流式細(xì)胞儀分選專業(yè)知識課件

臨床應(yīng)用疾病診斷:為疾病診斷提供直接的或支持診斷的依據(jù)免疫調(diào)節(jié)：細(xì)胞因子/受體的相互作用共刺激分子受體/配體的相互作用

發(fā)病機(jī)理：腫瘤的發(fā)病與機(jī)體的免疫力低下、以及信號傳遞障礙有關(guān)藥物/疫苗效果的評價：腫瘤生物治療的時機(jī)選擇、以及效果的監(jiān)測免疫狀態(tài)評價：移植、放化療等.細(xì)胞周期分析:在細(xì)胞周期(G0，G1，S，G2，M)的各個時期，DNA的含量隨各時相呈現(xiàn)出周期性的變化。通過核酸染料標(biāo)記DNA，并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，可以得到細(xì)胞各個時期的分布狀態(tài)，計算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解細(xì)胞的周期分布及細(xì)胞的增殖活性。也可利用細(xì)胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，對細(xì)胞周期進(jìn)行精確的分期：G0、G1、S、G2、M.DNA含量及細(xì)胞周期分析G2MG0G1s0

200

400

600

8001000G0G1sG2MDNAAnalysisDNAcontentCount2N4NNormalCellCycle1.腫瘤的早期診斷。2.腫瘤的良惡性判斷。3.觀察細(xì)胞的增殖狀態(tài)及周期分布。4.療效監(jiān)測細(xì)胞功能分析

1.吞噬功能試驗

2.氧爆發(fā)試驗3.根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同將CD4+或CD8+分為介導(dǎo)細(xì)胞免疫的I型細(xì)胞和介導(dǎo)體液免疫的II型細(xì)胞.4.藥物泵的功能檢測

5.NK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性檢測6.血小板的粘附,聚集功能檢測樹突狀細(xì)胞分析（DendriticCells,DC)DC是主要的抗原遞呈細(xì)胞，同時又是重要的先天免疫細(xì)胞，還是具有免疫調(diào)控功能的一個細(xì)胞群，沒有發(fā)現(xiàn)特異性的抗原標(biāo)記DC研究的主要內(nèi)容包括直接分析計數(shù)、體外誘導(dǎo)檢測,一般分為兩群－PDC,MDC當(dāng)前DC檢測的方法：1）Lin-,CD11c,CD123,同時可能表達(dá)CD80,CD86,CD83,DR等2）利用BDCA1,2,3,4對外周血或其它組織DC進(jìn)行分析3）CD14+16/CD85/CD33,CD14+16/CD85/CD123T細(xì)胞分析相對計數(shù)－淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量檢查項目和意義疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫病降低增高降低降低AIDS降低嚴(yán)重降低增高降低SARS降低降低降低降低降低慢性活動性肝炎、肝硬化降低正常或增高降低降低腫瘤降低降低增高降低降低CD4細(xì)胞絕對計數(shù)對AIDS病人的診斷、療效和預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義，一般認(rèn)為CUTOFF值為200/ul.絕對計數(shù)是加入濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)微球與標(biāo)本一起測定，流式細(xì)胞儀控制軟件在設(shè)置后能自動計算出濃度對任何細(xì)胞群體都可以進(jìn)行絕對計數(shù)Th1Th2細(xì)胞因子分泌細(xì)胞測定根據(jù)產(chǎn)生的細(xì)胞因子的類型和生物學(xué)功能,人的ＣＤ4+Ｔ細(xì)胞可以分為Ｔｈ1、Ｔｈ2Ｔｈ1細(xì)胞產(chǎn)生ＩＬ2、ＩＬ12、ＩＦＮγ、ＴＮＦβ等細(xì)胞因子,主要參與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、遲發(fā)性過敏反應(yīng),并在清除病毒等細(xì)胞內(nèi)致病因子方面起著重要作用Ｔｈ2細(xì)胞分泌ＩＬ4、ＩＬ5、ＩＬ6、ＩＬ10、ＩＬ13等細(xì)胞因子,主要促進(jìn)體液免疫反應(yīng),中和胞外病原體相應(yīng)地，CD8+T細(xì)胞也可以分為Tc1和Tc2Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理損傷。Th2細(xì)胞：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞的生長、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。Th1Th2檢測Tips一定要確定T細(xì)胞是否已經(jīng)活化，細(xì)胞轉(zhuǎn)運阻滯是否成功，胞膜打孔是否有效一定要用胞漿內(nèi)同型對照（特別是FITC標(biāo)記時），以便分別部分弱表達(dá)的細(xì)胞因子。TETRAMER抗原遞呈細(xì)胞（APC）攜帶抗原片段通過與TCR復(fù)合物結(jié)合，在APC和T細(xì)胞的MHC相容和其它共刺激分子的相互作用下激活T細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞免疫效應(yīng)。MHC-四聚體染色技術(shù)用于抗原特異性T細(xì)胞分析的原理在于體外模仿上述抗原遞呈的過程來實現(xiàn)對特異性T細(xì)胞的鑒定，通過流式細(xì)胞儀這種高通量分析儀器對標(biāo)本中這群細(xì)胞進(jìn)行分析

四聚體技術(shù)的優(yōu)勢是：可以對特異性免疫細(xì)胞進(jìn)行定量；用流式細(xì)胞儀檢測可以快速測定大量細(xì)胞，可以同時進(jìn)行其它表面染色，可以直接用外周血測定而不需要培養(yǎng)；四聚體染色不會殺傷細(xì)胞，因此染色后的細(xì)胞可以進(jìn)行分選或其它功能分析；四聚體對所有的特異性T細(xì)胞都能夠結(jié)合，而不僅僅是對有功能的細(xì)胞進(jìn)行檢測。不同廠家的MHC四聚體產(chǎn)品不太一樣：貝克曼庫爾特公司創(chuàng)造性地構(gòu)建和表達(dá)了MHC分子α3鏈的區(qū)域突變的蛋白（iTAg），能降低其與非特異性T細(xì)胞結(jié)合，大大提高了特異性。并且將MHC四聚體直接標(biāo)記熒光，和常用的抗原多肽負(fù)載后整體商品化，也有單獨的MHC分子（iTAg）單獨出售，極大方便了研究者CD4CD25Treg調(diào)控性T細(xì)胞的主要功能是抑制機(jī)體免疫功能，太強(qiáng)則免疫耐受，太弱會引起自身免疫反應(yīng)調(diào)控性T細(xì)胞調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞對抗原的遞呈調(diào)控性T細(xì)胞的表型是CD4+CD25bright，逐漸發(fā)現(xiàn)越來越多的其它分子可能能夠更精確限定（eg.FOX-1?)CD25也是免疫細(xì)胞晚期活化的標(biāo)記，但表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度不足夠強(qiáng)非特異性的先天免疫細(xì)胞δＴ細(xì)胞:占外周血T細(xì)胞的10％以下，非抗原依賴型免疫細(xì)胞，在傳染病、腫瘤病人外周血數(shù)量增加，表達(dá)CD3量較普通T細(xì)胞多NK細(xì)胞：占外周血淋巴細(xì)胞8－25％，傳染病和腫瘤病人數(shù)量偏低。NK細(xì)胞可以根據(jù)NKR的不同而分類，丙型肝炎的發(fā)生和預(yù)后可能與NK細(xì)胞的表型相關(guān)DC：分布與淋巴組織和外周血，為非成熟狀態(tài)，遇到相應(yīng)的抗原后主要分泌IFN-alpha來發(fā)揮左右其它重要分子的流式分析的意義粘附分子：物種間高度保守，與細(xì)胞間通訊，干細(xì)胞HOMING，腫瘤的發(fā)生可能有很重要的關(guān)系，如CD11C/CD18-CD54與DC成熟和遷移有關(guān)；CD209-CD102與抗原遞呈有關(guān)CD26:移植后造血干細(xì)胞表達(dá)可能不利于該細(xì)胞的homing，有證據(jù)表明抑制造血干細(xì)胞有利用移植成功流式細(xì)胞術(shù)在移植中的應(yīng)用移植配型和群體反應(yīng)性抗體的檢測熒光示蹤標(biāo)記的移植細(xì)胞：CFSE是一個確定的熒光標(biāo)記物，開發(fā)其它穩(wěn)定的熒光素應(yīng)該更有幫助流式細(xì)胞儀分選為達(dá)到最高的分選效率，實用中最好先用磁珠分選系統(tǒng)進(jìn)行初步分選活細(xì)胞分選非常有用流式細(xì)胞術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究的新方向細(xì)胞多態(tài)性分析：受體、抗原折疊、HLA等，包括CXCR4,CCR5,DC-SIGN(與AIDS易感性有關(guān)），NKR(中國科大研究領(lǐng)先項目）信號傳導(dǎo)（實際主要為胞漿內(nèi)磷酸化及去磷酸化蛋白的檢測）新型熒光特異性探針：胞內(nèi)病原體檢測、轉(zhuǎn)錄因子檢測、細(xì)胞器或細(xì)胞生命活動指標(biāo)的新熒光素的應(yīng)用利用分選的細(xì)胞進(jìn)行體內(nèi)和體外功能研究與其它定位性的熒光設(shè)備聯(lián)合使用（如MPE,CONFOCAL,IC100等）CellLabIC