遺傳學(xué) 7. 細(xì)菌遺傳（改后）

第7、8章細(xì)菌和病毒的遺傳

遺傳分析和基因定位

真核生物的基因定位1.Two-pointtestcross2.Threepointtestcross

Geneticmaporlinkagemap

著絲點(diǎn)作圖(centromeremapping)—脈孢霉第一節(jié)細(xì)菌的遺傳分析和基因定位

遺傳學(xué)：形態(tài)--細(xì)胞水平分子水平

細(xì)菌--研究材料采用了新的生物類型特點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、周期短、不進(jìn)行減數(shù)分裂，DNA裸露，易接受相同或不同物種DNA片段插入。1333um2x1um大腸桿菌的染色體結(jié)構(gòu)堿基對(duì)：4639229bp預(yù)測(cè)基因數(shù)4377個(gè)研究細(xì)菌遺傳的方法--平板培養(yǎng)Clone106

Plating一細(xì)菌的遺傳分析

一個(gè)細(xì)菌DNA與另一個(gè)細(xì)菌DNA的交換重組可以通過四種方式實(shí)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化、接合、性導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)1.細(xì)菌的轉(zhuǎn)化與基因定位1.1轉(zhuǎn)化（transformation）（1）transformation某些細(xì)菌(或其他生物)通過其細(xì)胞膜攝取周圍供體的染色體片段，并將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。Avery(1944)等研究證實(shí)，轉(zhuǎn)化因子是DNA

枯草桿菌大腸桿菌（2）轉(zhuǎn)化的過程（1%）供體DNA與受體細(xì)胞間的接觸與互作

轉(zhuǎn)化片段大小:肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化DNA片段至少要有

800bp，枯草桿菌最少需要16000bp

轉(zhuǎn)化片段形態(tài):轉(zhuǎn)化片段必須是雙鏈轉(zhuǎn)化片段濃度：每個(gè)細(xì)胞攝取的DNA分子數(shù)受體細(xì)胞生理狀態(tài):感受態(tài)(competence)細(xì)胞能接受外源DNA分子并被轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞

感受態(tài)因子：促進(jìn)轉(zhuǎn)化作用的酶或蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化DNA的攝取和整合

聯(lián)會(huì)

synapsis

整合

intergration結(jié)合與穿入

binding轉(zhuǎn)化子重組個(gè)體A202.avi轉(zhuǎn)化過程MechanismofnaturaltransformationFig.14.10BacterialtransformationFig17.5Abacterialgrowthcurve.?2003JohnWileyandSonsPublishers被轉(zhuǎn)化菌株（transformant）比例：

（1）隨外源DNA的濃度而升高，（2）與受體菌的生理狀態(tài)有關(guān)。Transformation轉(zhuǎn)化（transformation）是指受體菌直接吸收了來自供體菌的DNA片段，通過交換，整合到基因組中，從而獲得供體菌的部分遺傳性狀。供體菌與受體菌之間不需要直接接觸。FragmentsofdonorDNAentertherecipientandalteritsgenotypeNaturaltransformation（自然轉(zhuǎn)化）：Artificialtransformation（人工轉(zhuǎn)化）：

轉(zhuǎn)基因----遺傳轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium

tumefaciens）和發(fā)根農(nóng)桿菌（Agrobacterium

rhizogenes）。轉(zhuǎn)移DNA（transferredDNA，T-DNA）：T-DNA也叫三螺旋DNA，是指一種由三股ssDNA旋轉(zhuǎn)螺旋成的一種特殊結(jié)構(gòu)。農(nóng)桿菌Ti(tumorinducing)或Ri(rootinducing)質(zhì)粒中的一段DNA序列。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)：T-DNA在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)兩個(gè)基因緊密連鎖時(shí)，它們就有較多的機(jī)會(huì)包括在同一個(gè)DNA片段中，并同時(shí)整合到受體染色體中。如：

trp2+

his2+tyr1+×trp2

his2tyr1↓

重組型數(shù)Trp2-his2重組值=×100%

親型數(shù)+重組型數(shù)(3)轉(zhuǎn)化和基因重組作圖轉(zhuǎn)化結(jié)果3660trp2his2tyr1

∣←──34─→∣←───13──∣

∣←─────40──────→∣

Trp2-his2→0.34Trp2-tyr1→0.40His2-tyr1→0.13

2.細(xì)菌的接合與基因定位作圖2.1接合(conjugation)

–

菌株間雜交性別（1）接合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)1946年，Lederberg和Tatum實(shí)驗(yàn)E.coli

K12A菌株：甲硫氨酸met-、生物素bio-

鏈霉素敏感

B菌株：蘇氨酸t(yī)hr-、亮氨酸leu-

抗鏈霉素黎德伯格和塔特姆的接合(雜交)試驗(yàn)證明大腸桿菌發(fā)生遺傳重組原養(yǎng)型缺陷型缺陷型混合

發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)出了一些原養(yǎng)型的菌落轉(zhuǎn)化細(xì)胞與細(xì)胞直接接觸

發(fā)生的遺傳物質(zhì)交換和重組？

1950Davis設(shè)計(jì)了

U型管實(shí)驗(yàn)菌株間交配系統(tǒng)？在任何一臂內(nèi)都沒有出現(xiàn)原養(yǎng)型細(xì)菌,兩個(gè)菌株間的直接接觸—菌株間交配系統(tǒng)？Hayes（1952)試驗(yàn)證明，在接合過程中遺傳物質(zhì)的交換是一種單向的轉(zhuǎn)移：

供體donor

（雄性）→性別受體

receptor

（雌性）

接合：在原核生物中，是指遺傳物質(zhì)從供體“雄性”轉(zhuǎn)移到受體“雌性”的過程。conjugation供體--F因子（sectorfactororfertilityfactor）

94.5kb2%1--3

感染性

F纖毛蛋白4個(gè)ISDNA組成F–F+Hfr附加體Episomes

（附加體）：plasmidsthatcanintegrateintohostchromosomeFfactorReplicatesinsidehostcellFfactorcontainsgenesencodingsynthesisofpiliwhichallowcellcontact接合現(xiàn)象性傘毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+細(xì)胞的F因子由接合管向F-傳遞，使F–受體變成F+細(xì)胞質(zhì)橋F因子及其在雜交中的行為F因子及其在雜交中的行為Hfr

（highfrequecyrecombination）Hayes的實(shí)驗(yàn)得到證實(shí)----分離到一種供體菌株

F–

各種不同染色體基因

重組子高（1000）為什么兩個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的接和能實(shí)現(xiàn)染色體上基因重組A204.aviA205.avi外基因子(exogenote)受體細(xì)胞接受的部分供體染色體內(nèi)基因子(endogenote)受體完整染色體部分二倍體(部分合子\半合子)單數(shù)交換單數(shù)交換偶數(shù)交換F–F+HfrF’Partialdiploid性導(dǎo)(sexduction):利用F’因子將供體細(xì)胞基因?qū)胧荏w形成部分二倍體的過程.接合現(xiàn)象性傘毛—接合管Fpilus--conjugationtube

F+細(xì)胞的F因子由接合管向F-傳遞，使F–受體變成F+細(xì)胞質(zhì)橋中斷雜交(interruptedmating)1954年F.Jacob和E.Wollman等開始進(jìn)行對(duì)大腸桿菌染色體轉(zhuǎn)移的動(dòng)力學(xué)研究，他們發(fā)現(xiàn)在Hfr×F―的接合過程中，線性染色體DNA是以恒定的速率由供體向受體移動(dòng)，為繪制大腸桿菌的染色體圖提供了一個(gè)很有用的技術(shù)，即中斷雜交(interruptedmating)。Mutantselection中斷雜交試驗(yàn)及染色體連鎖圖

interruptedmatingexperiment

雅各布(Jacob，F(xiàn))和沃爾曼(Wollman，E.)在五十年代設(shè)計(jì)著名實(shí)驗(yàn)菌株基因型：Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR

Interruptedmatingexperiment

37營(yíng)養(yǎng)用來研究細(xì)菌接合過程中基因轉(zhuǎn)移方式的實(shí)驗(yàn)基本方法：1）接合中的細(xì)菌在不同時(shí)間取樣，并把樣品猛烈攪拌以分散接合中的細(xì)菌（中斷雜交）；2）排除供體菌（donor：Hfr）：接種到含有鏈霉素（Str）的培養(yǎng)基上，抑制Hfr生長(zhǎng)；同時(shí)：選擇標(biāo)記，最好是最早轉(zhuǎn)入受體的基因。實(shí)驗(yàn)材料：（蘇亮疊噬菌體T1乳糖半乳糖鏈霉素）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr3）排除未接合（未重組）的受體菌（recipient：F－）以某供體基因（如thr+）作為選擇標(biāo)記，接種到相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基（如缺乏threonine）上，抑制F－菌生長(zhǎng)4）影印到其它各種選擇性培養(yǎng)基上，測(cè)定選擇標(biāo)記基因進(jìn)入受體F－菌后，其它非選擇性標(biāo)記基因進(jìn)入F―受體菌的順序和時(shí)間。

隨著時(shí)間的推移，具有某種非選擇性標(biāo)記基因的菌落逐漸增加，達(dá)到一定頻率后處于一個(gè)穩(wěn)定的水平。某基因轉(zhuǎn)入的時(shí)間越早，它所達(dá)到的頻率越高，“選擇標(biāo)記”基因與“非選擇標(biāo)記基因”間同時(shí)重組的頻率越高，說明選擇標(biāo)記基因與非選擇標(biāo)記基因相距越近；反之，相距越遠(yuǎn)。MappinggenesinHfrandF－crossesbyinterruptedmatingexperiments接合攪拌

排除Hfr（培養(yǎng)基Str）Hfr:thr+

leu+azistonslac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonrlac－gal－strr選擇標(biāo)記排除未接合受體菌TheinterruptedmatingexperimentofWollmanandJacob.Hfr:thr+leu+azistons

lac+gal+strsF－:thr－leu－azirtonr

lac－gal－strr中斷雜交作圖：根據(jù)中斷雜交試驗(yàn)中供體基因進(jìn)入受體所需時(shí)間作為基因間距離繪制連鎖圖的方法。圖距單位為分鐘。

Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSF–:

thr–leu–aziStonSlac–gal-strR重組子不含蘇氨酸t(yī)hr+

strR鏈霉素str的幾種不同培養(yǎng)基（篩）2minthr+8minleu+thr+leu+strR

selectedmarker

選擇標(biāo)記selectedmedium

篩選培養(yǎng)基含鏈霉素不含蘇氨酸和亮氨酸Hfr：

thr+leu+aziRtonRlac+gal+strSHfr非選擇標(biāo)記基因進(jìn)入F–所需時(shí)間

分鐘從Hfr

上轉(zhuǎn)移的基因909aziR

11aziR

tonR

18aziR

tonR

lac+

25aziR

tonR

lac+gal+

用不同的Hfr菌株進(jìn)行中斷雜交實(shí)驗(yàn)所作出的大腸

桿菌基因連鎖圖，其基因向F-細(xì)胞轉(zhuǎn)移的順序大不相同。F因子插入環(huán)狀染色體的不同位置形成不同轉(zhuǎn)移原點(diǎn)和轉(zhuǎn)移方向

大腸桿菌的遺傳圖是環(huán)形的如轉(zhuǎn)移時(shí)間小于2分鐘----傳統(tǒng)的重組作圖法(recombinationmapping)例如lac+(乳糖發(fā)酵)和ade–

(腺嘌呤缺陷型)

Hfr

lac+ade+×F–lac–ade–

完全培養(yǎng)基不加腺嘌呤選出F–

ade+的菌落（重組子）（對(duì)測(cè)定圖距沒有意義，有可能ade尚未進(jìn)入）Hfrlac+ade+strs

×F―

lac–ade–strr

（根據(jù)中斷雜交試驗(yàn)，已知lac和ade緊密連鎖，且lac先于ade進(jìn)入F－。）基因的重組兩基因間的重組頻率是22%。1min約相當(dāng)于20%的重組值ade轉(zhuǎn)化與作圖1、相鄰基因發(fā)生共轉(zhuǎn)化的概率與兩者間的距離呈正相關(guān)：基因間距離越近，發(fā)生共轉(zhuǎn)化的頻率越高，反之越低。2、可以通過測(cè)定兩個(gè)基因共同轉(zhuǎn)化的頻率來確定基因間的相對(duì)距離。F’因子與性導(dǎo)sexduction整合環(huán)出F′因子當(dāng)發(fā)生環(huán)出時(shí)偶然不夠準(zhǔn)確，攜帶有染色體的一些基因，稱這種F因子為F′因子。性導(dǎo)--sexduction接合時(shí)由F′因子所攜帶的外源DNA轉(zhuǎn)移到細(xì)菌染色體的過程。整合在一定的座位上且整合率高。F’plasmidformationandtransferFig.14.18a,b4.轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

Bacteriophage“Eaterofbacteria”inreality,killandlysebacterialcellssometimessimplycalled“phage”Twomajorpartsproteincoat(e.g.,head,tail)capsid(head)withDNAorRNATwodistinctphagegenotypescanbeanalyzedincrosses,allowingmappingtheviralgenomePhagecanbeusedtointroducegenesintobacterialcellsbytransductionAlsousedinrecombinantDNAtechnologyBacteriophage2．噬菌體的類型virulentphagetemperatephageTemperatephagecanintegrateintobacterialgenomethroughlysogeniccyclecreatingaprophage轉(zhuǎn)導(dǎo)的發(fā)現(xiàn)：1952年，J.Lederberg和他的學(xué)生N.Zinder在鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium）中進(jìn)行的重組實(shí)驗(yàn)：1.菌株：StrainLT-2：phe+trp+met-his-StrainLT-22：phe-trp-met+his+將兩個(gè)沙門氏菌的營(yíng)養(yǎng)缺陷型進(jìn)行混合培養(yǎng)（雜交)

phe+

trp+

met-his-

StrainLT-2×

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22↓混合培養(yǎng)基本培養(yǎng)基↓菌落(頻率為1/105)

phe+trp+met+his+conjugationtransformationDNA酶原養(yǎng)型重組菌在LA-22

phe+

trp+

met-

his-

LT-2

phe-

trp-

met+

his+StrainLT-22大分子和病毒通過

過濾性因子(filterableFA)↓

Why?What?FA(不受DNA酶的影響)大小和質(zhì)量與P22相同

沙門氏菌的一種溫和噬菌體P22穿過濾片野生型LT-22(+P22)P22少數(shù)偶然溶菌釋放P22感染LT-22LT-22重組感染LT-2偶然包裝LT-2基因P22P22Transduction：以噬菌體作為載體把一個(gè)細(xì)菌的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的過程，稱轉(zhuǎn)導(dǎo).LT22菌株是攜帶P22噬菌體的溶源性細(xì)菌LT2菌株是對(duì)P22噬菌體敏感的非溶源性細(xì)菌；LT2DNA被裂解成小片段transducingphage再次進(jìn)入LT22根據(jù)轉(zhuǎn)導(dǎo)的特點(diǎn)不同，轉(zhuǎn)導(dǎo)可分為：1）普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)（generalizedtransduction）

隨機(jī)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌的DNA片段。0.3%

2）局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)（restrictedtransduction）

或稱特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)（specializedtransduction）

指一些溫和噬菌體只能轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)菌染色體基因組的某些基因，或者說只是對(duì)噬菌體在染色體基因組整合位點(diǎn)附近基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)。TransductionGeneralizedtransduction（普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)）phageincorporatesrandomfragmentsofhostDNAfortransfertoanotherhoste.g.,phagesP1andP22,temperatephageswhichaccidentallystuffhostDNAintophageheadSpecializedtransduction（局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)）specificgenesaretransferrede.g.,phagewhichtransducesonlyadjacentgenesFrequenciesofcotransductioncanbeusedtomapgenes;inverselyproportionaltodistance

Theformationofgeneralizedtransducingvirusesandthesubsequenttransductionofrecipientbacteria流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)GeneralizedtransductionSpecializedtransduction?2003JohnWileyandSonsPublishersRecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通過λ攜帶的gal+與受體基因gal–進(jìn)行同源配對(duì)，經(jīng)雙交換，產(chǎn)生重組的gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子是非溶源性的，穩(wěn)定的。

λdgal+整合到受體染色體的gal–基因旁邊，不穩(wěn)定普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)菌作圖利用共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率來確定三個(gè)基因在染色體上排列順序共轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率越高，表明這兩個(gè)基因在染色體上的距離越近，連鎖越密切；相反，兩個(gè)基因的共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率越低，則說明兩基因間距離越遠(yuǎn)。三因子轉(zhuǎn)導(dǎo)：E.coli

trpA+supC+pyrF+

作供體，trpA–supC–pyrF–

作受體，由P1轉(zhuǎn)導(dǎo)：trpA

代表與色氨酸（tryptophan）合成有關(guān)的基因；supC代表赭石突變抑制基因(ochre-suppressorgene)；pyrF代表與嘧啶(pyrimidine)生物合成有關(guān)的基因。最初選擇supC+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，然后檢查supC+轉(zhuǎn)導(dǎo)子中其它兩個(gè)基因被轉(zhuǎn)導(dǎo)的情況，得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)類型和數(shù)目如下：

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603Differentclassesofcrossovers:quadruplecrossoverisleastfrequentFig.14.17c從最少類型的轉(zhuǎn)導(dǎo)子③的基因型可看出：這三個(gè)基因的次序是supCtypApyrF，即typA位于中間。SupC+與trpA+共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為：36+114∕603=0.25SupC+和pyrF+共轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率為：36∕603=0.06

①supC+trpA+pyrF+36②supC+trpA+pyrF–114③supC+trpA–pyrF+0④supC+trpA–pyrF–

453603

應(yīng)用中斷雜交技術(shù)、重組作圖、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)相結(jié)合的方法已經(jīng)得到細(xì)菌的非常詳細(xì)的染色體圖

RecombinationbetweenattsitesonthephageandbacterialchromosomesallowsintegrationoftheprophageFig.14.22bErrorsinprophageexcisionproduce

specializedtransducingphageAdjacentgenesareincludedincircularphageDNAthatformsafterexcisionFig.14.22cλdgal+侵染gal–菌株通過λ攜帶的gal+與受體基因gal–進(jìn)行同源配對(duì)，經(jīng)雙交換，產(chǎn)生重組的gal+轉(zhuǎn)導(dǎo)子，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)子是非溶源性的，穩(wěn)定的。

λdgal+整合到受體染色體的gal–基因旁邊，不穩(wěn)定1946年第11屆冷泉港會(huì)議上Hershey和Luria宣布發(fā)現(xiàn)噬菌體r、h突變，Delbruck和Hershey發(fā)表了噬菌體重組實(shí)驗(yàn)。三人獲1969年NobelPrize噬菌體突變影響生活周期，會(huì)產(chǎn)生不同的噬菌斑?？梢酝ㄟ^觀察噬菌斑的形態(tài)來鑒別噬菌體的基因型。單個(gè)噬菌體的突變必須電鏡才能鑒定。噬菌體重組與作圖：（1）噬菌斑的形態(tài)：（2）宿主范圍：h-：噬菌體能在E.coliB和B/2品系上生長(zhǎng)，在B和B/2

混合菌苔上產(chǎn)生透明斑。h+：只能在E.coliB品系上生長(zhǎng)，在B和B/2混合菌苔

上產(chǎn)生半透明斑。Hershey使用的兩個(gè)表型特征：T2r-：快速溶菌，噬菌斑大，邊緣清楚。r+：噬菌斑小，邊緣模糊。B和B/2混合菌苔噬菌斑與基因型噬菌體雜交：1.親本噬菌體（T2）基因型：h-r+：透明，小斑，邊緣模糊。h+r-：半透明，大斑，邊緣清楚。2.雜交過程——混合感染實(shí)驗(yàn)：兩個(gè)親本噬菌體混合感染E.coliB菌株，子代噬菌體通過感染B和B/2菌株，觀察菌苔上出現(xiàn)的噬菌斑特征，推斷子代噬菌體的基因型。（mixedinfectionexperiments）大半透明大透明小半透明小透明雜交結(jié)果：在B和B/2混合菌苔上出現(xiàn)了4種噬菌斑：噬菌斑表型推測(cè)基因型親本型透明小h-r+半透明大h+r-重組型半透明小h+r+透明大h-r-重組機(jī)理：h+r-h+r-h+r-h-r+h-r+h-r+h+r-h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-

r+噬菌體染色體在細(xì)菌體內(nèi)復(fù)制不同的噬菌體染色體在細(xì)菌體內(nèi)交換重組h+r+h+r-h+r-h-

r+h-

r+h-r-h+r+h+r-h-r+h-r-釋放出4種子代噬菌體部分噬菌體DNA重組噬菌體重組值計(jì)算與基因作圖：1.重組值的計(jì)算：重組噬菌體的噬菌斑數(shù)總噬菌斑數(shù)×100%2.基因圖距：用兩個(gè)基因的重組值表示基因間的遺傳距離。（h+r+

+h-

r-

）totalplaques×100%Hershey和Rotman1949年的T2雜交結(jié)果基因型噬菌斑百分率h-

r+4276%h+r-34h+r+1224%h-

r-12rh24四種噬菌斑數(shù)及重組值雜交組合

每種基因型的%

重組值r–h+r+h–r+h+r–h–ra–h+

r+h–rb–h+

r+h–rc–h+×r+h–34.032.039.042.056.059.012.05.90.712.06.40.924%12.3%1.6%

ra–h+

r+h–

→24%

rb–h+

r