括性內(nèi)叫切酶茄購自機(jī)Ta記Ka皇Ra謎比公司妹,坡PC冶R汽試劑浩購自肢鼎國凳生物乳公司姑,原粗位雜丈交地名高辛五標(biāo)記搞RN棕A貼探針小試劑萄盒及雞雜交小液(襲DI凡G印ea享sy密H堂yb綱)購儲(chǔ)自閘Ro室ch覆e運(yùn)生物蠢公司凍,各走種激析素和籌抗生丈素以屯及營x-混Gl葉uc押購自搞北京無經(jīng)科右生物鴿工程宿公司塞,其痕他試誼劑均立為國崖產(chǎn)分謀析純純。純P績CR頌引物提奶以輕GF勿P蜘基因照為模衛(wèi)板的召PC吧R紀(jì)引物腔由本嗚人設(shè)昂計(jì),晝上海盲生工籍生物枕工程肢公司望合成所。扶表弓勤初饅5葵’G甘FP散(鋸21沒bp環(huán)):三5’約-G才GT刑G辯AA依G搖GT下G怖AT襲G網(wǎng)CA跟A框CA鋤T嗚AC課-3桐’鞭嚴(yán)劉庸蜘3誼’G門FP攀(龜18闊bp遵):郵5’撕-G騙AA噸A吉GG敢G恭CA鋼G銅AT鴿T覆GT彎G魂TG顛-3瘋’繁蒙大1牙.5痰x拜-G滋lu禁c盒染色獨(dú)液押(1舅mL餅)辰頓恨際井N根、輕N—僵二甲洗基甲圾酰胺算座會(huì)怠詳敏5完0享uL死斤昌腎狐x-擊Gl破uc及慶俊醉盤眠閑糊躺攻烏鳴瀉0.何5m比g去殺然運(yùn)三汽弱侮霸攏左班10芹0m縫M叛磷虜酸緩?fù)藳_液耐米pH穗7.都0苗掌譯蔬98洗0u竄L居窯泳跳衫5m新M扎鐵稀氰化眨鉀傍竭夢(mèng)宴辦他根蓮肅10阿uL霉話濕語明5m貝M坦亞侮鐵氰敗化鉀蘭酒豈炕兵怪評(píng)飽10狼uL闖者口億它Tr知it韻on擔(dān)x遷-1肯00看腦披族蹦釣六罪誼癢紀(jì)1u羅L允雖胡玻1.侮6春植取物葉壘綠素油透明蜜液月盯急箱基乙說醇:乏乙酸蜻=9蠢:1義租1王.禽7袖培養(yǎng)徹基碎值屋出拌身1.衣7.狼1澤魯擬南封芥、糠煙草畢組織于培養(yǎng)碼基脹M式S哀(戶含3蝴%的趁蔗糖套和淺0.巡75插%必的瓊姐脂,怎調(diào)起pH絮=5閑.8嬌)巷愈傷器組織采誘導(dǎo)唯培養(yǎng)妄基(徐Ca僵ll騙us帖-I悶nd碎uc完in根g豆Me仆di砍um訴,促CI仔M責(zé))趣:鎖儲(chǔ)體B牧5叛+0楊.5似mg滴/L嚇請(qǐng)換2,故4-尺D粥+桃0.辣05勞mg更/L校K扣IN鄰塘豬(魯含熄2光%的百蔗糖態(tài)和散0.劣75脂%姻的瓊?cè)怪?,鈔調(diào)盯pH死=5塞.5林)赤生芽圣培養(yǎng)兆基(耗Sh茶oo策t-處In夠du教ci屈ng軌M買ed移iu在m,劉S盡IM嗓)巖:調(diào)律B臥5工+0士.1爛5m克g/桑L蔽IA赤A車+儀5m添g/警L2挪ip循器振(痰含篇2反%的濫蔗糖雹和誕0.轉(zhuǎn)75手%居的瓊搜脂,偉調(diào)造pH慢=5數(shù).5處)列陵炭標(biāo)皂雕1.登7.龜2類槐細(xì)菌辛培養(yǎng)鐵基艙L捏B鏈培養(yǎng)志基:減每升決培養(yǎng)廳基含黎5克板酵母梨提取雹物,規(guī)10任克蛋劇白胨享,1瞎0克五氯化指鈉,墨pH怠=7徒.5架,固笨體培艱養(yǎng)基塊含1奔%瓊肅脂敗1.漂8現(xiàn)原位腿雜交逢所需白試劑唐衰陷PB并S:夏0失.1權(quán)3M扒N鍛aC濁l,疑0劣.0艦07干M敵Na步2司HP銅O因4斷,0京.0窄03掘M曬Na壓H嫁2亂PO仰4獻(xiàn),房0.撕27構(gòu)mM男K稱Cl能,姜pH嚷7撫.4劈炊P五BT挎:煤PB糊S+載0.押1%缺T弓we蠢en殃2亂0瓦仇弊固定信液救(嶼FB迎):軌P井BT六+0舞.0撞8M規(guī)E會(huì)GT止A,暑5適%怖多聚沾甲醛頭,糟10娘%摔DM隨SO包(涉pH裂7哲.4修)鞋叔N饑TE適:晉50蛛0m洲M美Na糾Cl蚊,破10巖mM役T膛ri偏s-模HC史l滴(p譯H7姨.5振),題1機(jī)mM謹(jǐn)E常DT腳A濃悶鬼封阻鄭液住(站BS睛):溉P曬BT題+唐2%尿B固SA翁買饅滲入尺液尿(莫SB拔):代1黎00才mM勢N編aC旦l,炭5繳0m涌M告Mg扶Cl萬2董,黑10撫0m蟲M村Tr敘is廟-H乳Cl甩(勇pH誓9.睬5)訂,蘋0.億1%樓T欣we霧en蟻2把0澆須救停止安滲入糾液泡(釣SS城B)壩:幕PB由T+朋20貼mM痰E叉DT儀A聲之變主要技方法櫻2.雹1館質(zhì)粒罵載體膊構(gòu)建彼部分譜2.改1.揮1樂原賭質(zhì)粒惹的酶鴉切奇將潑Pl號(hào)fy筆::春an債ti華LF恒Y價(jià),吵Pn智fl偶::渣GF弟P公用筐Xb備aI插和簡Sa慕cI咳雙切疾,得含到掃Pl哲fy碎-載盒體和出GF婚P鏟片斷框。岔2.準(zhǔn)1.明2快該從凝液膠中擦分離鐵純化多DN禮A片遭段鍋(班1)證切塘下含仇有D鎮(zhèn)NA組片段禮的膠鞋塊,坑轉(zhuǎn)移陡到1莖.5有m真l透離心稍管中謎,德于7軋0決℃避溫育牌直至嚼膠完宋全融民化.留奮加覺1督ml死樹惱脂(田re昨si顫n)愛,正混油合2華0秒崖.桑(穩(wěn)2)問去削掉注姜射器駐上的卵推進(jìn)仇器,姜將M際in活ic浪ol幼u(yù)m恨n安我上。住(頸3)好將賺樹脂誕/D沖NA映混合啊液移堵入注描射管孫中,烈慢慢儉插入邪推進(jìn)箏器,朽輕輕煌將懸課浮液刃推進(jìn)猶Mi個(gè)ni細(xì)co躁lu釘mn芬中。寨(邊4)妥從捎Mi鍋ni紐co棄lu乎mn配去掉寸注射薪器,昌取出菠推進(jìn)臣器。喚再安臉注射兆管于醫(yī)Mi火ni陸co每lu慚mn躍上。碎加2謙m1寇的8舊0%挪異丙五醇于偽注射袋管中逆洗M投in睡ic兩ol呼um柜n。訊插入愚推進(jìn)鋸器,紋緩慢法將異既丙醇筐推過傳Mi室ni嘴co像lu冤mn冶。移(架5)槐去劉掉注它射器屠,將鈴Mi慢ni席co羨lu乞mn因放在蛛1.頭5m懷l離梯心管坊中,稍離心抗2分禿鐘,冬使樹化脂/弱DN睜A干誘燥。寬(腦6)創(chuàng)將咬Mi刪ni撒co殖lu漠mn捷移入害一個(gè)嘗新的押離心采管,削加5節(jié)0u導(dǎo)l水舍或T曬E,患放置智1分殊鐘,黨離心刪20撕秒,斑溶下舟DN敲A片都段。城(某7)泡仍型掉M臂in獅ic蘿ol刷um言n.今純化火的D勢NA養(yǎng)儲(chǔ)藏幸于4臺(tái)℃竄或-乖20渴℃明。晚2.惑1.侄3列輸連接醬在冰霞上建棚立如箏下連盟接體買系:公避聞2緒*T獵4中DN樓A膽連接踐酶服Bu臂ff兩er盡刪抬同祖零皂蛋事器兩漫剖握5u辛L尤蝦瞧Pl妹fy鋸-顏載體獄怨介糠抱捏關(guān)浙匆已卵寇棒鬼斑任構(gòu)著獨(dú)時(shí)癥1u窄L歲派滴GF濁P珍伍騙找沸植發(fā)否南萍胖合智鋤昂夫扛球管崗宗錫爪3u足L傲功纖T4驢D閱NA狠連接儲(chǔ)酶大跳決度批份潔誠丘井板濫查度西墓寇史固1u懇L甚輕輕炸混勻飾后,奉4鋸℃拾連接簽過夜府。掘排2.翻1.營4瓜滾大腸姨桿菌更DH臂5見ɑ蕉感受為態(tài)細(xì)島胞的案制備棟(1顆)鮮從腦LB性平板妄上挑敏取牛E.眉co薯li媽D婆H5亭ɑ志單菌扛落接藥種于上2m宅L晃LB寧液體嚷培養(yǎng)膚基中挪,3處7案℃霧振蕩偏培養(yǎng)伍過夜劍,取盾10聰0-快20階0u禁L吧菌液灑于叛2m賽L躍LB百中,龍37獅℃拋振蕩添培養(yǎng)蹤2-桐3小亡時(shí)后慨全部杠轉(zhuǎn)入厚10滴0促LB叮中,像37梳℃躍振蕩榮培養(yǎng)枯2-捏3小扣時(shí)至責(zé)對(duì)數(shù)輩生長說期揪(O梨D伏60蘋0剃=0書.4齒左右釀)慧。奮犬波(2節(jié))竭無庭菌條濁件下懂轉(zhuǎn)入貿(mào)1.渴5m評(píng)L藍(lán)Ep需pe當(dāng)nd幼o(hù)r右f踩,冰奏浴屋10雅mi萌n溫。疲(鵝3怪)偽貌4類℃殺4比00枯0r惱pm撓8戰(zhàn)mi橡n邀,回付收細(xì)巷胞。恥(4貍)鉤用咳40埋0u虛L連冰預(yù)鉤冷的始Ca狹Cl蓬2梳(新0.燒1M梁)美重懸敏沉淀難,置雨于冰蠻上版15寧-3乏0m修in趕。薄(5蠟)凱4埋℃敗4置00銜0r姨pm輪8殿mi超n萌,回像收細(xì)據(jù)胞。宗(6億)嘆用撲10必0u名L娘冰預(yù)儉冷的子Ca雞Cl柜2絡(luò)(腰0.菠1M凳)求重懸遲沉淀淡,備息用?;j設(shè)壯稀縫2.澇1.漫5掠轉(zhuǎn)迷化彼(1陶)泄10慣0u爸L險(xiǎn)感受場態(tài)細(xì)掘胞中漫加入扁1.員5u免L暴質(zhì)粒債,輕哀輕旋敘轉(zhuǎn),曲混勻溝內(nèi)容苗物,弓冰上界砍慌量朱柔伏置3攀0輸mi鄉(xiāng)n大。祝躺俗趨居飾用教汽府撤絞畝筐稱階悉火(2觀)紡42筑℃侵水浴法90偉s鄰,不肺要擺結(jié)動(dòng)試?yán)⒐堋婂N帖(3誦)恭快速盒將試封管轉(zhuǎn)惹移至饞冰上蜂,冷蓬卻裹2m克in記。屑評(píng)蔬(4廁)浙每管接加入近20也0u兩L然LB靈,3腳7怠℃省振蕩處45挎mi衛(wèi)n—咸1h舒r餅。皮升控(5及)榴涂板災(zāi)(K途an魄)稠。逢俊孩(6脖)拿至液秩體完州全吸魂收后鞭,倒蹈置平警板,島37辟℃憤培養(yǎng)糖。功緊更石2.慣1.獄6智競提質(zhì)日粒始饑殺用小盡量堿樣法提首取質(zhì)違粒:沃取1爭.5羽mL卵菌液體轉(zhuǎn)移攀至承Ep范pe慧nd誰or析f伍管,蛙于4夢(mèng)℃況,1元20稼00磁rp歪m液離心括30細(xì)”波。臺(tái)(2煌)跟吸去勇上清煎,空申氣干護(hù)燥沉于淀。炒沉淀早懸浮兩于1芽00饞ul靜溶液媽Ⅰ價(jià)中(盡25皂mM刻T低ri占s-刪HC尺l李pH棕8.描0,發(fā)1創(chuàng)0m彈M必ED初TA抄,燈50叼mM堆葡萄晶糖)閘中,殘振蕩擊混勻愧室溫殲放置漁5分片鐘。何(3攪)較假如還20腸0蜓ul持溶液籃Ⅱ調(diào)(0趁.2勞M察Na宜OH烈,當(dāng)1%禽SD課S塊),燭放冰蕩浴中剛5分石鐘。秒(4碑)讀再加造入1術(shù)50橋ul興溶液智Ⅲ司(歇3M嘉N庭aA保c,冒p農(nóng)H4篩.8賣),陸放冰疾浴中沙5-樂10剖分鐘曠,1英20衰00慕rp補(bǔ)m毯4村℃款離心征5分秋鐘。燕取上透清加趣等量尼酚:下氯仿傳,振優(yōu)蕩,昌4蒼℃棵,1止20撤00敢rp懸m豈2雕分鐘囑。常(5弦)本取上兩清加推2倍嗎體積支乙醇川,振赤蕩,混置2尿分鐘汗。倍(6屆)浮4盾℃桂,1荒20臺(tái)00是rp遭m宅2篩分鐘搬,吸做去上蜜清,掘?yàn)r干狐。莖(7嘆)痰加霞1m墻L帆70往%祥乙醇扎洗滌謠2次唯。撤(8星)喇用抄50碎ul足T扣E償溶解朵(加鈔入1挪ul你R暫na斤se廈)。屠從狗醒2.首1.哭7旺酶鏟切鑒華定及隙PC世R豐鑒定脂謝側(cè)所用張限制旗性內(nèi)英切酶印及大PC鼓R掩引物歇如前券2.品1.堤1腔及瞎1.葛4盯所述勢。牌獎(jiǎng)米2辨.2偵G餡US軌活性竄的組機(jī)織化線學(xué)定論位部芬分掙幣宋碼2.界2隙.1獵單組織輸培養(yǎng)俘(1店)瓜將植傅物長熄出兩奶周的醬主根艷切下焦成5綿-1過0年mm遲的小衫段,所轉(zhuǎn)移正至裙CI抄M枕中誘布導(dǎo)其石長愈表傷。絲(2摧)闖三周喝后,由將愈囑傷組柏織轉(zhuǎn)炭移至購SI蚊M繳中誘概導(dǎo)其昂長芽折。映(3河)販設(shè)未霉轉(zhuǎn)基向因植橋物作讓負(fù)對(duì)探照,羅對(duì)照辭和處給理之翻間的讀培養(yǎng)補(bǔ)條件航要完雄全一暢致。音(4紛)拆不論洲在擠CI辟M(fèi)莫中還擇是在古SI雨M稻中,數(shù)培養(yǎng)輔基要盯每1桿-2冒周續(xù)笨代一搞次,箏及時(shí)勻更新鞋。親(5醉)印注意仍大量房培養(yǎng)償,在繡由迷CI典M良轉(zhuǎn)移室至晌SI匆M躺的同火時(shí),享應(yīng)保責(zé)留一涼部分你材料樂作壓CI肆M鈴續(xù)代孩,以斥此作潔為婦SI也M路培養(yǎng)莊下的瓣處理直的另滴一種卷對(duì)照姓。碗(6購)信實(shí)驗(yàn)塊過程旺中特診別要您注意閥無菌跪操作燒!面鴉??谝?.關(guān)2.剩2挪G胃US咸活性雄檢測癢(1館)厘當(dāng)植羨物的片根在飛CI弊M率中培均養(yǎng)時(shí)哈,每茂隔2流-3柄天作欠一次召GU咽S喪組織非化學(xué)傍染色輛進(jìn)行悲跟蹤構(gòu)監(jiān)測附。嘴(2指)夏當(dāng)愈膛傷組蟲織在鏈SI茄M集中培吼養(yǎng)時(shí)馬,每愁隔一下周左蟻右作刃一次館檢測恢。等廁到長認(rèn)出再賤生芽交和再水生根帝時(shí),洽切下碗芽和歸根分錘別作港檢測慘。撒(3嘗)免未轉(zhuǎn)歉基因霧的對(duì)仁照必唉須和捆處理虧始終病同步照進(jìn)行繁。巾(4堵)軌設(shè)置島重復(fù)眾,至狀少3門-5礎(chǔ)次。挺(5縮)見具體惱方法濱:黑無菌家操作布,將性要檢減測的憲植物嶼部位菌小心辣切下揪來,憶轉(zhuǎn)入隙GU陳S倉染液誘,使仗材料凍和染奴液的盜體積廳比襯<1蔑:5螞。掛真空墻處理蠻2-鑒10席分鐘戶。婦放入裕37臭℃基恒溫乎箱中壘溫育菠12愧-1某6小丙時(shí)。奧待刮GU洪S陳滲入躁材料宿中后責(zé),材液料轉(zhuǎn)垂入透拋明液拆中透融明,膝放置爪于室搖溫下迅3小伏時(shí)。昨澇釣2.汪2.賴3兔觀察呢和照民像擔(dān)執(zhí)自柿經(jīng)透酒明處奉理后由的植愉物材筍料在抓Mo孝ti損c棗解剖努鏡下世觀察曠,有桑GU倆S先表達(dá)耍的部曬位顯流拼噸信現(xiàn)穩(wěn)黃定、盤不溶合于透膽明液釣的藍(lán)栽色。級(jí)解剖童鏡上睬接理杯光茶XR伶-X壺2卵00守0華相機(jī)派照相繭,堤膜嚇撿相片盼通過公Ac亡er魚S輛ca口nP鼓ri鋒sa課6炊40勁U鞭型掃饅描儀吊輸入乒電腦煉,由羽Ad裝ob找e占Ph況ot狂os買ho剛p驢6.獵0編黑喇睛作適跳當(dāng)處案理。憑2.懶3妙整體術(shù)原位牛雜交均2.波3能.1航今探針托標(biāo)記嗽歷烘原掛渣限制沃性內(nèi)寶切酶冰消化熱質(zhì)粒叔LF燦Y涉:恰an引ti判se敲ns堂e蛙B遷am夾H1稠Se螞ns猴e巖范岔K貞pn芒I因(1應(yīng))3掛7C糞嘩消化急2小遵時(shí),蠢電泳財(cái)檢查席線性槍化是琴否完潤全;惰(2挺)冷加等敘體積暮酚-源氯仿鼻,混期勻;積(3省)題12蟲00岡0轉(zhuǎn)革離心雷10共分鐘元,收四集上繁清,齒(4觀)與加2址倍體蛇積無換水乙插醇(躺預(yù)冷匙),神混勻瘡,-喝20休C,版30琴分鐘奴;脈(5玩)預(yù)12祥00今0轉(zhuǎn)見離心扁10搞分鐘房,棄季上清扯,單(6貪)全加7猴0%忠乙醇前(預(yù)垂冷)膏,棄退上清貧,扣(7智)征真空澤干燥功,沉思淀溶挽于1鎮(zhèn)0微廟升無處菌水揭中;津(8期)艇電泳處檢測袖。功體外稱轉(zhuǎn)錄傷(1勺)鈔每個(gè)咽反應(yīng)野體系做內(nèi)含東:絮模板間4微詢升,尤5*嶺緩沖諸液4挪微升隸,D踐TT肢2微乘升,沉RN梳A袖Bl儀oc隨k混1u糟L原,5出*N帶TP償肥4微很升,君Po我ly雕me勇ra潮se塑2王微升狂,D拴EP聰C-焦H2惰O脅3微軟升。月37炒C巨2小丟時(shí)。帶LF率Y跡:冬an敏ti哀se盾ns迫e帆T3匙Se趙ns健e激問T7炸(2悠)D昆na斑se脂I討曠于3管7C捉處理悔15犬分鐘眨以除丘去模痕板,遲每個(gè)齡體系漢加兄2鄰.5腹微升環(huán)的3議M祝Na處Ac槳和7家5微竹升的崗預(yù)冷則的無淡水乙腦醇,唉-2孔0C稍過酸夜,倒(錦3)褲4C護(hù)下塑離心梳15渾分鐘雁,1承30阻00塌轉(zhuǎn);痛(4添)雹70屯%預(yù)月冷的巾乙醇聲沉淀負(fù)一次薄,吹熱干后樣溶于假50燈微升單DE捎PC亭-t煤re摘at結(jié)ed承H注2O孩。要堿性蓮水解愈(1嘗)羅50牌微升嫂探針做加5壓0微奔升碳現(xiàn)酸緩棍沖液男,6餡0C設(shè)水掠解,侵LF伙Y4寫5泡分鐘唇,呀每管獄加1炎0微多升5匪%乙初酸,謙置冰根上;得(2久)酬每管會(huì)加1壤1微畏升的陶3M魔na底Ac鞋,2蚊00甘微升融預(yù)冷德無水普乙醇盒,-跨20么C程過夜負(fù);蟻(3耀)零4C擇下束離心狠15蝴分鐘臭,1尿20搬00者轉(zhuǎn);股(4譯)權(quán)70擴(kuò)%預(yù)銅冷的津乙醇茄沉淀爸一次測,吹挨干后經(jīng)溶于杰50蝕微升常甲酰級(jí)胺。櫻2.堵3.假2潤剝?cè)荒s交撈(1慚)腎固定預(yù)FB響槳襯仆杯炭菠漸執(zhí)厲頭高轎壞榨昏30獨(dú)mi拔n鄉(xiāng)甲醇趣霉肆前現(xiàn)2次同陵艷盡起勢創(chuàng)館缺5m關(guān)in能乙醇點(diǎn)今陳秘杯湖4械次娃小鳳鐵濱率創(chuàng)笑5興mi蜘n打(2畫)樣雜交墨預(yù)處珠理干乙醇棄漂紙刃勞母2次青恒蓋解斃敢蹤篇匹2衛(wèi)mi壟n蛇1:丟1鄰乙醇老:桐二甲駝苯蹈服壯丑肝褲丑嚴(yán)帖跪3插0自mi理n覽乙醇補(bǔ)色障蝶間族2乓次太龍倆豐啟瞞家泥初5濤mi漏n貪甲醇非雨蘆乓惜禮2次活鑼陡齒第濃貼發(fā)塞5喝mi涂n洋1:岡1疊甲俗醇遺:P就BT油迷尤寧掛滔吳提給戒扔蜻1永0m密in套PB核T+誘5%燈甲醛錄聞鐵賽胞三況顏篇邪添哭凳30鄙mi智n垃PB押T后錯(cuò)哲策勁拍3燙次蕉冷耳果施呀床準(zhǔn)縣2歐mi賣n暢PB扇T+麗40班ug安/m萄L青蛋白聚酶別K剖霜下建自膊滔德10喘-1黨5m世in鹿PB庫T+客0.渠2%閥伶甘氨蒼酸習(xí)宣撞晴餓池賣擇接溉5棵mi抗n高PB孕T騎弟頭篇信畜2億次息透小淋副癥邁肯市2電mi軟n梯PB駐T+動(dòng)5%迎甲現(xiàn)醛信汽粉撤紫消專息指計(jì)拿剃30獸mi柔n梢PB補(bǔ)T冒陡鉗慶旁始4激次勵(lì)乒近度塑滴傘習(xí)決曬2膠mi氏n說1:糾1枯PB獄T:繪HS囑與巧擊肆戴據(jù)燈劣銜邀袍扯仙1陷0m義in直HS窯攻設(shè)虎毅胖踏2岡次虧成羞船蛇擁旁抓膛姨段2隆mi它n薦預(yù)雜倉交牙刊甜枕僻畏御且頸雪害顧暮縫吊亦2刃hr長今均病帖榨肺6危0壺℃住(3伐)殊雜交劇40渣0u秧L塘HS遮+列3駐uL澇R雞NA蔽p化ro共be鼓+靠s拿al掀mo容n匯te與st擺s月DN兆A拘(1決00裁ug暑/m滔L)筑(探符針和布sa福lm酒on怎t腸es痕ts夸D虜NA狀預(yù)先謎85罪℃荒變性博5翅mi蘋n搏)倆16看-2匪0模hr蒸綠羨勝沙染口謹(jǐn)違密6銅0冷℃扶(4林)寶雜交閥后處盡理朝HS行拋牲急穩(wěn)供后李2桂次限畜遭吉茄僅攻玉逆霸30傅mi旅n勁臂泉掉5鑒5黑℃耽1:稈1楊HS睬:N羞TE盛改胖臨騰聾摔距術(shù)竄昨恩命悄斧6棟0m攀in歉NT隔E冷蒜挎渴沫曲突釋槐至揪久企撒織爪主湖6樂0m陡in塵NT桶E溜意僅綁序然汪群學(xué)沸豪轟疏筑徐想梯雨2鋸mi急n鑼NT娃E+恭40蓄ug座/m油L荒Rn進(jìn)as屈e偽A國拍振頃隆鞋桂秘館仗45依m(xù)i駛n剩補(bǔ)遷熟料3區(qū)7綁℃殲NT撿E叔悠測扁損啞技聞跳堂完堆拍怒慕內(nèi)度戰(zhàn)15塑mi欠n環(huán)抱委來撒3念7篩℃歐NT盒E協(xié)消胖芝愧摸屑5詞次拾艦壞僑惠瞇駱費(fèi)私笛15補(bǔ)mi抬n債1:翻1嶺NT敬E:喂PB旨T匪稍望嘴涉野閘稍畫談巨2堂0m乓in錫PB劫T亡成壁餅挑副違淺晚停喂聚帥吼矩2蔑mi慈n逮BS飄草袍線裝餃悅嚇斬見理漢骨野濤結(jié)至冤少膚30廉mi抖n菠(5仗)恢檢測桃an社ti良-D言IG挺抗體遲處理認(rèn)等量誼混合化固定桶后的妹和新使鮮材晃料+饅少量噸冰冷狠90得%丙搜酮,哈液氮院中磨確成細(xì)貝粉菜加入鑄更多堆90地%丙條酮,駱使勁削混合除均勻掘,4鮮℃氣儲(chǔ)存末過夜辰13征,0里00元g倉5窗mi擇n莫離心騙,棄鹿上清并。在武少量紫90催%丙窄酮中量重懸困沉淀畜,將疫沉淀講分散澤于一側(cè)濾紙矛上,物風(fēng)干窗在3晶0營mg崇干粉鹿中加乖入4版00成uL豈B卷S傭和2錄0郊uL冰a麗nt稻i-芽DI筒G蛾Fa懲b歌fr失ag昂me療nt劫,室耗溫黑互暗中鐵24幟hr桂10月,0達(dá)00旋離心擴(kuò)3調(diào)mi敢n目信號(hào)鐘檢測遞BS諸1仔00俱uL息中加弊入1妙uL重e盟中上蛙清,陳4將℃夫過夜勒新鮮涂BS摧代卡謀剛傷呀絡(luò)校蝕童請(qǐng)求卻嘆贊10懶mi晌n脾PB轉(zhuǎn)T禽欠騎此功討4莊次睜龍禾筒玉蜂身齒外漁60育mi攏n鴨SB昆稼鹿蛾辰她直2器次掛距洗屬陡礦鏟娃獸鮮5膽mi吼n禾1m懲L沸中加漂入8聞uL居R純oc余he訊公司厭的倘ni種tr爛o漂bl何ue涌t峽et愁ra話zo叮li勵(lì)um志c覆hl蒸or環(huán)id鋸e慎+碑5-擱br觀om返o-釣4-姨ch額lo狠ro濟(jì)-3費(fèi)-i喊nd昆ol答yl觸-p巧ho感sp妖ha丘te仁武積只5憶-6甘0m蒜in狡黑暗陜中顯門色折顯色棄完畢碑后用夏SS吐B鑒終止斤反應(yīng)競奉(6芹)彩觀察細(xì)和照唱像悅用甘期油裁:P相BS郊7剩:3啊餃溶液客封片度,在般OL鳳YM太PU貸S封顯微殘鏡下傍觀察忽并照趁像,處相片芳通過化Ac貨er傾S證ca島nP運(yùn)ri尋sa頁6雜40巷U貨型掃鳴描儀咽輸入柔電腦逃,由乎Ad存ob婆e予Ph垮ot損os言ho解p驢6.省0夜作適程當(dāng)處痛理。術(shù)實(shí)驗(yàn)嚴(yán)結(jié)果械擬南冰芥中扣LF晌Y戀啟動(dòng)勝子活貞動(dòng)特散點(diǎn)的非驗(yàn)證跨環(huán)歐白攝書農(nóng)榴教授登等早畫年曾呆利用羽Pl爪fy催::急GU謠S眠轉(zhuǎn)基維因擬期南芥緊為材躍料,蟲系統(tǒng)師檢測化過在亭植物住發(fā)育兆早期紗的于SA饅M歇中和殿以根數(shù)為外鑄植體蝴的植桑株再秘生過誠程中太Pl露fy爸的活鴨動(dòng)特強(qiáng)點(diǎn)。溉我首路先重放復(fù)了翅該實(shí)候驗(yàn),頌以便膏熟悉懼各個(gè)純步驟蕩和操允作,功同時(shí)爹也進(jìn)青一步昆驗(yàn)證良該實(shí)刺驗(yàn)的態(tài)可重更復(fù)性亭。吸瓶泡實(shí)驗(yàn)抽方法第如幫2.尋2誓中所朝述,擇結(jié)果蒼見圖駝1所指示。胃早在盾幼苗尾長出資的第增二天禽,柄GU只S田活動(dòng)派就在賓SA械M績中表本現(xiàn)出伙來(插圖1集-近A塊)??枚谟|莖的襲其他夢(mèng)部位灣、成錘熟的坡葉片草和根坦中,敲沒有奧Pl駝fy誤的活血?jiǎng)樱ㄗD1冤-病B粒)。硬為了幅避免凡SA逢M樂中已柳存在僻的敘GU奶S豐活性奶干擾場,本袋實(shí)驗(yàn)恐以無鍛GU胡S盟活動(dòng)且的根構(gòu)為外鋒植體蘋進(jìn)行末植株斤再生始。當(dāng)賣將根僵移入翠CI蛾M歷中誘苦導(dǎo)愈檔傷時(shí)源,第輔二天股就在辦成熟瘦根外躲周區(qū)帳域有側(cè)細(xì)胞斤分裂戀的地懂方發(fā)勤現(xiàn)了牛微弱熄的壤GU非S挖表達(dá)志(圖軍1-派D堅(jiān))。往且隨翁著愈想傷的絮生長竟,源GU簽S豎活性侵逐漸緊提高映(圖劈1-引E氏至圖考1-去J云)。拌本實(shí)后驗(yàn)的總結(jié)果勻再次燕驗(yàn)證拼了在遍擬南標(biāo)芥中正,餡Pl散fy流在早漠期即洋定位閉表達(dá)半于述SA瀉M姓中,尖且在蛇根外盟植體隔再生撒過程棒中有亭Pl宿fy仗的活凳動(dòng)。疫因?yàn)猷l(xiāng)植株線再生疲過程瞧中涉甩及到菊SA虎M鋪的重妙組,晴我們換由以釘上兩蜓點(diǎn)推宿測死Pl碗fy擔(dān)的表廳達(dá)與唉SA盼M蘋的形右成與莫活動(dòng)牢直接談相關(guān)建,但鵲這個(gè)錯(cuò)假設(shè)搞尚需言進(jìn)一堅(jiān)步的衫實(shí)驗(yàn)患結(jié)果碎驗(yàn)證哪。通蔽過本閥實(shí)驗(yàn)扮,我絕熟練逼掌握逝了植談物組響織培川養(yǎng)、經(jīng)GU征S初組織懸化學(xué)饞染色病解剖掌觀察攀和照膽相等海各項(xiàng)脹實(shí)驗(yàn)律技能奮,為華進(jìn)一級(jí)步的涌工作思打下僚了基星礎(chǔ)。算LF殿Y論啟動(dòng)另子在喂煙草刪中與餅在擬煉南芥程中有文相同帆的活涉動(dòng)特掉點(diǎn)忌似鄭旨上尺為了姨驗(yàn)證劈Pl世fy耳在擬良南芥昌中的振上述猾表達(dá)縱特點(diǎn)拒是否洗具有鬼普遍竭性,杠我又例利用州Pl眉fy榆::何GU好S因轉(zhuǎn)基三因煙挺草為貞材料博,用撒與擬阿南芥寺同樣丘的方致法分奸析準(zhǔn)Pl進(jìn)fy棍在早斷期始SA砌M斤和根層外植降體植帳株再峰生過省程中等的活唉動(dòng)特閱點(diǎn)。洋實(shí)驗(yàn)攀結(jié)果牽如圖忽2所繩示。鴨與擬鵝南芥址相似遍的是社,轉(zhuǎn)刻基因測煙草眾的早烈期椅SA番M線(圖棒2-木A成、2同-省B報(bào))和愧再生恐芽原玩基(砌圖2世-學(xué)C糠、2社-褲D娛、2演-恰E嘆)以翠及再瘡生芽欣分生把組織揉區(qū)域果(圖亂2-顏F坐、仆2-明G、綠2-竿H)誰中都頓有明越顯的潤GU療S株表達(dá)滅,但申轉(zhuǎn)基泡因煙撇草也邁具有猾自己橋的特振點(diǎn),犯即在住莖尖祥中所都檢測前到的暢GU庫S看染色五水平誦與同域時(shí)期誠的擬猛南芥祖相比努偏低郵,而鋼且用榮現(xiàn)有沉的方涂法,戴未能生檢測綁到早狹期愈員傷中殃的糧GU購S駐活動(dòng)扁。酒撐陡伴弟瞧這個(gè)半實(shí)驗(yàn)啦證明編,狹LF戶Y床基因選在植春物幼全苗文SA相M豎和葉稈原基磚、芽暗原基唇中的萌表達(dá)奮特云點(diǎn)是塑具有魚普遍杜性的漫。而淹煙草晴早期氣愈傷罪中未憐能如本擬南層芥那形樣檢爪測到蔽GU雅S戀反應(yīng)勤活宅性哀,估垂計(jì)可富能因褲為術(shù)Pl拿fy奔在煙覺草中太活動(dòng)鋸強(qiáng)度肢太低磚,但叫該推迅測尚仙需進(jìn)掙一步盼的實(shí)厲驗(yàn)驗(yàn)旁證。數(shù)RN指A光水平互上的旦LF須Y額表達(dá)歷特征夜與它GU醒S叮檢測蒜結(jié)果知相同啞考慮付到現(xiàn)榮有的近文獻(xiàn)睜中所快述現(xiàn)邁象,壺啟動(dòng)孤子的晉研究幣不能院完全橫反映鐵基因驗(yàn)的真爬實(shí)表貫達(dá)情夏況(敬詳見獄引言愧部分岸),者要想騙清楚煉地研因究其仗功能沃,我陳們必評(píng)須直祥接檢抖測該粒基因求的轉(zhuǎn)板錄產(chǎn)念物。男所以銷我試右圖用接RN染A哭水平滾整體們?cè)恢{雜交鼻的方囑法,仆在擬梯南芥獎(jiǎng)不同尋發(fā)育錢階段埋SA旬M傭中和稍根外顯植體輔植株術(shù)再生惹過程籃中對(duì)通LF衣Y披基因劇的轉(zhuǎn)毀錄產(chǎn)罵物進(jìn)碧行直燭接檢僑測和意定位脆。如收果些LF授Y務(wù)基因危確實(shí)量在陡RN曉A舞水平正上存箭在與哪啟動(dòng)臭子相枕同的必表達(dá)護(hù)特點(diǎn)早,則霞表明嬸啟動(dòng)尖子分貫析結(jié)腸果是毛可靠投和有雀意義平的,簡從而夜進(jìn)一逆步驗(yàn)稠證了訓(xùn)我們悅關(guān)于于LF傲Y撒基因描功能店的假法說。遇否則極,則謠表明劍過去倉啟動(dòng)弓子分意析的鍵結(jié)果卷未能柔反應(yīng)棄實(shí)際個(gè)基因晴表達(dá)彈的狀日況。協(xié)詳細(xì)瓦流程當(dāng)如實(shí)左驗(yàn)方型法中輔所述滑。首糞先,蝦要想凳取得醋好的涉原位渾雜交桌結(jié)果匠,先知需要網(wǎng)一個(gè)位高質(zhì)賤量的匹探針搏。我傘用呆Ba清mH漁I采和格Kp廉nI護(hù)雙切采pD臺(tái)W1筑24簽-L稅FY月質(zhì)粒丟,切邁出浸LF妥Y全基因洋,檢澇測了始該質(zhì)目粒的稀正確催性。材然后底用身Ba拴mH遺I同和領(lǐng)Kp零nI另分別次從兩湯端單判切,象使質(zhì)野粒線碌性化委。結(jié)嘩果如嫁圖1元.1斑所示舉。轉(zhuǎn)博錄后警結(jié)果放見稍1.橡2瀉,水?dāng)_解后漠結(jié)果漏見1非.3細(xì)所示廳。踐體渡世師緞程稈坑定車摘避卵繭圖叉1擱:探盾針制萬備電域泳圖劍譜備1.謹(jǐn)1:旬蒙質(zhì)粒極酶切迎圖譜澤La仆ne棵1藍(lán):藥DL抹20聲00僑D疤N(yùn)A識(shí)M荷ar咐ke收r芹漢L怨an樓e猛2:鳴L教FY未/B邀am盤HI根+K襪pn針I(yè)爹,小趁片段擱即為必切出欄的孝LF均Y徒基因削戰(zhàn)譽(yù)La管ne駁3闊:獄LF攤Y/勾Kp懼nI蠢,已理線性義化完佳全栽駛鄉(xiāng)La擇ne比4拋:必LF鋸Y/狹Ba據(jù)mH棕I款,已曲線性盜化完村全捉兇恭La長ne技5緊:陵LF撕Y稠質(zhì)粒隊(duì)對(duì)照不2:澤門轉(zhuǎn)錄頸后電渠泳圖喝譜(悅未經(jīng)截Dn零as筑e于處理哪)勢La懸ne多1此:尺LF合Y/桑Kp飼nI噴跳(緞T7劑轉(zhuǎn)錄桂酶)掙岔殺La壟ne毒2咬:陸LF塌Y/飄Ba禁mH誤I掀(獲T3珠轉(zhuǎn)錄捷酶)幅鍋踐La綱ne穿3郊:哥Co伙nt疾ro墓l降縣凱箭頭兔所示幻為轉(zhuǎn)恭錄出背的蠻RN輝A平條帶缺3:巡稼水解紹后電兵泳圖低譜迅La長ne醒1遼:拼DL閉20稀00睜D翁N(yùn)A扔M油ar筍ke搞r掏優(yōu)La魄ne釘2佳:歉LF鍬Y/綁Kp邁nI昨氏父La原ne翁3傳:使LF突Y/閣Ba劑mH與I注夕La嗽ne要4曲:答Co師nt廉ro豎l怨贏績箭頭允所示渾為水尼解后第的弊R(shí)N尖A技小片脈段奇遺水抄雜交錯(cuò)結(jié)果掠見圖村版3老。櫻A-料D雷顯示凍的是撓擬南墳芥發(fā)寸育過贊程中遍的敞LF亂Y姨基因梳表達(dá)晃狀況摧。7觀天大黨小、彼14涂天大堆小的魯擬南橋芥幼忠苗以慧及花春序中軋,腐LF嚇Y掙基因奮的表課達(dá)定蔽位于藥莖端贏分生服組織險(xiǎn)和葉幸原基綿、花濁芽原騰基中括,而紀(jì)在莖懂的其嘉他部例分、饒花梗崇、成弓熟的慧葉片響中,驕檢測誦不到曉LF掘Y遼的表或達(dá)信如號(hào)。羨伙萬同樣混以無奴LF溝Y懶活動(dòng)助的根斃為外棟植體旱進(jìn)行就植株趴再生以,現(xiàn)瘡已檢遼測到行在受CI促M(fèi)潛中培帶養(yǎng)4虛天的皺根外銅植體北細(xì)胞優(yōu)分裂槳旺盛鏟的部師位中臨的追LF歇Y悔表達(dá)溪信號(hào)災(zāi)(圖廈4-涼E圾、圖偽4-年F辰)。頸后續(xù)舍的檢貧測工孩作正姐在進(jìn)舊一步席進(jìn)行電。韻趴廈值得英注意餓的是甜,用腐原位榨雜交眼和用券GU畏S怠組織巴化學(xué)歲染色胡檢測眠的結(jié)懇果顯香示,察LF式Y(jié)睬的活覽動(dòng)和啄LF蘋Y兇啟動(dòng)妻子的獵活動(dòng)滿確實(shí)愚是一今一對(duì)餓應(yīng)的道(至弦少現(xiàn)杏有的含結(jié)果炸說明踩了這辜一點(diǎn)涂),鄰這初納步證繼明了慣過去慨取得齒的釀Pl虧fy乖活動(dòng)涌結(jié)果頑具有銅一定上的可不靠性苗。疾Pl婚fy菠::袖GF使P異載體嫌的構(gòu)柴建萍例揚(yáng)在踩Pl塞fy鍋::社GU倚S蒙擬南緒芥根塑外植抬體植凍株再免生過喉程中箱,愈紡傷組戲織中脆可發(fā)鋤現(xiàn)明匠顯的侄GU鋒S裝活動(dòng)相,至佛于有羽GU殊S酷活動(dòng)涂的部驅(qū)位是做否會(huì)虹出芽忘,目孟前還隊(duì)不得繡而知鍋,因難為組纏織化左學(xué)染帖色將袍殺死輔細(xì)胞覆,失埋去繼騰續(xù)培油養(yǎng)、亦跟蹤嫩觀察墓的可酒能。眾也就夫是說雕在莖幼端分織生組賭織形斑成之獲前,籠我們物觀察辯到了前LF研Y微的活溪?jiǎng)?;兆在莖理端分辯生組塞織形肌成之搏后,踐我們善又觀召察到牲了步LF臟Y抖基因?qū)业奶馗璁惐砑_(dá)。滿但是充莖端喜分生錢組織爬的這繭團(tuán)細(xì)漢胞是仁否來框自莖雕端分爛生組啄織形溜成前畏有伍LF蜜Y臭活動(dòng)晴的細(xì)商胞,拉目前畢還沒竄有直什接的隸證據(jù)聯(lián)。針券對(duì)這艱一問護(hù)題,盼我打肢算構(gòu)添建民Pl屆fy岔::枯GF掏P炕載體狡并將梅其轉(zhuǎn)殿入擬丈南芥吉,從漁而能壞在熒系光下哲跟蹤桿檢測客Pl梨fy鏟的活子動(dòng)。艘如果踢Pl臥fy杜活動(dòng)果部位碎和出各芽部絲位確平有一易致性記,則傷為我披們的安假設(shè)鎖提供冶了一厭個(gè)有馬力的睡證據(jù)浮。查砍秘目前希手頭稍上已汪具有船Pl波fy晶::腦an店ti萌LF恨Y孕和注Pn磚fl駕::前GF巨P魚質(zhì)粒匪,在碗an館ti址LF煙Y巧和扮GF漂P禮兩側(cè)勤均有沖Xb住aI持和堵Sa奏cI輔的酶俗切位呼點(diǎn),享我用譯這兩尾種限賞制性誘內(nèi)切御酶將嗎這兩萬種質(zhì)朱粒切每開,笛從瓊重脂糖映凝膠冷上準(zhǔn)近確切芹下載窮體-解Pl似fy發(fā)片斷爹和馳GF株P(guān)云片斷約,再碼將二茶者進(jìn)冠行連檢接。早塞冊(cè)首先晚,我巴用酶近切的哥方法脈和角PC墊R都的方移法檢倚測了酷Pl午fy易::弊an終ti蛋LF協(xié)Y緞和翻Pn策fl幫::饑GF期P福兩個(gè)買質(zhì)粒煩的正縱確性后。對(duì)精于輔Pl彼fy桂::油an闊ti等LF頁Y塑,烈Pl務(wù)fy冶是構(gòu)棄建新鳳載體扔需要飯的片烈段,壺an蓄ti挨LF歐Y液卻是棕要用嚼酶正脖確切紡下以穩(wěn)便置疫換的設(shè)片段華,所決以圖缺3.嬌1臉,航3.森2解分別獄對(duì)透Pl扮fy侮和敬an律ti榴LF粥Y售進(jìn)行場了檢巖測,候切出潮的扒Pl貪fy兵1感Kb醬左右駱,哪an角ti令LF天Y兇1.紡4K摔b券左右勉,均撒和預(yù)才期相淚符。怕而對(duì)職于呆Pn家fl箱::幼GF拴P來,純GF岔P肝既是舒新載枝體需顛要片焰段,讓又是耕要用蘿酶切姻下的柔,而頁P(yáng)n長fl嘗并沒死有什危么作恐用,析所以翠只用刃檢測等GF污P對(duì)就夠憲了,要這里林用了荒酶切卡和腦PC軋R等兩種屈方法區(qū),切蚊出的瞎GF泳P希75曉0b采p亂左右豪,址PC梳R雙條帶扁50碗0b情p至左右拐,和牢預(yù)期牛相符疑。分碗別如坐圖墻3.報(bào)3捧,付3.竭4昆所示四。由升圖可董見,脹這兩債個(gè)質(zhì)汁粒均土是可確用的秤。猴張熱連接纏后,端對(duì)重唱組載來體進(jìn)竊行篩視選。捷圖各3.枝5妄顯示慎酶切布鑒定弦Pl賞fy儉的結(jié)聰果,僑切出乖的片佩段大圈?。ü?K忠b饒左右看)與罩預(yù)期為相符添,而炊且通還過和旅Pl紹fy躍::抱an勵(lì)ti挪LF軍Y寶酶切叉后的挎結(jié)果綁并排凍跑電捆泳,椅更充月分證隱明了厲切出蘆的小欄片段挪確實(shí)犯是來搖自于雖Pl洗fy拿::答an明ti耳LF揚(yáng)Y何的繳Pl邀fy囑。同婆理,幼圖克3.容6曲,涂3.帳7撞通過分與杠Pn登fl靜::述GF變P符并排效作酶筆切、邪跑電手泳,您證明岸了切霞出的騎小片朗段是委來自省于騰Pn輛fl軌::磚GF吹P沉的背GF筆P毅。儉Pl掘fy側(cè)::技GF希P衣質(zhì)粒鵝構(gòu)建央成功倚。派妥論多第父藍(lán)擾今純別黑嗚筑流菌殃畜丙闖艷攀刷瀉圖3工:質(zhì)巷粒恥Pl辜fy資::獅GF抱P停的構(gòu)未建是圖束3.糾1:次嘉檢測益Pl衰fy鑼::聽an北ti胡LF仙Y仿(P拆lf晝y)烘La統(tǒng)ne范1各:眼λ打DN隙A/切Ec集oR粗I+限Hi稠nd升II筑I螺DN趴A住Ma訴rk屢er脾走鄉(xiāng)La饒ne檢2菠:點(diǎn)Pl錯(cuò)fy陜::吉an移ti我LF證Y床p都la縱sm牌id帥拒公La卵ne普3旁:抗Pl辜fy滔::逼an腿ti侵LF促Y/似Ec紹oR份I+世Xb收aI腔囑所La泥ne腫4寄:或Pl絹fy能::氣an音ti披LF懇Y/裹Ec責(zé)oR骨I+站Xh梯oI柱蔽開La升ne雕5新:討Pl葉fy抖::墳an匯ti喇LF窯Y/聯(lián)Ec倦oR蕉I+敘Kp航nI陸偷碧La逃ne宇6肆:排Pl如fy娘::巾an碎ti皮LF盤Y/哨Ps箱tI忙+X漫ba蘿I吃苦L桃an掀e再7:社P但lf總y:炸:a昂nt還iL陣FY林/P津st父I+毛Xh丘oI啊愁劑La峰ne企8刮:耕Pl恥fy麗::貨an罵ti惜LF留Y/竹Ps覆tI融+K踢pn鋼I陡諸L備an勢e晴9:譽(yù)D掌L2王00烏0綠DN針A里Ma吳rk頓er蕉圖惕3.始2:小姓檢測她Pl希fy級(jí)::瓜an居ti倦LF厲Y介(偶an障ti期LF酸Y聽)象La隱ne過1氏:輕λ三DN洲A/濕Ec賺oR幸I+礙Hi協(xié)nd杠II目I也DN管A劉Ma認(rèn)rk朵er漆訓(xùn)逮La諸ne士2劉:料Pl慈fy柄::南an僑ti府LF可Y界質(zhì)粒壩濫嚷La碼ne香辭3:身肺Pl箱fy弊::香an梢ti培LF帖Y/收Xb銜aI批+S鉛ac包I遠(yuǎn)療L緩an脆e敢4:哄P憲lf齒y:身:a蜻nt量iL屢FY街/X繪ho堡I+顧Sa畝cI蓋畢廚La乒ne舍5赤:踩Pl念fy建::映an售ti嚷LF價(jià)Y/往Kp吩nI墳+S攻ac逢I評(píng)毯L亦an商e咳6:冷P片lf閱y:哭:a釀nt妖iL蔽FY爺/X沾ba鳴I+固Ba立mH砌I羨規(guī)L窩an都e悔7:鋤P秋lf踏y:番:a備nt縫iL叛FY犁/X豈ho痕I+猛Ba塊mH題I座窩L啊an債e顯8:護(hù)P雅lf筍y:許:a慕nt細(xì)iL穿FY魚/K古pn謹(jǐn)I+艘Ba侍mH蔬I幟瘡L琴an答e耽9:失D塑L2餃00碎0變DN染A貸Ma羨rk暈er塌圖血3.闊3萍:檢膽測笛Pn尿fl役::隆GF李P晨(死GF喘P戀)葛La銀ne廊1效:縫DL失20凝00婚D修NA旬M息ar彎ke落r驚合L縮an虜e日2:奪P顯nf犬l:殿:G睡FP權(quán)/X交ba慈I+磁Sa倍cI帶古紀(jì)La妻ne繳3御:糖Pn定fl武::就GF仔P挪質(zhì)粒列圖蜻3.循4欣:檢洲測單Pn壟fl列::森GF戀P豪(南GF遞P疊)暑La窄ne懶1躁:性以無餃菌水竿為模儀板的書PC濾R湊產(chǎn)物妄(負(fù)碰對(duì)照誦)耐凱血La騙ne期2曬:臭正對(duì)撿照虎圍磨La迫ne沫3牙:份以悠Pn閃fl描::臘GF扛P朽為模優(yōu)板的店P(guān)C恨R贏產(chǎn)物曾站菜La捎ne互4盤:背DL什20勞00困D和NA映M引ar驢ke徑r憑圖軌3.戶5:幣世新構(gòu)壤建的堵Pl界fy缸::案GF魯P赤酶切形鑒定敢(檢影測狼Pl賀fy衛(wèi))旗La戲ne靠1而:牛Pl重fy汽::糊an饅ti遇LF委Y嘗質(zhì)粒份耳麥La防ne村2晨:悔新構(gòu)舅建的脆Pl怎fy望::謀GF浪P琴質(zhì)粒冠撲蜂La擺ne悄3半:茫Pl睛fy射::燭an含ti謹(jǐn)LF吃Y/勺Ps侵tI曬+X禾ba獨(dú)I喜繁L膛an笨e典4:聞P舊lf浪y:車:G襖FP榮/P柔st瑞I+芳Xb氣aI燈很殖La蠶ne叉5雞:此Pl樹fy芝::窩GF班P/假Ps縱tI咐+B著am駛HI號(hào)氏翅La壁ne夢(mèng)6鞋:氏Pl搖fy墊::盟an摩ti里L(fēng)F境Y/露Ec砌oR壩I+燥Xb抄aI盆聾辣La掩ne列7饑:窯Pl堆fy慕::琴GF走P/遵Ec飄oR臭I+島Xb柏aI蕩開正La均ne釘8菊:纖Pl船fy吵::傳GF沿P/新Ec劣oR仍I+峰Ba辜mH黃I住澡L僻an腰e染9:術(shù)D浪L2羽00聰0站DN帳A蓮Ma營rk巨er屑圖拴3.肯6:笑劈新構(gòu)桌建的援Pl己fy范::媽GF肌P牢酶切畜鑒定殼(檢嚼測僚GF他P惡)俱La艇ne蜘1化:更Pn坑fl稍::映GF考P獄質(zhì)粒麻即灰La導(dǎo)ne出2睛:持Pn婚fl遙::歪GF殊P/當(dāng)Xb懇aI躁+S莖ac藝I果邪L稻an暴e暮3:姻P個(gè)lf啦y:館:G晴FP分/X怒ba渾I+暑Sa帝cI腳勿落La嘉ne蜘4蒸:湊Pl糕fy唱::便GF趙

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 人人文庫網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
  • 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評(píng)論

0/150

提交評(píng)論