分子生物學(xué)復(fù)習(xí)提綱答案

PAGEPAGE4分子生物學(xué)復(fù)習(xí)提綱（個(gè)人答案，僅供參考）名詞解釋同源染色體：二倍體細(xì)胞中染色體以成對的方式存在,一條來自父本，一條來自母本，且形態(tài)、大小相同，并在減數(shù)分裂前期相互配對的染色體。含相似的遺傳信息。限制性片段長度多態(tài)性：用限制酶切割來源不同的DNA，可以得到不同長度的DNA片段，稱為限制性片段。當(dāng)用特別的探針與這些DNA片段雜交時(shí)，發(fā)現(xiàn)同一物種不同個(gè)體DNA的雜交信號(hào)有所不同，這種技術(shù)就是限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)。表達(dá)序列標(biāo)記（EST）：從cDNA文庫隨機(jī)取樣進(jìn)行測序，在基因組中定位，作為表達(dá)基因的位標(biāo)。這樣的位標(biāo)稱為表達(dá)序列標(biāo)記。轉(zhuǎn)錄圖譜就是以EST作為位標(biāo)的基因組圖，又稱cDNA圖或表達(dá)序列圖。引物：DNA聚合酶不能從無到有地合成DNA鏈，只能把脫氧核苷酸連接在已有核酸的3’-羥基上，而且該核酸的序列必須與DNA模板的3’端序列互補(bǔ)，并形成結(jié)合，這已有的核酸就是引物。核酸分子雜交：異源互補(bǔ)的核苷酸序列通過Walson-Crick堿基配對形成穩(wěn)定的雜合雙鏈分子的過程稱為分子雜交。可分為液相雜交和固相雜交兩種。限制性內(nèi)切酶：是一種內(nèi)切核酸酶，由細(xì)菌產(chǎn)生，能識(shí)別雙鏈DNA的特定序列（限制位點(diǎn)），并水解該序列內(nèi)部或附近的磷酸二酯鍵?？煞譃槿悾孩?、Ⅱ、Ⅲ型限制酶，其中Ⅱ型限制位點(diǎn)和切割位點(diǎn)都確定。探針：是指用以與待測核酸進(jìn)行雜交的已知序列的標(biāo)記核酸片段。細(xì)胞周期：是指連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的整個(gè)過程。細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂開始的時(shí)間叫細(xì)胞分裂間期。Southernblotting：即DNA印跡法，將通過凝膠電泳分離的待測核酸轉(zhuǎn)移并結(jié)合到固相支持物上，然后與探針進(jìn)行雜交并分析。Westernblotting：即蛋白質(zhì)印跡法，它和DNA印跡法、RNA印跡法類似，由電泳分離、轉(zhuǎn)移固定和檢測分析等組成。用它既可以鑒定一個(gè)蛋白質(zhì)樣品中的目的蛋白，也可以檢測一種目的蛋白在不同組織細(xì)胞內(nèi)的相對含量。單基因疾?。菏怯蓡我换蛲蛔円鸬募膊。瑢儆诿系聽栠z傳病，常見病有血友病A和假肥大型肌營養(yǎng)不良癥。原癌基因：又稱細(xì)胞癌基因，是存在于細(xì)胞基因組中的一種正?；颍涔δ苁强刂萍?xì)胞生長和分化。原癌基因是病毒癌基因的同源序列。原癌基因受物理、化學(xué)或微生物等因素的作用，發(fā)生突變或擴(kuò)增等，激活成為癌基因。癌基因：是原癌基因的突變體，其編碼產(chǎn)物可以使培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，或在動(dòng)物體內(nèi)誘發(fā)腫瘤。抑癌基因：是一類存在于正常細(xì)胞內(nèi)、調(diào)控細(xì)胞生長的基因，具有潛在抑癌作用。如果這類基因發(fā)生突變而失活，可以引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生?；蛐酒夹g(shù)：將大量寡核苷酸分子作為探針，固定于較小的支持物表面，然后與標(biāo)記好的待測核酸樣品進(jìn)行雜交，再檢測雜交信號(hào)的強(qiáng)弱，從而判斷樣品中待測核酸的數(shù)量或活性狀態(tài)。問答題一、簡述PCR引物設(shè)計(jì)原則引物長度合適——不小于15nt，一般為15~30nt。引物堿基的組成和分布具有隨機(jī)性——要避免嘌呤或嘧啶堿基含量過高或集中排列。引物的堿基組成基本一致——堿基組成影響退火溫度，兩個(gè)引物的堿基組成一致，可以應(yīng)用相同的退火溫度，確保PCR的成功。引物內(nèi)部避免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)——不超過3bp。引物之間沒有互補(bǔ)性——會(huì)造成引物之間退火，發(fā)生引物擴(kuò)增，降低擴(kuò)增效率。引物的3’端最好是G/C引物的5’端可以修飾——即使不互補(bǔ)，也基本不影響PCR的特異性。引物嚴(yán)格特異引物的濃度合適引物的質(zhì)量好印跡雜交過程：樣品制備—電泳分離—印跡—預(yù)雜交—雜交—洗膜—分析二、試述DNA印跡法的原理、操作過程及其應(yīng)用原理：將通過凝膠電泳分離的待測核酸轉(zhuǎn)移并結(jié)合到固相支持物上，然后與探針進(jìn)行雜交并分析。過程：1、提取DNA、用限制酶切割，獲得DNA片段混合物。2、瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段3、用堿處理電泳凝膠，將DNA片段原位變性解鏈。4、將變性的DNA片段從凝膠轉(zhuǎn)移到固相膜上。5、用封閉物預(yù)雜交，然后漂洗除去未結(jié)合封閉物。6、用探針雜交液浸泡固相膜，與待測DNA片段進(jìn)行雜交。7、用不同離子強(qiáng)度的溶液依次漂洗固相膜，除去未雜交探針和形成非特異性雜交體的探針。8、通過顯影或顯色分析固相膜上的雜交體，將雜交體位置和凝膠電泳圖譜進(jìn)行對比，可計(jì)算待測DNA片段的分子量。應(yīng)用：檢出特異的DNA片段，測定分子量，分析DNA限制酶圖譜、DNA指紋、基因突變、基因擴(kuò)增和DNA多態(tài)性等。三、根據(jù)被測定的對象，簡述分子雜交印跡的種類、特點(diǎn)及其應(yīng)用上優(yōu)缺點(diǎn)1、DNA印跡法2、RNA印跡法RNase無處不在，要絕對消除外源RNase的污染。先變性后電泳、轉(zhuǎn)移。不能采用堿變性，只能采用甲醛、乙二醛、二甲基亞砜等變性?？梢杂糜诙ㄐ曰蚨糠治鼋M織細(xì)胞內(nèi)的總RNA或某一種特異RNA，特別是分析癌基因：抑癌基因：1、Rb——在G1期，Rb蛋白是細(xì)胞周期抑制信號(hào)的集合點(diǎn)，低磷酸化的Rb蛋白阻止細(xì)胞G1/S期和G2/M期的過渡，從而抑制細(xì)胞分裂增殖。Rb蛋白通過對轉(zhuǎn)錄因子E2F的作用來調(diào)控細(xì)胞增殖和分化。2、p53——野生型p53蛋白在維持細(xì)胞正常生長、抑制惡性增殖過程中起重要作用。促進(jìn)DNA修復(fù)。3、p16蛋白既是細(xì)胞周期的有效調(diào)控者，又是抑制腫瘤細(xì)胞生長的關(guān)鍵因子。抑制CDK4，使Rb蛋白保持低磷酸化，抑制細(xì)胞從G1期向S期的過渡，從而抑制細(xì)胞增殖。4、nm23作為CDKI：p15、p16、p21和p27通過CDKI抑制細(xì)胞周期：p53，Rb十、基因治療的主要策略、基本過程及存在的問題1、策略：基因修復(fù)——即基因矯正，是指通過矯正突變堿基來修復(fù)致病基因?；蛑脫Q——以正?；蛉〈虏』颉；蛟鲅a(bǔ)——將目的基因?qū)氘惓＜?xì)胞，其表達(dá)產(chǎn)物能補(bǔ)償致病基因的功能?；蚋深A(yù)——反義核酸技術(shù)、核酶技術(shù)、RNA干擾技術(shù)、自殺基因技術(shù)。免疫基因治療——把產(chǎn)生抗病毒或抗腫瘤免疫應(yīng)答的基因?qū)塍w內(nèi)，改變機(jī)體免疫狀態(tài)，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。耐藥基因治療基因激活——重新開放已經(jīng)關(guān)閉的基因。2、基本過程：目的基因的選擇和制備靶細(xì)胞的選擇基因的導(dǎo)入——體內(nèi)法、原位法、回輸法?；?qū)胄枰d體，有病毒載體法和非病毒載體法兩種。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選和導(dǎo)入基因的鑒定3、存在問題：需要更多的切實(shí)有效的目的基因需要提高基因?qū)胄市枰岣呋驅(qū)氲奶禺愋孕枰岣吣康幕虮磉_(dá)的可控性PPT細(xì)胞凋亡的特征:胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)凝集、染色體降解呈DNAladder、細(xì)胞膜出芽形成凋亡小體。體內(nèi)被正常細(xì)胞或吞噬細(xì)胞清除，而不引發(fā)炎癥。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在形態(tài)學(xué)上的差別細(xì)胞凋亡：一般都要經(jīng)過誘導(dǎo)-調(diào)控與執(zhí)行-效應(yīng)3個(gè)階段 1、單細(xì)胞丟失2、細(xì)胞膜發(fā)泡但仍完整3、細(xì)胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞分割成多個(gè)有膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的凋亡小體4、不發(fā)生炎癥反應(yīng)5、被臨近正常細(xì)胞或吞噬細(xì)胞吞噬6、溶酶體完整7、染色質(zhì)均一凝集 細(xì)胞壞死：1、細(xì)胞成群丟失2、細(xì)胞膜不完整3、細(xì)胞腫脹、溶解4、發(fā)生嚴(yán)重炎癥反應(yīng)5、被巨噬細(xì)胞吞噬6、溶酶體裂解7、染色質(zhì)凝集成塊、不均一細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死在生物化學(xué)上的區(qū)別細(xì)胞凋亡：1、生理因素或非生理因素誘導(dǎo)2、受大分子合成和激活過程的嚴(yán)格調(diào)控3、需要能量4、需要大分子合成5、有新基因從頭轉(zhuǎn)錄6、染色質(zhì)非隨機(jī)降解為DNA“梯帶”細(xì)胞壞死：1、非生理因素造成的意外損傷2、離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)喪失3、不需要能量4、不需要核酸和蛋白質(zhì)的合成5、沒有新基因轉(zhuǎn)錄6、染色質(zhì)DNA隨機(jī)降解為涂抹狀由于生化改變是從基因開始，從內(nèi)到外，所以DNA的損傷發(fā)生在胞質(zhì)、胞膜通透性改變之前即凋亡早期，而壞死由于損傷是從外到內(nèi)，細(xì)胞器溶酶體等先溶解、破裂，釋放的酶再把DNA隨機(jī)降解成無數(shù)大小不一的片段，電泳呈涂沫狀拖帶，不能形成“梯子”減數(shù)分裂如果是生殖細(xì)胞，則進(jìn)行減數(shù)分裂:第1次分裂，只是同源染色體（人類共有23對）分開，分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞而姊妹染色單體不分開，即新合成的兩條子代DNA還不分開。第2次分裂，兩條子代DNA隨著姊妹染色單體分開，分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞中，因此生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂，染色體DNA復(fù)制一次，細(xì)胞分裂2次，形成4個(gè)單倍體細(xì)胞，每個(gè)配子細(xì)胞只有23條染色質(zhì)即23條DNA雙鏈。主要檢驗(yàn)點(diǎn)：包括G1/S檢驗(yàn)點(diǎn)，S期檢驗(yàn)點(diǎn)，G2/M檢驗(yàn)點(diǎn)，紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC）。cDNA文庫：以mRNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補(bǔ)的DNA，再復(fù)制成雙鏈cDNA片段，與適當(dāng)載體連接后轉(zhuǎn)入受體菌，即獲得cDNA文庫(cDNAlibrary)基因工程常用工具酶：限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNA連接酶 催化5'-磷酸與3'-羥基形成磷酸二酯鍵DNA聚合酶 以DNA為模板合成DNARNA聚合酶以RNA為模板合成DNA堿性磷酸酶 切除末端磷酸T4多聚核苷酸激酶催化核酸5'-羥基磷酸化末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化3'-端合成同聚體尾常用載體：質(zhì)粒(plasmid)；噬菌體(phage)；酵母載體(yeastvector)；病毒載體(virusvector)。印跡（轉(zhuǎn)膜）方法：毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移法真空轉(zhuǎn)移法電轉(zhuǎn)移法單基因遺傳性高血壓1）糖