第五章基因組序列注釋

基因組測序相關(guān)技術(shù)發(fā)展

198119861989199119941998200020022003200620072008Inthecomingfuture200920102005AffylaunchesGeneExpressionmicroarraysRiseofGenbankdatabasesfromDNAsequencingABIcommercializesfirstautomatedDNAsequencerLowhangingfruit:cysticfibrosismutationidentified3700DNAAnalyzerinHumanGenomeProject;DNAsequencinggoesindustrialFirstmicroarraypublication-onArabidopsisILMNlaunchesgeneexpressionarraysHumanGenomeProject&CeleraGenomicscompletesfirstdraftgenomeHapmapprojectlaunchedHapmap1stphasedatareleaseAffy&ILMNbothlaunched100KgenotypingarraysRiseofGenomeWideAssociationStudies(GWAS)RocheGSFLXlaunchedILMNboughtSolexa;launchesGAABISOLiD1.0Launched!TheSequencingShakeup!!SOLiD3.0:100GBoutofthebox!The3rdGenerationSequencingwillbelaunchedILMNHiSeq2000launched本文檔共89頁；當前第1頁；編輯于星期六\11點22分<2weeks~$1,0000.010.101.0010.00100.001,000.0010,000.00100,000.00$MThroughput

(Gb)CostofperHumanGenomeInnovationofNGSthroughput3Gb6Gb20-30Gb0204060801001202402007200820092010199020012012200720100.001Moore’sLaw更低的價格使得基于測序的科研和臨床應用越來越被接受13years~$3,000,000,000200Gb-300Gb測序技術(shù)的發(fā)展帶來測序價格的下降本文檔共89頁；當前第2頁；編輯于星期六\11點22分Illumina/Solexa/GIIxGeneticAnalyzer50~95GB/runIllumina/Solexa/HiSeq200GB/runRoche/454GenomeSequencerFLX500Mb/runAppliedBiosystemsSOLiD4100GB/runAppliedBiosystemsSOLiD/HQ300GB/run成熟的二代測序技術(shù)平臺本文檔共89頁；當前第3頁；編輯于星期六\11點22分高通量測序服務未知基因組測序(Denovogenomesequencing)基因組重測序(Wholegenomeresequencing)實驗數(shù)據(jù)分析MatePair測序構(gòu)建Scaffold30X的覆蓋率

(454&(SolexaorSOLiD))序列預處理（質(zhì)量控制）基因組拼接（基于reference拼接）注釋(基因功能、代謝通路、比較基因組)SNP發(fā)現(xiàn)及注釋實驗數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率

(SolexaorSOLiD)序列預處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析本文檔共89頁；當前第4頁；編輯于星期六\11點22分高通量測序服務外顯子捕獲測序(Targetexomecapture)全基因組甲基化測序(DNAmethylationsequencing)實驗數(shù)據(jù)分析>30X的覆蓋率

(SolexaorSOLiD)序列預處理（質(zhì)量控制）基因組分型技術(shù)SNP、Indel、CNV、染色體結(jié)構(gòu)變異及注釋與表型相關(guān)的全基因組關(guān)聯(lián)分析和功能連鎖性分析實驗數(shù)據(jù)分析30X以上的覆蓋率(SolexaorSOLiD)序列預處理（質(zhì)量控制）甲基化位點檢測及注釋本文檔共89頁；當前第5頁；編輯于星期六\11點22分高通量測序服務轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seqsequencing)microRNA測序(microRNAsequencing)實驗數(shù)據(jù)分析mRNA打斷、反轉(zhuǎn)錄、加接頭Denovo454構(gòu)建轉(zhuǎn)錄圖譜Referencebarcode建庫Solexa，SOLiD序列預處理（質(zhì)量控制）表達豐度統(tǒng)計注釋(功能、代謝通路、表達差異比較)未知轉(zhuǎn)錄本的分析實驗數(shù)據(jù)分析microRNA提取、兩頭加接頭、反轉(zhuǎn)錄、建庫(SolexaorSOLiD)序列預處理（質(zhì)量控制）已知microRNA豐度統(tǒng)計未知microRNA預測及豐度統(tǒng)計本文檔共89頁；當前第6頁；編輯于星期六\11點22分高通量測序服務元基因組測序(meta-genomesequencing)未知病毒檢測(Unknownvirusdetecting)實驗數(shù)據(jù)分析DNA提取、建庫序列預處理（質(zhì)量控制）拼接、注釋(功能、代謝通路)豐度統(tǒng)計、比較元基因組實驗數(shù)據(jù)分析低量RNA、DNA處理、建庫與宿主、微生物、病毒數(shù)據(jù)庫比較未知病毒的發(fā)現(xiàn)及預測本文檔共89頁；當前第7頁；編輯于星期六\11點22分學習重點：1)基因注釋的方法2)基因功能的研究方法本文檔共89頁；當前第8頁；編輯于星期六\11點22分基因組序列所包含的全部遺傳信息是什么？基因組作為一個整體如何行使其功能？用什么方法尋找基因？用什么方法研究基因的功能?計算機分析+實驗本文檔共89頁；當前第9頁；編輯于星期六\11點22分真核生物基因組的注釋蛋白質(zhì)編碼基因的注釋RNA基因的注釋重復序列的注釋假基因的注釋本文檔共89頁；當前第10頁；編輯于星期六\11點22分基因組注釋SequenceGENESCANORFFinderGENEMARKGenePrediction…BlastnFastaHomologySearchTranscriptionRegulatoryRegionDomainIdentify(HMMER,BLIMPS)Transmembrane(TMAP,TMHMM)LocalizationSites(Psort)Physical&ChemicalPara(PI/MW,EXTCOEF)Post-translationalmodifications(NetNGlyc…)ProteinAnnotation…GeneOntologyPathwayPredictedGeneOrGene本文檔共89頁；當前第11頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第12頁；編輯于星期六\11點22分3.1尋找基因基因組序列查找基因。有兩種常見的方法：計算機分析尋找與基因有關(guān)的序列。通過對DNA序列進行實驗分析，看其能否表達基因產(chǎn)物。

本文檔共89頁；當前第13頁；編輯于星期六\11點22分3.1.1根據(jù)基因結(jié)構(gòu)特征搜尋基因基因不是核苷酸的隨機排列而是具有明顯特征：基因的編碼區(qū)是可讀框?？赡艿牧NORF本文檔共89頁；當前第14頁；編輯于星期六\11點22分1.根據(jù)開放讀碼框預測基因a.起始密碼子ATG：第一個ATG的確定則依據(jù)Kozak規(guī)則：Kozak規(guī)則是基于已知數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果，所謂Kozak規(guī)則，即第一個ATG側(cè)翼序列的堿基分布所滿足的統(tǒng)計規(guī)律。本文檔共89頁；當前第15頁；編輯于星期六\11點22分若將第一個ATG中的堿基A，T，G分別標為1，2，3位，則Kozak規(guī)則可描述如下：(1)第4位的偏好堿基為G；(2)ATG的5’端約15bp范圍的側(cè)翼序列內(nèi)不含堿基T；(3)在-3，-6和-9位置，G是偏好堿基；(4)除-3，-6和-9位，在整個側(cè)翼序列區(qū)，C是偏好堿基。本文檔共89頁；當前第16頁；編輯于星期六\11點22分b.終止密碼子

終止密碼子:TAA,TAG,TGAGC%=50%終止密碼子每64bp出現(xiàn)一次；GC%>50%終止密碼子每100－200bp出現(xiàn)一次；由于多數(shù)基因ORF均多于50個密碼子，因此最可能的選擇應該是ORF不少于100個密碼子。本文檔共89頁；當前第17頁；編輯于星期六\11點22分細菌基因組的ORF閱讀相對比較簡單，錯誤的概率較少，但單純的ORF掃描對高等真核生物DNA效果不佳。內(nèi)含子使ORF掃描復雜化本文檔共89頁；當前第18頁；編輯于星期六\11點22分內(nèi)含子的出現(xiàn)給計算機判讀基因帶來不少問題，對ORF掃描的基本程序的編寫要考慮以下幾個問題：1）密碼子偏倚；2）外顯子—內(nèi)含子邊界；3）上游調(diào)控序列。本文檔共89頁；當前第19頁；編輯于星期六\11點22分1）密碼子偏愛性編碼同一氨基酸的不同密碼子稱為同義密碼，其差別僅在密碼子的第3位堿基不同。不同種屬間使用同義密碼的頻率有很大差異，如人類基因中，丙氨酸（Ale）密碼子多為GCA，GCC或GCT，而GCG很少使用。特定種屬有特征性的密碼子偏愛，這些序列在編碼區(qū)常常出現(xiàn)，非編碼區(qū)只保持平均的堿基分布水平。本文檔共89頁；當前第20頁；編輯于星期六\11點22分上游外顯子-內(nèi)含子邊界的共有序列在真正基因中發(fā)現(xiàn)的真實序列之間的關(guān)系。2）外顯子－內(nèi)含子邊界外顯子和內(nèi)含子的邊界有一些明顯的特征如：內(nèi)含子的5‘端或稱供體位（donorsite）常見的順序為5’-AG↓GTTAAGT-3’；3’端又稱受體位（acceptorsite),多為5‘PyPyPyPyPyPyCAG-3’(“Py”嘧啶核苷酸，T或C)；本文檔共89頁；當前第21頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第22頁；編輯于星期六\11點22分3）上游控制順序幾乎所有基因（或操縱子）上游都有調(diào)控序列，它們可與DNA結(jié)合蛋白作用，控制基因表達。另外個別生物的基因組特有組成也可作為判別依據(jù)，如脊椎動物基因組許多基因的上游都有CpG島。大多數(shù)CpG島都位于管家基因和大部分組織專一性表達基因的5’側(cè)翼區(qū)以及基因的第一個外顯子區(qū)。

本文檔共89頁；當前第23頁；編輯于星期六\11點22分

3.1.2同源基因查詢通過已存入數(shù)據(jù)庫中的基因序列與待查的基因組序列進行比較，從中查找可與之匹配的堿基序列及其比例，用于界定基因的方法稱為同源查詢。本文檔共89頁；當前第24頁；編輯于星期六\11點22分同源有如下幾種情況：A.DNA序列某些片段完全相同；B.開放讀碼框排列類似，如有等長外顯子；C.開放讀碼框翻譯成的氨基酸序列的相同；D.模擬多肽高級結(jié)構(gòu)相似。本文檔共89頁；當前第25頁；編輯于星期六\11點22分當在氨基酸水平進行比較時，兩個序列之間缺少同源性就更明顯。本文檔共89頁；當前第26頁；編輯于星期六\11點22分

同源性,一致性和相似性1）同源性(homology)基因系指起源于同一祖先但序列已經(jīng)發(fā)生變異的基因成員。分布在不同物種間的同源基因又稱直向同源基因。同一物種的同源基因則稱共生同源基因（水平基因）,水平基因由重復后趨異產(chǎn)生?；蛲葱灾挥小笆恰焙汀胺恰钡膮^(qū)別,無所謂百分比.本文檔共89頁；當前第27頁；編輯于星期六\11點22分2)一致性(identity)：指同源DNA順序的同一堿基位置的相同的堿基成員,或者蛋白質(zhì)的同一氨基酸位置的相同的氨基酸成員,可用百分比表示.3)相似性(similarity)：指同源蛋白質(zhì)的氨基酸序列中一致性氨基酸和可取代氨基酸所占的比例?？扇〈被嵯抵妇哂邢嗤再|(zhì)如極性氨基酸或非極性氨基酸的成員,它們之間的代換不影響蛋白質(zhì)(或酶)的生物學功能。本文檔共89頁；當前第28頁；編輯于星期六\11點22分相似性與一致性249MFN-MAIPFGAGAYAQALNQQQAALMASVAQGG232ILTSLTLPFSAGAYAQALNQQQTTV

IS--TS

GS注:紅色為一致性氨基酸,藍色為可取代氨基酸,白色為趨異氨基酸.一致性氨基酸百分比為紅色氨基酸所占的比例,相似性氨基酸百分比為紅色和藍色氨基酸相加所占的比例.本文檔共89頁；當前第29頁；編輯于星期六\11點22分基因注釋軟件1)目前基因注釋程序的編寫主要依據(jù)兩種信息內(nèi)涵:

1.signalterms(信號指令),如起始密碼,終止密碼,終止信號,剪接受體位與供體位序列,多聚嘧啶順序,分支點等保守的順序組成;2.contentterms(內(nèi)容指令),如密碼子使用偏好.對結(jié)構(gòu)緊湊的小基因組上述注釋軟件效果不錯,但對大基因組特別是超長基因的注釋有很大困難.在一個長度數(shù)十或數(shù)百kb的內(nèi)含子中,存在許多可能誤判的信號指令.2)常用的注釋軟件如GenScan主要偏重于內(nèi)容指令,而FgeneSH則著重于信號指令.由于每種生物都有種屬專一性的密碼子偏好,也存在某些非保守的信號指令,因此在超長基因注釋中常出現(xiàn)正向錯誤(false-positive,多注釋)或負向錯誤(false-negetive,少注釋).

引自:Naturereviewsgenetics,4:741-749,2003.本文檔共89頁；當前第30頁；編輯于星期六\11點22分不同注釋軟件之間的效率Performanceofthreepopulargenepredictionprogramson42semiartificialgenomicsequencescontaining178knownhumangenesequences(900exons).Sensitivityispercentageofexonsthatarepredictedcorrectly.Selectivityispercentageofpredictedexonsthatarecorrect.ReproducedwithchangesfromYadaetal.,2002ColdSpringHarborGenomeSequencingandBiologyMeeting,May7-11,2002.FGENESHisbyfarthemostaccurateofthreeprograms.效率與準確率比較------------------------------------------------------------------------------------------programsensitivityspecificitymissedexon(%)wrongexon(%)------------------------------------------------------------------------------------------FGENESH77.165.79.623.2GenScan66.544.912.040.9HMMGene69.536.615.555.5------------------------------------------------------------------------------------------

本文檔共89頁；當前第31頁；編輯于星期六\11點22分人類基因注釋標準Knowngene:與人類已知cDNA和蛋白質(zhì)順序同源的基因.Novelgene:與脊椎動物cDNA或其它物種蛋白質(zhì)同源的基因.Noveltranscripts:與novel基因相似,但缺少明確的ORF.Putativegene:有同源EST支持,但缺少cDNA或ORF.Predictedgene:數(shù)據(jù)庫中至少有一個外顯子支持,但缺少cDNA或明確的ORF.Pseudogene(假基因):與已知蛋白質(zhì)有50%的同源性,但cDNA殘缺,在其它位點存在正常的同源基因的順序.引自:Nature414:865-871,2001(人類22號染色體注釋)本文檔共89頁；當前第32頁；編輯于星期六\11點22分人類基因總數(shù)可能是永遠解不開的迷?1.人類基因總數(shù)的預測有三種方法:cDNA和ESTs順序,計算機注釋,比較基因組學(保守的ORF).2.已報道的人類基因總數(shù)的版本:1)Celara:27894HGR:29304(Esemble)(2000)

Celara與HGR的注釋基因有7000個不同,相同的為20000左右,加上不同的注釋約34000個.2)Esemble注釋:24847(2003年)EnsemblisajointprojectbetweenEMBL-EBIandtheSangerInstitutetodevelopasoftwaresystemwhichproducesandmaintainsautomaticannotationoneukaryoticgenomes.3)EBI:27462(2003,nature423:576)4)Genscan:

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許多人傾向于不可能知道人類基因組精確的基因數(shù).本文檔共89頁；當前第33頁；編輯于星期六\11點22分幾種模式生物注釋的基因總數(shù)大腸桿菌(E.coli):4800酵母(yeast):6200線蟲(nematode):19000果蠅(fly):13600擬南芥(Arabidopsis):25000水稻(rice):60000玉米(maize):59000老鼠(mouse):30000本文檔共89頁；當前第34頁；編輯于星期六\11點22分功能域注釋1)任何基因編碼的蛋白質(zhì)都由一些在高級結(jié)構(gòu)水平具有特征性的功能域組成,如引導肽,受體區(qū),激酶區(qū),DNA或RNA結(jié)合域等。2)功能域具有很強的保守性,關(guān)鍵的氨基酸組成及其排列位置是相當衡定的,是鑒定功能域的主要標識。3)功能域是目前確定基因功能的主要依據(jù)之一.4)已由許多專門的功能域注釋軟件,可用于基因組序列的注釋。本文檔共89頁；當前第35頁；編輯于星期六\11點22分什么是功能域(domain)?定義:1)Regionofaproteinwithadistincttertiarystructure(e.g,globularorrodlike)andcharacterristicactivity;homolgousdomainsmayoccurindifferentprotein.(引自“MolecularCellBiology”)2)Acontinuouspartoftheaminoacidsequenceofaproteinthatcanbeequatedwithaparticularfuction.(引自“GeneVII”)3)Portionofaproteinthathasatertiarystructureofitsown.Inlargerproteinseachdomainisconnectedtootherdomainbyshortflexibleregionsofpolypeptide.(引自“MolecularBiologyofTheCell”)本文檔共89頁；當前第36頁；編輯于星期六\11點22分同源功能域注釋本文檔共89頁；當前第37頁；編輯于星期六\11點22分3.1.3實驗確認基因1.Northern雜交確定DNA片段是表達序列：Northern雜交本文檔共89頁；當前第38頁；編輯于星期六\11點22分注意事項：a.當某一基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行可變剪接時，由于連接的外顯子不同，會產(chǎn)生好幾條長度不一的雜交帶，如果該基因是某一基因家族的成員也會出現(xiàn)多個信息；b.考慮組織專一性和發(fā)育階段的問題；c.基因表達產(chǎn)物豐度的問題如果豐度較低，用擬Northern雜交和動物雜交（Zoo-blotting）分析。

本文檔共89頁；當前第39頁；編輯于星期六\11點22分擬Northern雜交——

根據(jù)已知的DNA序列設計引物，從mRNA群體中擴增基因產(chǎn)物，再以DNA為探針與之雜交。

動物園雜交——

根據(jù)親緣關(guān)系相似的物種，其基因的編碼區(qū)相似性較高，而非編碼區(qū)的同源性很低的原理。如果某一物種的DNA序列與來自另一親緣物種的DNA片段雜交產(chǎn)生陽性信號，該區(qū)段可能含有1個或多個基因，這種方法又稱為動物園雜交。本文檔共89頁；當前第40頁；編輯于星期六\11點22分動物園雜交（Zooblotting)本文檔共89頁；當前第41頁；編輯于星期六\11點22分2.由EST或cDNA指認基因目前在數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)測序的物種的EST和cDNA序列的數(shù)量正在呈指數(shù)增長。EST和cDNA是基因轉(zhuǎn)錄加工后的產(chǎn)物，可以確切無疑的代表相應基因成員的存在。

尋找目的序列的EST證據(jù)本文檔共89頁；當前第42頁；編輯于星期六\11點22分cDNA：CDS：ORF：EST：本文檔共89頁；當前第43頁；編輯于星期六\11點22分3.獲取基因全長cDNA序列A.構(gòu)建cDNA文庫，用目的基因DNA片段篩選文庫。B.根據(jù)已知片段設計引物，RACE技術(shù)得到基因的全長cDNA序列。

本文檔共89頁；當前第44頁；編輯于星期六\11點22分4.確定DNA順序中基因的位置A.通過對全長cDNA序列的測序、對比，以及與基因組DNA的比較，確定基因所在的區(qū)域；B.通過物種已建立遺傳圖和物理圖來確定基因的位置；本文檔共89頁；當前第45頁；編輯于星期六\11點22分3.2基因功能預測確認DNA序列中的基因序列后，下一個問題就是探索它的功能，這是基因組研究的重點所在，也是一個難點。信息分析+實驗生物學本文檔共89頁；當前第46頁；編輯于星期六\11點22分影響途徑？影響器官？基因類型？底物？細胞內(nèi)分布？空間結(jié)構(gòu)？基因功能的含義本文檔共89頁；當前第47頁；編輯于星期六\11點22分基因水平轉(zhuǎn)錄水平蛋白水平本文檔共89頁；當前第48頁；編輯于星期六\11點22分基因功能研究方法：生物信息學方法本文檔共89頁；當前第49頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第50頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第51頁；編輯于星期六\11點22分3.2.1計算機預測基因功能原理：主要依據(jù)同源性比較，同源性反應出進化關(guān)系。方法：既存數(shù)據(jù)庫的比較分析。

分析的基礎是:如果一個新測序的基因與另一個原來已測序的基因相似，那么就揭示他們可能有進化上的關(guān)系，并且新基因的功能很可能與已知基因的功能相同，或至少是相似。本文檔共89頁；當前第52頁；編輯于星期六\11點22分3.2.2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域在功能預測中的意義同一物種或不同物種中具有相同結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)可將其劃歸在同一蛋白質(zhì)家族。本文檔共89頁；當前第53頁；編輯于星期六\11點22分蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能分析本文檔共89頁；當前第54頁；編輯于星期六\11點22分果蠅甲蟲蜜蜂本文檔共89頁；當前第55頁；編輯于星期六\11點22分基因功能研究方法：實驗方法本文檔共89頁；當前第56頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第57頁；編輯于星期六\11點22分無論研究什么生物現(xiàn)象，都需要做一件事：改變基因1）Lossfunction：降低基因或刪除基因Givefunction:提高基因的表達3.3基因功能的檢測本文檔共89頁；當前第58頁；編輯于星期六\11點22分3.1.3基因失活是基因功能分析的主要手段使特定基因失活的最簡單方法是用一段無關(guān)DNA片段將其破壞。兩個DNA分子具有相似序列，重組能引起分子片段進行互換。本文檔共89頁；當前第59頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第60頁；編輯于星期六\11點22分本文檔共89頁；當前第61頁；編輯于星期六\11點22分美英三科學家因干細胞研究的貢獻獲諾貝爾醫(yī)學獎馬利歐·卡佩奇埃文斯奧利弗·史密斯本文檔共89頁；當前第62頁；編輯于星期六\11點22分3.2.3

基因

過表

達用

于功

能檢

測本文檔共89頁；當前第63頁；編輯于星期六\11點22分劃時代的基因靶向操作技術(shù)：

CRISPR/Cas9

經(jīng)典基因操作：Genetrap:化學誘變；同源重組：一般物種幾率低,10-6；EScell10-2突破性的發(fā)現(xiàn)：RNAi-Knockdown;不完全敲除，臨時性充滿夢想?yún)s幻滅的ZFN：難以完全找到匹配的3連子鋅指；Off-target嚴重

美國加州大學DaveSegal教授說：“Withzincfingers,wehavetolettheDNAtelluswherewetarget”完美基因靶向操作：識別特異DNA序列+操作DNA的酶本文檔共89頁；當前第64頁；編輯于星期六\11點22分細菌和古細菌一種不斷進化適應的免疫防御機制。CRISPR/Cas9利用一段小RNA來識別并進行有效的靶向DNA剪切。CRISPR/Cas9SystemClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列.SorekR.etal.NatRevMicrobiol.2008，6(3):181-186本文檔共89頁；當前第65頁；編輯于星期六\11點22分CRISPR/Cas9作用機理BarrangouR.NatureBiotech.2012:30,836–838PAM：protospaceradjacentmotifs前間區(qū)序列鄰近基序，2–4nt；

TypeIITypeITypeIIICas9+sgRNACRISPR/Cas9RGN本文檔共89頁；當前第66頁；編輯于星期六\11點22分CRISPR/Cas9應用本文檔共89頁；當前第67頁；編輯于星期六\11點22分3.4高通量基因功能的研究方法

同源重組并不是唯一的打斷基因的方法。另一種方法是用轉(zhuǎn)座子標記技術(shù)，通過向基因中插入轉(zhuǎn)座元件或轉(zhuǎn)座子使其失活。人工誘導轉(zhuǎn)座本文檔共89頁；當前第68頁；編輯于星期六\11點22分3.4.1突變庫構(gòu)建1)利用天然的DNA轉(zhuǎn)座子構(gòu)建表達載體，轉(zhuǎn)化受體細胞,當轉(zhuǎn)座子活化時可被動轉(zhuǎn)座并隨機插入受體細胞基因組引起基因突變.2)觀測突變再生植株的表型變化,分離與克隆插入突變基因的結(jié)構(gòu)與功能.本文檔共89頁；當前第69頁；編輯于星期六\11點22分植物DNA轉(zhuǎn)座子本文檔共89頁；當前第70頁；編輯于星期六\11點22分突變庫表達載體本文檔共89頁；當前第71頁；編輯于星期六\11點22分突變庫表達載體元件的功能1)

Ac-載體:轉(zhuǎn)座酶表達載體,由于缺少兩側(cè)反向重復邊界順序,不能主動轉(zhuǎn)座.2)DsE-載體:捕獲增強子表達載體.。兩側(cè)含轉(zhuǎn)座子Ac-Ds的邊界順序,在轉(zhuǎn)座酶作用下可被動轉(zhuǎn)座,插入到啟動子下游.本文檔共89頁；當前第72頁；編輯于星期六\11點22分轉(zhuǎn)座子標記技術(shù)很難瞄準單個基因，因為轉(zhuǎn)座是一種隨機事件，它更適用于整體研究基因組的功能，通過檢查感興趣表型變化的后代來鑒定出具有相似功能的各類基因。本文檔共89頁；當前第73頁；編輯于星期六\11點22分

RNAi與基因功能檢測RNAi是一種完全不同的基因失活方法，它并不打斷基因本身，而是破壞其mRNA。本文檔共89頁；當前第74頁；編輯于星期六\11點22分如何發(fā)現(xiàn)RNAiRNA干擾現(xiàn)象最初發(fā)現(xiàn)于1995年，Cornell大學的研究人員Guo和Kemphues研究阻斷秀麗新隱桿線蟲中的par-1基因時，利用反義RNA(AntisenseRNA)技術(shù)特異性地阻斷par-1基因的表達，同時在對照實驗注射正義RNA（SenseRNA）以期觀察到基因表達的增強。但結(jié)果是二者都同樣地切斷了par-1基因的表達途徑,這與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋相矛盾，但他們沒能給出合理解釋。直到1998年2月，安德魯AndrewFire和克雷格CraigMello首次揭開謎底，并把這種現(xiàn)象首次命名。他們證實，Guo等遇到的正義RNA抑制基因表達的現(xiàn)象，以及過去有關(guān)反義RNA對基因表達的阻斷都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA(DoubleRNA,dsRNA)而引起。他們將體外轉(zhuǎn)錄得到的單鏈RNA純化后注射線蟲，發(fā)現(xiàn)基因抑制效應十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反，能夠高效特異性阻斷相應基因的表達。本文檔共89頁；當前第75頁；編輯于星期六\11點22分線蟲RNAi實驗

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