《核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》

》(征求意見(jiàn)稿)編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《二0一六年國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂項(xiàng)目》，項(xiàng)目編號(hào)“20161339-T-424”。本項(xiàng)任務(wù)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，定于2016年完成。本標(biāo)準(zhǔn)起草工作組由河北省食品檢驗(yàn)研究院等單位共同組成。二、標(biāo)準(zhǔn)編制原則本標(biāo)準(zhǔn)遵循GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)》和標(biāo)準(zhǔn)編寫(xiě)內(nèi)容參考了與核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范相關(guān)文獻(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)參照了GB/T6379.1-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度（正確度與精密度）》第1部分總則與定義和GB/T6379.2-2004《測(cè)量方法與結(jié)果的準(zhǔn)確度》第2部分確定標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量方法重復(fù)性與再現(xiàn)性的基本方法。標(biāo)準(zhǔn)制定的背景及意義20世紀(jì)以來(lái)，生物學(xué)飛速發(fā)展，人類不斷解密生命，不斷發(fā)現(xiàn)自我。幾十年來(lái)，核酸一直作為遺傳物質(zhì)被大眾所熟知。隨著脫氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）和蛋白質(zhì)相互作用研究的深入開(kāi)展，Tuerk和Gold在1990年率先從含有8個(gè)隨機(jī)序列的RNA文庫(kù)中篩選到了能特異性結(jié)合噬菌體T4DNA聚合酶（gp43）的RNA序列，并將該技術(shù)命名為配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SystematicEvolutionofLigandsbyExponentialEnrichment，SELEX）。而后，Ellington和Szoatak成功的運(yùn)用該技術(shù)從含150bp隨機(jī)序列的RNA庫(kù)中篩選到6種針對(duì)有機(jī)小分子染料的RNA寡核苷酸，并命名為“Aptamer”，國(guó)內(nèi)一般將其翻譯為為“適配體”、“核酸適（識(shí)）體”、“核酸適配子（體）”。1992年，Ellington和Szoatak又成功地從含有157bp的隨機(jī)序列ssDNA庫(kù)中篩選出cibacronblue、reactivegreen19和reactiveblue4的aptamer。從此，核酸適配體進(jìn)入人們的視野，并不斷在新的領(lǐng)域得到應(yīng)用。核酸適配體是經(jīng)體外篩選技術(shù)得到的，由十幾個(gè)或幾十個(gè)核苷酸組成的寡聚核苷酸片段（即ssDNA或RNA）。盡管ssDNA和RNA不同，但是經(jīng)核磁共振及X射線晶體衍射等手段研究發(fā)現(xiàn)，SELEX技術(shù)篩選得到的兩種適配體都能夠折疊形成熱力學(xué)穩(wěn)定的特殊三維空間結(jié)構(gòu)，如發(fā)夾（Hairpin）、莖環(huán)（Stem-Loop）、假結(jié)（Pseudoknot）和G-四聚體（G-tetramer），基于其單鏈核酸結(jié)構(gòu)及其空間結(jié)構(gòu)的多樣性，適配體可通過(guò)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)、堿基堆積力、范德華力、氫鍵和靜電等作用與靶分子特異性結(jié)合。SELEX技術(shù)通過(guò)靶分子與大容量化學(xué)合成的隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)作用，將所形成的靶分子-寡核苷酸復(fù)合物與游離寡核苷酸分離，再利用PCR體外擴(kuò)增技術(shù)對(duì)形成復(fù)合物的寡核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。多次重復(fù)以上篩選步驟（一般需要4~20輪）以獲得親和力高、特異性好的適配體。人工構(gòu)建的核酸庫(kù)一般包括正向引物序列、20~60個(gè)隨機(jī)核苷酸序列、反向引物序列3部分。通過(guò)對(duì)可與靶分子特異性結(jié)合的寡核苷酸進(jìn)行數(shù)輪反復(fù)的體外篩選、擴(kuò)增，達(dá)到指數(shù)級(jí)富集的效果，最終獲得與靶分子有特異結(jié)合作用的核酸適配體。SELEX技術(shù)篩選核酸適配體包括5個(gè)主要步驟，結(jié)合、分離、洗脫、擴(kuò)增和調(diào)節(jié)。其基本過(guò)程如圖1所示：首先建立一個(gè)隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，庫(kù)容約1013~1015個(gè)，將靶分子加入到該文庫(kù)中，在特定的緩沖液體系和適宜的溫度下孵育，待靶分子與文庫(kù)中的隨機(jī)核苷酸充分結(jié)合后，再利用過(guò)濾、親和層析、磁珠分離、毛細(xì)管電泳等物理方法分離與靶分子結(jié)合的核苷酸序列。洗脫和收集結(jié)合的序列，PCR擴(kuò)增洗脫收集的序列，集成富集的次級(jí)文庫(kù)，再與原靶分子進(jìn)行下一輪的篩選循環(huán)。每個(gè)靶分子要進(jìn)行6~20個(gè)連續(xù)循環(huán)，每輪篩選的同時(shí)，設(shè)立平行的親和力檢測(cè)試驗(yàn)，當(dāng)獲得的核酸文庫(kù)對(duì)靶分子的親和力不再增高，篩選過(guò)程就可停止。最后富集的文庫(kù)要通過(guò)克隆和測(cè)序來(lái)獲得最終特異識(shí)別靶分子的適配體。需要注意的是，大多數(shù)適配體與靶分子間的作用力為氫鍵，RNA文庫(kù)比DNA文庫(kù)更具有多樣性，但是所得適配體高度傾向被核酸酶結(jié)合。因此需要建立動(dòng)態(tài)組合文庫(kù)用新的方法來(lái)克服適配體化學(xué)穩(wěn)定性的問(wèn)題。圖1SELEX技術(shù)基本流程SELEX近年來(lái)獲得了快速發(fā)展，開(kāi)發(fā)出了多種新型的篩選方法，大大提高了適配體的篩選周期和篩選效率，如以提高核酸適配體選擇性為目的的篩選方法：反向篩選（counterSELEX）、消減篩選（subtractiveSELEX）、光交聯(lián)篩選（photoSELEX）、負(fù)篩選（negativeSELEX）；以提高核酸適配體普適性為目的的核酸適配體篩選方法：混合篩選（blendedSELEX）、復(fù)合靶篩選（complextargetsSELEX）、表達(dá)盒篩選（expressionSELEX）、切換篩選（togglingSELEX）；以縮短篩選周期為目的的高效篩選方法：自動(dòng)化篩選（automatedSELEX）、不放大篩選（non-SELEX）、熒光磁珠篩選（FluMagSELEX）；不同結(jié)合庫(kù)相結(jié)合以增加目標(biāo)核酸適配體篩選機(jī)率的方法：加尾篩選（tailoredSELEX）、基因篩選（genomicSELEX）。核酸適配體的功能與抗體很相似，核酸適配體—分子的結(jié)合與抗原—抗體的結(jié)合類似，但核酸適配體還具有更多的優(yōu)點(diǎn)：核酸適配體的靶分子范圍廣泛，除蛋白質(zhì)等大分子外，還能結(jié)合金屬離子、生物毒素、工業(yè)染料心等小分子，也可結(jié)合細(xì)胞氣病毒等[8-9]，被喻為“化學(xué)抗體”；核酸適配體寡核苷酸分子自身間可形成發(fā)夾（hairpin）、假結(jié)（pseudoknot）、凸環(huán)（bulge）或四聚體（G-quartet）等空間結(jié)構(gòu)，并通過(guò)靜電、氫鍵、范德華力等非共價(jià)作用力，與靶分子間發(fā)生空間形狀切合的、高親和力、高特異性的相互作用；核酸適配體還有以下幾方面優(yōu)勢(shì)：（1）篩選方便核酸適配體通過(guò)化學(xué)合成的方法得到，不依賴于生物體，避免了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，因此有可能篩選出沒(méi)有免疫源性或低免疫源性甚至具有毒性的靶分子的核酸適配體。通常制備免疫抗體至少需要3-6個(gè)月，而核酸適配體的篩選周期一般為2-3個(gè)月，有的甚至只需幾周。（2）易于修飾和標(biāo)記核酸適配體的末端易于連接一些活性基團(tuán)，容易固定在基質(zhì)上，可以在末端修飾一些指示基團(tuán)，便于進(jìn)行檢測(cè)。而抗體的修飾要困難得多。（3）特異性強(qiáng)，靶分子范圍廣核酸適配體對(duì)體外篩選靶分子有很高的特異性和親和力，目標(biāo)范圍廣泛，包含有機(jī)染料、氨基酸、蛋白質(zhì)、抗生素、多肽、維生素、藥物，甚至整個(gè)細(xì)胞、致病菌、病毒、組織等。從理論上講，任何靶物質(zhì)都可以通過(guò)SELEX技術(shù)篩選得到相應(yīng)的核酸適配體。（4）親和力高核酸適配體與靶分子形成的復(fù)合物的解離常數(shù)Kd一般都在mmol/L級(jí)別，甚至可達(dá)到pmol/L水平。（5）穩(wěn)定性好相較于抗體的容易變性，核酸適配體具有較高的熱穩(wěn)定性，變性的適配體也很容易再生。且相對(duì)于蛋白質(zhì)抗體和酶，適配體的化學(xué)性質(zhì)更穩(wěn)定，保存時(shí)間更長(zhǎng)，制成干粉可室溫保存，便于常溫下運(yùn)輸。（6）分子量小核酸適配體的分子量小，滲透性好，結(jié)合靶分子時(shí)空間位阻小，具有高通量篩選的潛力?；谏鲜龅膬?yōu)點(diǎn)，核酸適配體生物傳感器在眾多領(lǐng)域應(yīng)用的前景十分廣闊。比如說(shuō)在常見(jiàn)的化學(xué)領(lǐng)域，疾病診斷領(lǐng)域、食品生物安全領(lǐng)域、分子診斷領(lǐng)域、微生物檢測(cè)領(lǐng)域以及獸藥殘留的檢測(cè)等方面。目前已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)和銷售，但根據(jù)文獻(xiàn)、調(diào)研顯示，對(duì)于核酸適配體的篩選制備，目前仍然沒(méi)有形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各生產(chǎn)和銷售廠商對(duì)核酸適配體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)各自定義，結(jié)果差異顯著。鑒于此，開(kāi)展核酸適配體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范的制定，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，可有助于規(guī)范市場(chǎng)上此類產(chǎn)品的亂象，切實(shí)保障消費(fèi)者的使用。經(jīng)濟(jì)全球化浪潮使標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)上升到了戰(zhàn)略地位，特別是進(jìn)入21世紀(jì)以后，生物技術(shù)和生物產(chǎn)品發(fā)展迅速，發(fā)達(dá)國(guó)家紛紛制定包括核酸適配體在內(nèi)的各自的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展戰(zhàn)略，以應(yīng)對(duì)因經(jīng)濟(jì)全球化對(duì)自身帶來(lái)的影響。此外，此類標(biāo)準(zhǔn)的制定也同樣滿足《國(guó)家中長(zhǎng)期科學(xué)和技術(shù)發(fā)展規(guī)劃綱要（2006-2020年）》中明確把實(shí)施技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)戰(zhàn)略作為我國(guó)科技發(fā)展的兩大戰(zhàn)略之一的目標(biāo)，有助于保障國(guó)家科學(xué)發(fā)展、社會(huì)和諧。標(biāo)準(zhǔn)工作過(guò)程（1）確立標(biāo)準(zhǔn)制定的基本原則，收集國(guó)際和國(guó)內(nèi)生物產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)。（2）比較與研究我國(guó)原國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)內(nèi)容，并結(jié)合方法的研究工作，制定出標(biāo)準(zhǔn)的討論稿。（3）將標(biāo)準(zhǔn)討論稿提交專家組審查。（4）發(fā)出《征求意見(jiàn)稿》征求意見(jiàn)，匯總專家意見(jiàn)，根據(jù)專家意見(jiàn)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)文本進(jìn)行完善。（5）提交《核酸適體篩選制備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》（送審稿）、《編制說(shuō)明》和《征求意見(jiàn)匯總表》供食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)審評(píng)委員會(huì)審議。標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容1、標(biāo)準(zhǔn)的主要內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)包括7個(gè)部分，第1-3部分為范圍、引用和專業(yè)術(shù)語(yǔ)與定義，第4-7為小分子、大分子、細(xì)胞、以及復(fù)雜靶標(biāo)等不同層次靶標(biāo)體系的核酸適配體篩選和防污染措施。2、具體內(nèi)容（1）1-3部分為規(guī)定了核酸適配體篩選范圍、引用規(guī)范性文件和專業(yè)術(shù)語(yǔ)。包括核酸適配體篩選條件與流程的優(yōu)化，建立高效、快速、標(biāo)準(zhǔn)化的篩選技術(shù)通則。其中的核酸適配體適用范圍為不同層次靶標(biāo)體系。專業(yè)術(shù)語(yǔ)與定義包括對(duì)核酸適配體和SELEX技術(shù)解釋說(shuō)明。（2）4-7部分為規(guī)定了具體的核酸適配體篩選方式。包括主要設(shè)備和材料、主要培養(yǎng)基和試劑、核酸適配體篩選的操作步驟等。操作步驟可分為七個(gè)部分文庫(kù)的構(gòu)建、針對(duì)于不同靶標(biāo)的篩選原則、擴(kuò)增、次級(jí)文庫(kù)制備、多輪篩選和篩選進(jìn)程監(jiān)、單克隆鑒定和驗(yàn)證七個(gè)部分。文庫(kù)的構(gòu)建包括了DNA文庫(kù)的構(gòu)建和RNA文庫(kù)的