第3章蛋白質(zhì)的分離

第一節(jié)蛋白質(zhì)分離純化概述

一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序二、蛋白質(zhì)純化方法分類

三、蛋白質(zhì)分離純化中的注意事項(xiàng)

回總目錄1HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序2HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分對(duì)于任何一個(gè)特定的蛋白質(zhì)，純化方案細(xì)節(jié)的確定都有賴于一系列的因素，，這些因素包括：1.正確選擇原材料和定位目的蛋白（胞內(nèi)或胞外）；2.目的蛋白的表達(dá)水平；3.蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；4.純化的目的。3HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分一、蛋白質(zhì)分離純化的一般程序0.材料選取1.破碎生物組織，用緩沖液將蛋白質(zhì)抽提出來；對(duì)于外泌型蛋白，省去破碎步驟2.用離心法將亞細(xì)胞成分及細(xì)胞碎片與溶液分開。3.應(yīng)用鹽析法或有機(jī)溶劑法將蛋白質(zhì)沉淀下來4.應(yīng)用層析法或電泳法使各種蛋白質(zhì)分開5.使蛋白質(zhì)結(jié)晶或制成凍干粉

回第一節(jié)4HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分二、蛋白質(zhì)純化方法分類沉淀法：利用一種蛋白質(zhì)相對(duì)于其它蛋白質(zhì)溶解度的不同來進(jìn)行（同一溶劑）2.

相分配法：依據(jù)蛋白質(zhì)在兩相間分配作用的不同來進(jìn)行（不同溶劑）3.

柱層析法：利用蛋白質(zhì)對(duì)固體載體的吸附性質(zhì)不同，通過柱層析方式將它們分別洗脫下來。包括：親和層析、離子交換層析、凝膠過濾層析等。4.電泳法及離心法：依據(jù)蛋白質(zhì)在電場(chǎng)或離心場(chǎng)中運(yùn)動(dòng)速度的不同來進(jìn)行。5HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

各種純化或分析方法的原理：硫酸銨

沉淀分離細(xì)胞細(xì)胞器分離細(xì)胞質(zhì)勻漿大分子核酸多醣(脂類)分子大小不同分子電荷不同分子極性不同親和力不同小分子細(xì)胞碎片Celldebris蛋白質(zhì)氨基酸

單糖核酸

脂肪酸凝膠過濾,SDS,超濾,離心離子交換,等電聚焦反向?qū)游?鹽析親和層析,羥基磷灰石6HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

各種純化方法的應(yīng)用次序：102030405123467沉淀離子交換親和層析凝膠過濾步驟次數(shù)勻漿回第一節(jié)7HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分三、蛋白質(zhì)分離純化中的注意事項(xiàng)：

1.首先要建立一個(gè)方便靈敏的分析方法。2.要選擇一種最好的含有目的蛋白質(zhì)的材料3.分離步驟要盡可能少4.盡量避免蛋白質(zhì)在提純過程中的變性：包括六個(gè)方面8HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分盡量避免蛋白質(zhì)在提純過程中的變性

▼分離過程快速，保持在低溫（4℃）下進(jìn)行。▼盡量避免過度暴露于空氣中▼注意重金屬離子污染▼避免極端的pH及溫度對(duì)蛋白活性的影響▼維持較高的提取液濃度▲少數(shù)蛋白質(zhì)需在高離子強(qiáng)度的極性介質(zhì)中保持活性，需要向提取液中加入KCl、NaCl、(NH4)2SO4

等回第一節(jié)9HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分第二節(jié)材料的選擇與處理一、材料的選擇二、材料的處理三、細(xì)胞破碎方法四、初級(jí)純化五、膜蛋白的釋放

六、胞外酶的分離回總目錄10HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分一、材料的選擇

先考慮以下幾點(diǎn)： 5W

a.

要純化那一個(gè)蛋白？

What?

b.

為何要純化此蛋白？

Why?

c.

由何種材料純化？

Where,from?

d.

由那一個(gè)生長(zhǎng)期？

When?

e.

如何純化此蛋白？

How?11HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

目標(biāo)材料的選擇：

何種生物來源？

動(dòng)物、植物、微生物

何種組織？

根莖葉花果實(shí)種子或動(dòng)物某器官

何種細(xì)胞器？

細(xì)胞核、液泡、葉綠體

細(xì)胞內(nèi)、外？

分離方法選擇

水溶性或脂溶性？

影響抽取策略的設(shè)計(jì)12HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分SP蛋白質(zhì)表現(xiàn)(馬鈴薯各組織)SPRNA表現(xiàn)(馬鈴薯各組織)StPierre,B.;Bertrand,C.;Camirand,A.;Cappadocia,M.;Brisson,N.(1996)PlantMolecularBiology30:1087-1098Thestarchphosphorylasegeneissubjectedtodifferentmodesofregulationinstarch-containingtissuesofpotatoL:leaf（葉）P:petiole（葉柄）S:shoot（枝條）St:stem（樹干）T:tuber（塊莖）R:root（根）SP:

starchphosphorylase13HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分材料的選擇原則：

（1）材料中目的蛋白質(zhì)含量要高（2）材料容易獲得?；氐诙?jié)14HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分二、材料的處理1.動(dòng)物材料2.植物材料3.微生物材料回第二節(jié)15HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1.動(dòng)物材料的處理最重要的是在接近動(dòng)物正常生理狀態(tài)下取出組織和器官，把死亡后的變化控制在最小限度內(nèi)（腎移植）取材料后迅速處理，或立即置入液體氮中速凍，再轉(zhuǎn)置低溫(-10℃～-50℃)下保存?zhèn)溆谩７祷?6HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2.植物材料的處理

使用植物材料時(shí)，除了上述的注意事項(xiàng)外，還要注意：（1）

植物細(xì)胞壁比較堅(jiān)厚，含有大量的纖維素，要采取有效的方法充分破碎（纖維素酶、研磨）。（2）

植物組織中含有大量多酚、丹寧、類黃酮等次生物質(zhì)，在提取過程中會(huì)被氧化成褐色產(chǎn)物、干擾蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化，必須防止（加保護(hù)劑防止氧化，如：Vc、Bβ-mercaptoethanol；加沉淀劑使其沉淀，如PVP聚乙烯吡咯烷酮）。（3）植物細(xì)胞的液泡內(nèi)含物有可能改變抽提液的pH值（破碎細(xì)胞時(shí)會(huì)釋放出來），因此，對(duì)植物組織常使用較高濃度的緩沖液作為提取液。

17HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

植物色素的產(chǎn)生及去除：

Phenoliccompound

→→→

褐色色素

PolyphenoloxidaseBβ-mercaptoethanol低溫抑

制降低催化adsorb吸附Polyvinylpolypyrrolidone(PVPP)聚乙烯吡咯烷酮返回18HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3.微生物材料的處理微生物可大規(guī)模培養(yǎng)，原料來源一般不受限制通過基因工程技術(shù)，將基因轉(zhuǎn)化到微生物中，可以大量表達(dá)蛋白質(zhì)，對(duì)稀有珍貴蛋白質(zhì)的獲得有重要的實(shí)際意義。

返回19HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分三、細(xì)胞破碎方法大多數(shù)蛋白質(zhì)結(jié)合于細(xì)胞器上，將細(xì)胞破碎才能釋放破碎的方法有兩種分類法：從破碎細(xì)胞的原理上可分為化學(xué)法、物理法和機(jī)械法；從破碎細(xì)胞的力量及對(duì)細(xì)胞的傷害方面，可分為溫和的方法、劇烈的方法和較劇烈的方法20HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1機(jī)械破碎

手動(dòng)或馬達(dá)驅(qū)動(dòng)的勻漿器韋林氏搗切器研缽21HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2物理破碎

超聲探頭壓力差破碎機(jī)(N2CO23Mpa)(20kHz100-150W0-10oC3-10min)凍融破碎法22HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3.化學(xué)破碎法

有機(jī)溶劑處理

甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等表面活性劑處理非離子型:TritonTween

離子型表面活性劑破細(xì)胞效果雖好,但容易引起蛋白失活,因此通常不用。23HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分4酶學(xué)破碎法

溶菌酶(專一作用于肽多糖-1,4糖苷鍵)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌 +溶菌酶革蘭氏陰性細(xì)菌 +溶菌酶酵母(胞壁主要為-1,3-葡聚糖) +-葡聚糖酶、蝸牛酶霉菌(胞壁含有幾丁質(zhì)) 幾丁質(zhì)酶植物細(xì)胞 纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶在一定的溫度、PH、離子強(qiáng)度等條件下,保溫一定時(shí)間讓細(xì)胞自溶。24HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

細(xì)胞打破之后：(1)

降低溫度(2)

盡快純化(3)

避免氧化(4)

避免吸附(5)

避免污染回第二節(jié)25HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分四、初級(jí)純化26HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1.抽提(在一定條件下,用適當(dāng)?shù)娜軇┨幚泶痔嵋?讓蛋白充分溶樣到溶劑中的過程)注意事項(xiàng):溫度(0-10oC) PH(偏離酶蛋白pI)

抽提液的體積(3-5倍) 添加保護(hù)劑27HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分抽提蛋白質(zhì)過程中所要注意的問題

球蛋白一般用一定鹽濃度的緩沖液進(jìn)行抽提脂蛋白（油性）一般用稀釋的去垢劑（如SDS）或有機(jī)溶劑來抽提抽提植物中的蛋白質(zhì)（尤其是酶）要特別注意提取液的pH和緩沖能力（因?yàn)橐号輧?nèi)含物的釋放）防止酚類物質(zhì)的氧化，干擾蛋白質(zhì)的分離提純向提取buffer中加入抗氧化劑：巰基乙醇、Vc（抗壞血酸）、DTT（二硫蘇糖醇），易與氧化酶反應(yīng)，阻止酚類和Cys的氧化；加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮），可以吸附醌類物質(zhì)而沉淀，被離心除掉）28HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分5.提取緩沖液的體積一般V/G=2～5之間。不宜過大，會(huì)使得以后分離、純化、濃縮的流程時(shí)間增長(zhǎng)，又增加損失率，6.抽提的原則是“少量多次”，即對(duì)于等量的溶液，分多次抽提比一次抽提好得多7.要防止蛋白水解酶的作用。可以向溶液中加入二異丙基氟磷酸（DFP）或碘乙酸或苯甲基磺酰氟化物（PMSF）

29HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分原理：懸液中的各種粒子（細(xì)胞，細(xì)胞器及分子）有不同的質(zhì)量（mass）或密度（density），因此在離心場(chǎng)中有不同沉降速率。

不同的蛋白質(zhì)分子量差別很大，密度差別很?。ú怀^15%）。蛋白質(zhì)的平均密度是1.37g/cm3。

結(jié)合蛋白密度差異較大。離心力由轉(zhuǎn)子中心到蛋白質(zhì)界面的距離來決定。2.離心分離（centrifugation）本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

離心（centrifugation）

沉降系數(shù)（sedimentationconstant）：每單位離心場(chǎng)的速度（S）。與蛋白質(zhì)的密度和形狀有關(guān)，也與介質(zhì)的密度和粘度有關(guān)。離心可用于兩個(gè)方面：作為分離技術(shù)：從混合物中分離一種成分；作為分析技術(shù)：測(cè)定物質(zhì)的物理性質(zhì)，如分子量，密度，形狀及平衡結(jié)合常數(shù)（equilibriumbindingconstants）。本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

低速離心(<8000rpm或構(gòu)對(duì)離心力(RCF)<1104g)

高速離心(1104-2.5104rpm或RCF=1104-105g)差速離心:采用不同的離心速度和離心時(shí)間,使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。類型32HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分Recoverpellet33HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分34HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

速率區(qū)帶離心

（rate-zonalcentrifugation）

用蔗糖、甘油或氯化銫形成密度梯度；高速離心機(jī)（~40,000r/min）；離心后，被分離的物質(zhì)分布在相應(yīng)的密度區(qū)帶內(nèi)；注意：控制時(shí)間。太短，達(dá)不到充分分離；太長(zhǎng)，分離物沉淀到離心管底部。本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

不能精確測(cè)定分子量，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的形狀差異也影響沉降率；一次分離多種不同類型聚合物或顆粒的最有效方法平衡密度梯度離心（equilibriumdensity-gradiententrifugation）：用于分離DNA和細(xì)胞器

速率區(qū)帶離心（rate-zonalcentrifugation）本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第36頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3.過濾分離借助各種過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物質(zhì)分離開來的技術(shù)。常用介質(zhì):

濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷和各種高分子膜等。常用方法:

粗濾(2m)、微濾(0.2-2m)、超濾(20?-0.2m)、反滲透(<20?)和透析等?；氐诙?jié)37HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第37頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分五、膜蛋白的釋放

膜蛋白存在于細(xì)胞膜或有關(guān)細(xì)胞器（線粒體、葉綠體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或核等）的膜上。按其所在位置大體可分為外周蛋白和固有蛋白（膜內(nèi)蛋白）兩種類型

38HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第38頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■

細(xì)胞膜蛋白質(zhì)抽取較困難：●

抽取膜蛋白時(shí)須添加

TritonX等表面活性劑極性非極性Buchananetal(2000)BiochemistryandMolecularBiologyofPlantsp.839HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第39頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分外周蛋白通過次級(jí)鍵和外膜脂質(zhì)的極性頭部螫合在一起，可以用含乙二胺四乙酸（EDTA）的適當(dāng)緩沖液將其抽提出來。外周蛋白被抽提后，膜一般仍保持完整的雙層結(jié)構(gòu)。固有蛋白嵌合在雙層中。抽提固有蛋白時(shí)，既要削弱它與膜脂的疏水性結(jié)合，又要仍保持疏水基暴露在外的天然狀態(tài)，這個(gè)過程稱為增溶作用

40HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第40頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分理想的增溶劑（去污劑）既有親水部分也有疏水部分，當(dāng)濃度較高時(shí)能形成膠團(tuán)，內(nèi)部為疏水核，外部為親水層。增溶時(shí)，膜蛋白疏水部分嵌入膠團(tuán)的疏水核中而與膜脫離，同時(shí)保住了膜蛋白的疏水結(jié)構(gòu)。被增溶出來的膜蛋白通過透析等方法除掉去污劑，再進(jìn)一步純化。41HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第41頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分用于增溶過程中的去污劑按結(jié)構(gòu)可分為四種：陰離子去污劑（脫氧膽酸鹽）陽(yáng)離子去污劑（溴化十二烷基三甲銨）兩性離子去污劑（二甲基十二烷基甘氨酸）非離子型去污劑（TritonX－100、辛基葡萄糖苷）。近年，非離子型去污劑辛基葡萄糖苷應(yīng)用廣泛，因?yàn)樗呐R界膠團(tuán)濃度高（達(dá)25mmol／L），同時(shí)易于透析，也有利于膜蛋白的重組。

42HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第42頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分幾種去污劑去污劑包括兩類：

非離子型（nonionicdetergents）如TritonX-100、辛基葡萄糖

離子型（ionicdetergents）如脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸納本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第43頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分低濃度時(shí)，去污劑以游離形式存在于溶液中。隨著濃度的增加，它們聚合在一起，形成微團(tuán)（micelles）.微團(tuán)很小、圓球狀聚集物。其親水部分向外，疏水部分向內(nèi)。

臨界微團(tuán)濃度（criticalmicelleconcentration，CMC）：去污劑開始形成微團(tuán)時(shí)的濃度，為去污劑的特征常數(shù)本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第44頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分離子型去污劑除了能與膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合外，還能結(jié)合水溶性蛋白質(zhì)的疏水核心。由于它們帶電，所以能夠破壞蛋白質(zhì)中的鹽鍵和氫鍵,使蛋白質(zhì)變性。非離子型去污劑在不同的濃度有不同的作用方式濃度較高（>CMC）時(shí)，與磷脂、膜蛋白一起形成微團(tuán).

濃度較低（<CMC）時(shí)，雖然不形成微團(tuán)，但仍能與大部分膜蛋白的疏水區(qū)結(jié)合，起增溶作用.本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第45頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分大部分膜周邊蛋白（peripheralprotein）通過離子鍵或其他弱鍵與特定的膜蛋白結(jié)合，因此可用高濃度的鹽或能與二價(jià)陽(yáng)離子（如Ca2+）結(jié)合的試劑進(jìn)行分離。本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第46頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分釋放膜蛋白還有其它的方法，如：（l）用磷酸脂酶A消化；（2）在高pH和高溫下進(jìn)行超聲作用；（3）在低溫（－20℃）下，用丙酮抽提，所得干粉可長(zhǎng)期貯存。這是一種經(jīng)典的現(xiàn)在仍在使用的方法回第二節(jié)47HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第47頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分六胞外酶的分離

◆胞外酶是在微生物發(fā)酵時(shí)分泌到發(fā)酵液中的可通過離心或過濾將菌體除去、上清液經(jīng)濃縮（超濾法）再進(jìn)一步純化。回第二節(jié)48HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第48頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分第三節(jié)蛋白質(zhì)的初步提純（粗分級(jí)）一、去除核酸二、沉淀法去除雜蛋白三、蛋白質(zhì)的脫鹽和濃縮

回總目錄49HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第49頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分一、去除核酸核酸沉淀劑法：常用的核酸沉淀劑有：MnCl2

、硫酸魚精蛋白、鏈霉素等。核糖核酸酶或脫氧核糖核酸酶的應(yīng)用：

一般將酶與抽提液一起（4℃）培養(yǎng)30–60分鐘，就可以把DNA或RNA降解成足夠小的碎片，而不影響蛋白質(zhì)的分離?；氐谌?jié)50HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第50頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分二雜蛋白的去除

主要方法：1.鹽析法2.有機(jī)溶劑沉淀法(甲醇、乙醇、丙酮、異丙醇等)

3.有機(jī)聚合物沉淀法(單寧、聚丙烯酸等)

4.選擇性變性沉淀法5.等電點(diǎn)沉淀法

回第三節(jié)原理：（1）破壞蛋白質(zhì)分子的水合作用，降低蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度，而使其沉淀；（2）降低蛋白質(zhì)分子之間的同性相斥的作用，也能降低蛋白質(zhì)的溶解度，而使其易于沉淀51HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第51頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1.鹽析法1）鹽溶與鹽析2）鹽析法沉淀蛋白質(zhì)的具體操作3）改良的硫銨分級(jí)法4）鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)5）鹽析法操作過程中的注意事項(xiàng)回到二52HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第52頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1）鹽溶與鹽析

鹽溶就是加入中性鹽后蛋白質(zhì)的溶解度增大鹽析就是加入中性鹽后蛋白質(zhì)的溶解度降低，而產(chǎn)生沉淀析出鹽析法常用硫酸銨。因?yàn)椋海?）硫酸銨在水中穩(wěn)定，溶解度也大，在25℃，能得到4.1M（約55%）的濃度。（2）硫酸銨是十分溫和的試劑，高濃度的硫酸銨也不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。

53HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第53頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分鹽析時(shí)蛋白質(zhì)的溶解度會(huì)隨著硫酸銨的濃度從0增加而增加，即所謂的“鹽溶現(xiàn)象”當(dāng)硫酸銨的濃度繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)就開始變得不溶而沉淀下來，即所謂的“鹽析效應(yīng)”。

54HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第54頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分Saltingin■

提高鹽濃度會(huì)增加蛋白質(zhì)的溶解度：0.001M0.005M0.01M0.02M[NaCl]pIpH>5.2pH=5.24.85.05.25.45.6pH0.0010.010.1NaClconcentration(M)溶解度55HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第55頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分+

=

-+

=

-■

鹽溶

Salting-in：Ionicstrength溶解度+-NaClNaClKCl-+++++------+++++-------------------------++++++++++++++++++++-+++++------+++++-----分子在其等電點(diǎn)時(shí)，容易互相吸引，聚合成沉淀；加入鹽離子后，鹽離子吸附于蛋白分子表面，使得蛋白分子與水分子的作用增強(qiáng)且蛋白分子帶相同電荷而互斥，溶解度增大。56HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第56頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分Aggregate蛋白質(zhì)分子表面有水化層，當(dāng)加入鹽時(shí)，這些水分子被抽出，與鹽離子進(jìn)行水合，破壞了蛋白分子表面的水化層，暴露出來的疏水性區(qū)域互相結(jié)合，形成沉淀?！?/p>

鹽析

Salting-out：Ionicstrength溶解度+-+++-----+AmmoniumsulfateSodiumsulfateAlittlesalting-ineffectNH4+SO42-=hydrophobic57HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第57頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分由于各種蛋白質(zhì)表面的極性基團(tuán)和帶電數(shù)目的不同，在蛋白質(zhì)表面的分布也不同，所以溶解度小者先沉淀，溶解度大者后沉淀。利用硫酸銨分級(jí)蛋白質(zhì)就是這個(gè)道理。

硫酸銨濃度與蛋白質(zhì)溶解度的一般關(guān)系返回58HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第58頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2）鹽析法沉淀蛋白質(zhì)的具體操作先要取少量樣品做試驗(yàn)，以確定沉淀我們所需要的蛋白質(zhì)的硫酸銨的濃度范圍，實(shí)際就是繪制硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)圖。

步驟▼取少量預(yù)冷樣品，攪拌下加入固體硫酸銨粉末（或完全飽和的硫酸銨溶液），直到可以看到蛋白質(zhì)沉淀為止，計(jì)算此時(shí)的硫酸銨飽和濃度▼離心分離蛋白質(zhì)，分析上清液，以確定目的蛋白是否存在于上清液中▼如果它不在溶液中，我們就可以明確目的蛋白質(zhì)存在于沉淀中，就可以初步得到我們所需要的目的蛋白質(zhì)，如果它仍然存在于上清液中，則棄掉沉淀，繼續(xù)加硫酸銨于上清液中，直到產(chǎn)生蛋白質(zhì)沉淀為止?再次計(jì)算硫酸銨飽和濃度，離心分離蛋白質(zhì)，分析上清液……

59HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第59頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)圖

返回60HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第60頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3）改良的硫銨分級(jí)法①首先測(cè)定提取液中蛋白質(zhì)總量和目的蛋白的含量。（假定目的蛋白是一個(gè)酶，則可以通過測(cè)定它的活性作為鑒定它的標(biāo)準(zhǔn)）②分級(jí)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)分三個(gè)階段，即三次第一次實(shí)驗(yàn)：尋找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫銨濃度范圍。第二次實(shí)驗(yàn)：進(jìn)一步尋找目的蛋白（酶蛋白）得率高的鹽析濃度范圍，同時(shí)考慮去雜蛋白的濃度范圍。第三次實(shí)驗(yàn)：尋找目的蛋白含量高的鹽析濃度范圍，同時(shí)考慮純化系數(shù)

③分離蛋白質(zhì)61HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第61頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

第一次實(shí)驗(yàn)：

尋找沉淀目的蛋白（酶蛋白）的硫銨濃度范圍結(jié)論：40-80%得率較理想硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-40425＜140-6062222.860-803232180%以上215＜162HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第62頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

第二次實(shí)驗(yàn)：

進(jìn)一步尋找目的蛋白（酶蛋白）得率高的鹽析濃度范圍，同時(shí)考慮去雜蛋白的濃度范圍。

結(jié)論：50-70%飽和度范圍，酶的回收率很高（90%），但純化系數(shù)不理想（2.4）；而第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：40-60%的純化系數(shù)是比較理想的，所以設(shè)計(jì)第三次實(shí)驗(yàn)提高純化系數(shù)。

硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-50632＜150-7090382.470%以上424＜163HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第63頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

第三次實(shí)驗(yàn)：

尋找目的蛋白含量高的鹽析濃度范圍，同時(shí)考慮純化系數(shù)

結(jié)論：選擇沉淀酶的硫銨飽和度范圍為55-65%硫銨百分飽和度（%）沉淀酶%(得率、回收率)沉淀蛋白（%）純化系數(shù)25-551035＜155-657525365%以上1534＜164HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第64頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分上述的實(shí)驗(yàn)▼先用50%飽和度的硫銨沉淀雜質(zhì)，離心除掉▼用65%的硫銨沉淀酶，收集沉淀▼將沉淀重新懸浮于55%的硫銨溶液中，此時(shí)雜蛋白溶解，酶仍是沉淀●收集沉淀

65HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第65頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分硫酸銨沉淀法分離蛋白質(zhì)改良的方法：反抽提法原理：先沉淀較多的蛋白質(zhì)，然后用適當(dāng)?shù)牧蜾@溶液抽提沉淀，去除雜蛋白，而目標(biāo)蛋白仍是沉淀。蛋白質(zhì)很容易從溶液中析出。但過程沒有特異性。從沉淀的形式溶解下來卻比較特異，在一定飽和度的硫銨溶液中，只有那些可以溶解的蛋白質(zhì)才會(huì)溶解出來這也正是反抽提法的優(yōu)點(diǎn)。66HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第66頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分4）鹽析法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

A.

操作簡(jiǎn)便，中性鹽對(duì)易變性的蛋白質(zhì)有一定的保護(hù)作用，使用范圍廣泛

B.

鹽析時(shí)，能除去較多的雜質(zhì)，一般在70%以上，所以純化程度較高

C.

有濃縮蛋白質(zhì)溶液的作用，有利于進(jìn)一步的純化缺點(diǎn)：

A.

分辨能力差

B.純化系數(shù)低返回67HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第67頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分5）鹽析法操作過程中的注意事項(xiàng)▼要有一個(gè)特異的分析方法▼加入硫銨的速度很重要（太快，局部變性；太慢，時(shí)間長(zhǎng)，也會(huì)變性）▼硫銨濃度通常用硫銨飽和溶液（25℃時(shí)為4.1M）的百分?jǐn)?shù)表示▼硫銨溶液pH5.5左右，若目的蛋白質(zhì)易于酸變性，不易用此法●樣品的濃度過大，必須稀釋，一般在2.5-3.0%之間比較合適返回68HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第68頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2.有機(jī)溶劑沉淀法1）原理2）選用有機(jī)溶劑的原則3）有機(jī)溶劑沉淀法的注意事項(xiàng)

回到二69HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第69頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1）原理有機(jī)溶劑會(huì)使溶液的介電常數(shù)減小，從而增強(qiáng)偶極離子之間的靜電引力，使蛋白分子集聚沉淀。有機(jī)溶劑如是水溶性的，本身的水合作用會(huì)破壞蛋白質(zhì)表面的水合層，也促使蛋白質(zhì)分子脫水而沉淀。

70HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第70頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分降低水活性，使溶液的介電常數(shù)下降，增加蛋白質(zhì)溶質(zhì)分子之間的作用力，因而聚集在一起。Membraneprotein■

有機(jī)溶劑沉淀法：Water-solubleprotein溶解度Water-solubleprotein-+++++------+++++-----------++++++++++-+-+++++----+++++------+++++-----有機(jī)溶劑Solvent%=hydrophilic返回71HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第71頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2）選用有機(jī)溶劑的原則

（1）必須能與水完全混溶；（2）不與蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)；（3）要有較好的沉淀效應(yīng)；（4）溶劑蒸氣無毒，且不易燃。（沉淀之后，有機(jī)溶劑需要蒸發(fā)或揮發(fā)掉）目前丙酮和乙醇是應(yīng)用得最為廣泛的有機(jī)溶劑。返回72HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第72頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3）有機(jī)溶劑沉淀法的注意事項(xiàng)▼低溫（0℃±l℃）下進(jìn)行▼0.05mol/L以下的稀鹽溶液▼按蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來調(diào)節(jié)pH值，有利于它們的分離?！襁x擇恰當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)濃度

返回73HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第73頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3.有機(jī)聚合物沉淀法▼水溶性的中性高聚物▼原理與有機(jī)溶劑沉淀法類似▼應(yīng)用最廣泛的是分子量6000和20000的聚乙二醇（PEG）?！褡畲髥栴}是PEG很難從蛋白質(zhì)分級(jí)物中除去?；氐蕉?4HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第74頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分4.選擇性變性沉淀法有些蛋白質(zhì)能忍受極端環(huán)境條件（如高熱或低溫、高pH或低pH等）。將混合物暴露于極端條件下，不想要的蛋白質(zhì)變性沉淀出來，使目的蛋白質(zhì)得到純化變性方法：熱、pH和有機(jī)溶劑變性

回到二75HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第75頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分三蛋白質(zhì)的脫鹽和濃縮

1.脫鹽

1）透析法脫鹽

2）纖維過濾透析法2.濃縮回第三節(jié)76HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第76頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1）透析法脫鹽

將蛋白質(zhì)放入透析袋中將此袋放入水中，或低離子強(qiáng)度的buffer中無機(jī)鹽類和小分子的代謝產(chǎn)物（如ATP、輔酶等），由于擴(kuò)散作用而通過半透膜被除去。77HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第77頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分每次5個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間不停攪拌buffer或水溶液。如一次不能達(dá)到要求，可換新buffer繼續(xù)透析，達(dá)到要求為止。78HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第78頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分新透析袋常被重金屬、蛋白水解酶等污染，需處理。處理的辦法：將透析袋放入0.5mol/LEDTA溶液中煮幾次煮后要用干凈的鑷子和醫(yī)用橡膠手套來拿。返回79HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第79頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2）纖維過濾透析法

對(duì)非常大量的樣品，可以采用纖維過濾透析法用泵使蛋白質(zhì)溶液不斷流經(jīng)超濾膜制成的空心管，管置于透析緩沖液中，用另一泵讓緩沖液不斷在管外流動(dòng)。這樣，由于透析的有效表面積大增，使透析時(shí)間大為縮短因中空纖維超濾膜價(jià)格昂貴，分離稀有貴重蛋白時(shí)用。

返回80HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第80頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2.濃縮1）沉淀法：用鹽析法或有機(jī)溶劑將蛋白質(zhì)沉淀，再將沉淀溶解在小體積溶液中2）離子交換法：使蛋白質(zhì)溶液吸附到離子交換劑上，然后用少量鹽溶液洗脫下來81HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第81頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分向蛋白質(zhì)溶液中加入固體SephadexG－25等吸水劑，它就會(huì)吸去水及一些小分子物質(zhì)吸濾，樣品全部留在濾液中重復(fù)數(shù)次，在很短的時(shí)間里就能將蛋白質(zhì)濃縮到理想的體積范圍。3）干膠吸附法82HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第82頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分將蛋白質(zhì)溶液放入半透膜中，置入一個(gè)密閉體系半透膜內(nèi)的溶液通過管子與大氣相通對(duì)密閉系統(tǒng)慢慢減壓，抽真空，那么水和無機(jī)鹽等小分子就會(huì)流向膜外，蛋白質(zhì)即被很快濃縮，如圖

至5）4）滲透濃縮法83HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第83頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分懸掛的透析袋通大氣、袋外抽空減壓回上一級(jí)

蛋白質(zhì)溶液的超濾84HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第84頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分向密閉容器中充入N2，加壓）方便、迅速、溫和、處理樣品量可大可?。◤?～3mL到幾百升）改進(jìn)的管道式超濾器（以循環(huán)管道代替密閉容器），樣品液可以在管道中循環(huán)流動(dòng)

回到三5）超濾濃縮法85HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第85頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分蛋白質(zhì)溶液的超濾（超濾器）回上頁(yè)將超濾膜放在一個(gè)密閉容器的底部，而樣品液放入密閉容器中，在超濾膜的上面，然后向密閉容器中充入N2，加壓，這樣，水分和一些低分子量的物質(zhì)就通過超濾膜而流出來，而蛋白質(zhì)則留在容器中，通常向密閉系統(tǒng)中加入的壓力大約3–5萬Pa。為防止大分子物質(zhì)堵住膜的孔隙影響流速，常在超濾器的下面裝有攪拌裝置，其中攪拌子懸掛在溶液中，緊靠膜的表面，但又不能和膜接觸，防止破壞膜。86HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第86頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分第四節(jié)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步提純（細(xì)分級(jí)）

回總目錄蛋白質(zhì)的層析分離（一）離子交換層析（二）凝膠過濾層析（三）分配層析（四）親和層析（五）聚焦層析87HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第87頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分層析（chromatography）

原理：溶液中的分子能與固體表面進(jìn)行結(jié)合及解離，但由于蛋白質(zhì)在分子量、帶電性和結(jié)合特異性方面的差異，與固體表面結(jié)合與解離的難易程度不一樣，所以流動(dòng)的速度也不一樣。固定相由圓球形小珠密堆積而成。這些小珠的性質(zhì)決定了可以分離哪種成分流動(dòng)相固定相本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第88頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（一）離子交換層析1、基本原理2、層析條件的選擇3、技術(shù)要點(diǎn)4、離子交換劑的處理和再生5、管柱填裝及管柱系統(tǒng)回第四節(jié)89HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第89頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分離子交換層析（ion-exchangechromatography）

分離所帶電荷不同的物質(zhì)，離子交換的支持物稱為離子交換劑。

離子交換劑：離子交換樹脂（anionexchangeresin）和離子交換纖維素（cationexchangeresin）,如DEAE-cellulose和CM-cellulose。不同的蛋白質(zhì)與交換劑有不同的親和力，因而可用不同鹽濃濃度或pH值的buffer洗脫洗脫示意圖結(jié)合洗脫曲線本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第90頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1、基本原理：依據(jù)不同蛋白質(zhì)所帶電荷量的不同來進(jìn)行分離的A.樣品分子取代平衡離子結(jié)合于交換劑上B．洗脫液離子取代樣品分子下一91HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第91頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分將解離基團(tuán)引入到惰性支持物上形成離子交換層析中的固定相。如果解離基團(tuán)（帶電配體）帶負(fù)電，則能結(jié)合陽(yáng)離子，稱為陽(yáng)離子交換劑；如果解離基團(tuán)帶正電，則能結(jié)合陰離子，稱為陰離子交換劑（如上圖所示離子交換劑）。當(dāng)pH>pI時(shí)，蛋白分子帶負(fù)電，可結(jié)合于陰離子交換劑上；當(dāng)pH<pI時(shí)，蛋白分子帶正電，可結(jié)合于陽(yáng)離子交換劑上。92HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第92頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分電荷密度越大，結(jié)合越牢，在柱中移動(dòng)速度越慢，從柱中被洗脫掉的速度就慢。不同的蛋白所帶電荷不同，對(duì)離子交換劑的結(jié)合力就有差異，提供了分離蛋白質(zhì)混合物的可能性；混合物中的各蛋白分子差異大，易分離；差異小，難分離；沒有差異就不能分離。最根本原理就是依據(jù)不同蛋白質(zhì)所帶電荷量的不同來進(jìn)行的93HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第93頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■陰離子交換法

AnionExchange：載體++++++++++++++++樣本分子流動(dòng)相固定相陽(yáng)離子基團(tuán)Counterion陰離子+94HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第94頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■離子取代優(yōu)先順序PeckingOrder：++++++++++++++++++>>電荷高者離子大者濃度大者>95HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第95頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分離子交換層析（ion-exchangechromatography）本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第96頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■不同膠體的吸著容量有很大差異：DEAE-SephadexA-25DEAE-SephadexA-50DEAE-SepharoseCL-6BDEAE-Sephacel乳白蛋白清蛋白鐵蛋白1911045383110211586214.38.6Buffer:0.01MTris-HCl,pH8.0mg/mLgel97HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第97頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分采用鹽梯度或pH梯度進(jìn)行洗脫。鹽濃度從低到高對(duì)應(yīng)洗下來的就是帶電量從少到多的蛋白質(zhì)。對(duì)帶正電蛋白質(zhì)的洗脫而言，pH梯度要從低到高，對(duì)帶負(fù)電蛋白質(zhì)的洗脫而言，pH梯度要從高到低pH向等電點(diǎn)方向變化，削弱蛋白質(zhì)與交換劑的結(jié)合能力。當(dāng)pH達(dá)到某種分子的等電點(diǎn)（pI）時(shí)，該分子失去電荷，而從交換劑上被洗脫下來。洗脫98HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第98頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■離子交換的梯度溶離有濃縮效果：SaltgradientelutionbeginsSampleapplied99HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第99頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2、層析條件的選擇

（1）交換劑顆粒大小的選擇（2）層析緩沖液的選擇返回100HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第100頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（1）交換劑顆粒大小的選擇粒子大小主要影響分辨率和流速。粗粒子分辨率低，單位體積的交換容量小，但流速較快。細(xì)粒子分辨力高、交換容量大，但是流速慢。細(xì)粒子適于裝小柱，直徑1mm的柱也可以。回到2101HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第101頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（2）層析緩沖液的選擇為避免緩沖液離子參與離子交換過程，它所帶的電荷應(yīng)與離子交換劑所帶電荷相同。使用陽(yáng)離子交換劑時(shí)，要用陰離子型緩沖液（磷酸、醋酸等）；使用陰離子交換劑時(shí)要用陽(yáng)離子型緩沖液（Tris、胺鹽、吡啶等）。102HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第102頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3、技術(shù)要點(diǎn)★柱床體積至少要比樣品的大2～5倍★樣品應(yīng)與起始緩沖液具有相同的pH和離子強(qiáng)度★洗脫速度太快或太慢都會(huì)降低柱的分辨率▲部分收集器每管收集樣品的量，關(guān)系到能否充分表達(dá)層析柱的分辨率

返回103HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第103頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分4、離子交換劑的處理和再生

返回預(yù)處理:dH2O

浸泡2hrsdH2O

洗2MHCl(4V)4hrs2MNaOH(4V)4hrsdH2O

至中性再生:dH2O

洗2MNaCl(2V)

水洗2MHCl(4V)

水洗2MNaOH(4V)

水洗dH2O

至中性104HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第104頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠柱的裝填方法：緩沖液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預(yù)估體積裝填膠體暫停流洗X繼續(xù)流洗加上

reservoir已堆積沉積中上清加壓流洗加上

adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12GelGel5、管柱填裝及管柱系統(tǒng)

105HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第105頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■液相層析管柱系統(tǒng)：緩沖液梯度制造器泵記錄器監(jiān)視器管柱膠體分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapter轉(zhuǎn)接器106HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第106頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（二）凝膠過濾層析

凝膠層析又稱凝膠滲透層析、排阻層析，分子篩層析等。它主要用于分離分子大小不同的的樣品。凝膠層析設(shè)備簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，每次層析后無需再生處理，因此在生化研究中應(yīng)用極其廣泛?；氐谒墓?jié)1、基本原理2、凝膠層析的介質(zhì)3、凝膠過濾的操作及應(yīng)用107HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第107頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1、基本原理凝膠層析載體是多孔凝膠。當(dāng)溶質(zhì)通過層析柱時(shí)，分子直徑比凝膠孔徑大的分子，不能進(jìn)入凝膠顆粒的微孔里，只能隨溶劑一起移動(dòng)的，最先流出柱外；分子直徑比凝膠孔徑小的分子，即進(jìn)入凝膠相內(nèi)，延長(zhǎng)了路徑，向下移動(dòng)的速度落后于大分子。這種情況如下圖所示。

108HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第108頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■裝于柱中的凝膠支持物及某些層析參數(shù)示意圖

樣本固定相流動(dòng)相小分子被延滯小分子大分子依據(jù)分子大小、形狀較快流出返回109HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第109頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2、凝膠層析的介質(zhì)

對(duì)凝膠層析支持物的要求是：第一：要有惰性，即凝膠介質(zhì)與溶質(zhì)不發(fā)生任何作用；第二：離子基團(tuán)含量要低，即所帶電荷要盡可能低；第三：凝膠顆粒的孔度和大小要均一；第四：凝膠顆粒和孔度大小的選擇范圍要寬，能適應(yīng)各種不同大小的分子的分離；第五：機(jī)械強(qiáng)度要高?，F(xiàn)在有3種介質(zhì)在不同程度上滿足這些要求。返回110HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第110頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分膠體的種類:

葡聚糖凝膠用1,2-環(huán)氧氯丙烷作交聯(lián)劑,將由葡萄糖經(jīng)-1,6糖苷鍵結(jié)合而成的線性葡聚糖聚合成高分子聚合物。商品名為Sephadex(G-10200共8種)

瓊脂糖凝膠

由D-半乳糖和3,6-脫水L-半乳糖相間結(jié)合形成的多糖,是將瓊脂中的瓊脂膠除去而得到的。商品名為Sepharose(2B、4B和6B)。

聚丙烯酰胺凝膠丙烯酰胺經(jīng)交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺聚合而成的高分子聚合物。商品名為Bio-gel(P2-300)111HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第111頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■各種層析膠體：PharmaciaBio-RadSephadexSepharoseSephacrylSephacelBioGelPBioGelAglucose(dextrose)agaroseglucose+acrylamidecelluloseacrylamideagaroseFPLCSuperose,SuperdexMonoQ,MonoS112HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第112頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠體的構(gòu)成：Sephadexglucoseunit過濾空間113HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第113頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠體的使用范圍：

SephadexG：●

分子量由數(shù)萬至數(shù)十萬膠體容易被壓扁1g→20mLgel1g→7.5mL(骨架較稀)Smallproteins114HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第114頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠體過濾法的膠球：115HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第115頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■管柱內(nèi)膠體的組成區(qū)間：VtVoVt-

Vo管柱總體積膠體外體積膠體內(nèi)體積流動(dòng)相固定相116HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第116頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

凝膠上柱后，顆粒外的外水體積（Vo），顆粒內(nèi)體積稱內(nèi)水體積（Vi），顆粒中膠的體積（Vg），因而，總的柱床體積（Vt），Vt=Vo+Vi+Vg，Vg可忽略。Vt=Vo+Vi

。

當(dāng)進(jìn)行洗脫時(shí)，某一溶質(zhì)的洗脫體積（Ve）就取決于Vo，Vi和在兩相中的分配系數(shù)（kd）

Ve=Vo+kd·Vi

本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第117頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分①當(dāng)kd=0時(shí)，Ve=Vo，溶質(zhì)全從Vo

出來，無分配。②當(dāng)kd=1時(shí)，Ve=Vo+Vi，溶質(zhì)全進(jìn)篩子，各物質(zhì)盡管有分配，但各物質(zhì)不能分開。③當(dāng)0<kd<1時(shí),Ve=Vo+kd·Vi各溶質(zhì)具不同分配，以得到分離。

若已知某一物質(zhì)的kd，可據(jù)上式計(jì)算它的洗脫體積（Ve）也可用溶質(zhì)洗脫峰處的洗脫體積來測(cè)量。用此法來分離介質(zhì)是以下述三種形式來描述的：本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第118頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■凝膠過濾的溶離圖譜：XYZEEnzymeactivityNaClVo之前不應(yīng)有物質(zhì)溶離出來Vt之后不應(yīng)有物質(zhì)溶離出來目標(biāo)酶

(E)最好不要落在主要蛋白質(zhì)峰(Y)的范圍內(nèi)ElutionVolume(mL)AVoVeVt0119HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第119頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠體粒子的粗細(xì)會(huì)影響溶離液的流動(dòng)：膠體的顆粒越小其解析力越大

但流速變慢120HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第120頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■層析管柱的形狀：10cm230cm10cm30cm2300cm3矮胖型細(xì)長(zhǎng)型●

矮胖型管柱不能容忍分離不佳

其流速及容量均較大121HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第121頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3、凝膠過濾的操作及應(yīng)用Sephadex柱高度約需1m，Sephacryl柱高度可為0.7m。分離大分子時(shí)，柱床體積應(yīng)為上樣體積的25～100倍，柱高與直徑之比為20：1～100：1。裝柱要在攪拌下連續(xù)操作，一氣呵成。122HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第122頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■膠柱的裝填方法：緩沖液平衡溫度平衡靜置膠體清洗膠體預(yù)估體積裝填膠體暫停流洗X繼續(xù)流洗加上

reservoir已堆積沉積中上清加壓流洗加上

adaptor緊密堆積檢查好管柱是否暢通12GelGel123HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第123頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■層析管柱系統(tǒng)：緩沖液梯度制造器泵記錄器監(jiān)視器管柱膠體膠體裝填分部收集器(1)(2)(3)(4)(5)adapterreservoir轉(zhuǎn)接器124HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第124頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

極性相似的兩分子間，其親和力較強(qiáng)。極性

→

極性非極性

→

非極性LikeDissolvesLike（三）分配層析法

125HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第125頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3.1

分配層析法的演示過程：圓形濾紙長(zhǎng)條濾紙薄層層析(TLC)柱狀層析容量變大容量更大加展開液Paperpartitionchromatography(PPC)126HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第126頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分一個(gè)

板數(shù)■分配層析法的板數(shù)概念：BBBBBBBBBBBAAAAAAAAAAAAAAAAAAAABBBBBBBBBB8020109064161916498151130131873極性非極性100A+100B127HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第127頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■薄層層析法操作：Thin-layerchromatography薄層板點(diǎn)好樣本加展開液樣本展開128HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第128頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（四）親和層析

回第四節(jié)★親和層析是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子與其配體之間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)?！镉H和層析從理論上講，能產(chǎn)生一個(gè)絕對(duì)的純化作用，因此，可達(dá)到很高的純度?！锓蛛x快速，對(duì)分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)極為有效。129HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第129頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■親和層析法的作用機(jī)理：固相載體(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB親和基團(tuán)配體XBAA130HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第130頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分親和層析（affinitychromatography）本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第131頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分

競(jìng)爭(zhēng)性洗脫改變離子強(qiáng)度洗脫

PH洗脫變性劑洗脫打斷配體化學(xué)鍵洗脫洗脫方法132HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第132頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分1、載體親和層析的載體多為凝膠，可分成兩類：一是大網(wǎng)孔型，如瓊脂糖凝膠其大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)容許大分子自由進(jìn)出凝膠；二是微孔型，如交聯(lián)葡聚糖凝膠和聚丙烯酸胺凝膠，其小網(wǎng)孔型的立體結(jié)構(gòu)使大分子排阻在凝膠顆粒之外。

基質(zhì)載體:CelluloseSephadexBio-gelBio-glassSepharose133HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第133頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分2、配體★專一性結(jié)合，且親和力越大越好；★結(jié)合后又能解離，而且，無損于生物大分子的生物活性；▲適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)，把配體偶聯(lián)到載體上，且不損害配體與生物大分子的專一性結(jié)合。

配體是親和層析中最重要成分。選擇好的配體有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：134HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第134頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分用于親和層析的配體：配體:

競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑輔酶底物金屬離子(CuNiMnZn)

染料135HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第135頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分3、“手臂”的作用下圖形象地說明了載體空間位阻的影響和“手臂”對(duì)親和吸附的作用。

A.無法“吻合”；B．借助“手臂”完全“吻合”載體載體136HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第136頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分親和層析中使用最多的“手臂”是NH2－（CH2）n-R類化合物。R可以是羧基、氨基、也可以就是配體。要使配體和互補(bǔ)生物大分子的相互作用處于最佳狀態(tài)，“手臂”中亞甲基的數(shù)目至少是4～6個(gè)，常用的長(zhǎng)度是6～10個(gè)。137HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第137頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分Activity■4典型的親和層析操作：ElutionvolumeProteinpH2.05*138HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第138頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■專一性結(jié)合力量的構(gòu)成因素：I.ConformationalMatch:VanderwaalsinteractionII.InteractionForces:(1)Hydrogenbond(2)Hydrophobicinteraction(3)Electrostaticinteraction(4)Vanderwaalsinteraction+Kd兩分子間因構(gòu)形互補(bǔ)所造成的吸引力是由范德華力所貢獻(xiàn)+-=O…H-N-139HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第139頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■構(gòu)形互補(bǔ)所造成的吸引力：VanderWaalinteractionsbetweennon-polarsurfacesvdwvdw范德華鍵數(shù)目夠多即足以造就親和力140HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第140頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■各種親和性介質(zhì)及其專一性基團(tuán)：免疫吸附劑，大多自行合成

單株抗體純化對(duì)

a-D-葡萄糖、甘露糖基有專一性

HeparinSepharoseCL-6BBlueSepharoseCL-6B5'AMP-,2',5'ADP-Sepharose4B用來純化

lectin酶的專一性結(jié)合Oligo(dT)-cellulose配體

親和性分子

說明(還有更多其它親和配體及介質(zhì))Oligo(dT)抗體

底物或抑制劑ProteinConAHeparinCibacron-BlueAMP,ADP單糖及衍生物對(duì)應(yīng)的酶對(duì)應(yīng)的抗原LectinNAD(P)+結(jié)合酶NAD(P)+結(jié)合酶mRNA部分IgG糖蛋白凝血蛋白等Pharmacia141HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第141頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■金屬螯合層析法：Ni

固相載體HisHisHisProteinMetalChelateAffinityChromatographyimidazole咪唑elution-O-C-C-C-O-C-C-C-NOHC-COOHC-COOHOH142HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第142頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■親和層析法實(shí)例的原始材料：載體Chitin配體CHOM雞蛋粘多糖蛋白胰蛋白脢的抑制劑目標(biāo)分子TrypsinOOCH2OHOH

NH2OOCH2OHOH

NHO=CH3143HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第143頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分■以親和層析法純化

Trypsin：CHOMTrypsinABC&D以凝膠電泳檢測(cè)親和層析操作過程各步驟的樣本Chitin144HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第144頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分★若只有一種待分離的物質(zhì)吸附在柱上，選用一種合適的緩沖液進(jìn)行洗脫即可?！锶敉瑫r(shí)有幾種物質(zhì)吸附在柱上，而且彼此親和力相差較大，可用階段洗脫方式進(jìn)行洗脫。

★若彼此親和力相差很小時(shí)，則必須采用梯度洗脫方式進(jìn)行層析分離。非專一性洗脫通過改變緩沖液的離子強(qiáng)度或者pH或者介電常數(shù)或者同時(shí)改變其中的兩種因素，使吸附的大分子的構(gòu)象發(fā)生改變，以降低其與配體間的親和力，從而將其從柱上洗下。145HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第145頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分配制專一性洗脫劑的原則是：①洗脫液中的游離配體最好與固定化配體不同；②洗脫液中的配體應(yīng)對(duì)欲分離物質(zhì)有較高的親和力；③洗脫液中游離配體的濃度要視固定化配體與待分離物的親和力而定。親和力大，所用濃度大；親和力弱，所用濃度低。

專一性洗脫采用含有待分離物質(zhì)配體的緩沖液進(jìn)行洗脫146HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第146頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分蛋白質(zhì)在親和層析柱上的吸附和洗脫條件147HubeiUniversity本文檔共180頁(yè)；當(dāng)前第147頁(yè)；編輯于星期三\8點(diǎn)21分（五）聚焦層析

Chromatofocusing

優(yōu)點(diǎn)：①pH梯度自動(dòng)產(chǎn)生，省去了梯度混合裝置，因此所用儀器設(shè)備簡(jiǎn)單；②有聚焦效應(yīng)，能產(chǎn)生很窄的分離區(qū)帶，峰寬度可達(dá)