第三章生物材料的預(yù)處理和液固分離

第一節(jié)生物材料的預(yù)處理第二節(jié)細(xì)胞破碎第三節(jié)液－固分離本文檔共37頁；當(dāng)前第1頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分生物活性物質(zhì)來源動(dòng)物植物微生物組織、器官、細(xì)胞及代謝產(chǎn)物存在方式：胞內(nèi)和胞外第一節(jié)生物材料的預(yù)處理本文檔共37頁；當(dāng)前第2頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分一確定預(yù)處理方法的依據(jù)1生物活性物質(zhì)存在方式與特點(diǎn)生物活性物質(zhì)存在部位與它的生物活性密切相關(guān)生物活性物質(zhì)來源、存在狀態(tài)“胞內(nèi)”、“胞外”、前體生物材料中的化學(xué)組成十分復(fù)雜生物活性物質(zhì)在生物材料中含量較低，雜質(zhì)含量高，而且生理活性愈高的成分，含量往往愈低如胰島素在胰臟中的含量為0.02%，膽汁中膽紅素含量為0.05~0.08%生物活性物質(zhì)的存在方式與其生物功能密切相關(guān)，一般情況下，可以根據(jù)活性物質(zhì)的生物功能推斷其存在部位和分布方式本文檔共37頁；當(dāng)前第3頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分可被材料中酶、微生物破壞，還可能受酸、堿、鹽、重金屬離子、機(jī)械攪拌、溫度、甚至空氣和光線作用改變活性2后續(xù)工藝要求3目的物穩(wěn)定性經(jīng)過預(yù)處理和固－液分離后，一般要求得到濾液澄清、pH適中、有一定濃度的目的生物活性物質(zhì)如后續(xù)采用離子交換方法處理，則對(duì)濾液中無機(jī)離子、灰分含量、澄清度方面要求較高；如采用溶劑萃取，則要求蛋白質(zhì)含量較低，以減輕乳化現(xiàn)象；如采用結(jié)晶方法，則還需要經(jīng)過脫色處理本文檔共37頁；當(dāng)前第4頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分絞肉機(jī)將事先切成小塊的組織絞碎形成組織糜許多蛋白和酶可以從顆粒較粗的組織糜中提取出來一般情況下：先用粗孔徑的絞，再用細(xì)孔徑的絞，有時(shí)可能還需要多次進(jìn)行用絞肉機(jī)，一般細(xì)胞并不破碎，一些胞內(nèi)產(chǎn)物不能有效地提取，須通過特殊的勻漿才行實(shí)驗(yàn)室常用玻璃勻漿器和組織搗碎器，工業(yè)上可用高壓勻漿器二動(dòng)物材料的預(yù)處理本文檔共37頁；當(dāng)前第5頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分（一）預(yù)處理的目的三發(fā)酵液（細(xì)胞培養(yǎng)液）的預(yù)處理2去除發(fā)酵液（培養(yǎng)液）中部分雜質(zhì)以利于后續(xù)各步操作1改變發(fā)酵液（培養(yǎng)液）的物理性質(zhì)，以利于固-液分離主要方法有：加熱、凝聚與絮凝、使用助濾劑培養(yǎng)液中主要含有2類物質(zhì)：可溶性膠狀物質(zhì)

無機(jī)鹽類可溶性膠狀物質(zhì)：核酸、雜蛋白、不溶性多糖，這些雜質(zhì)不僅使培養(yǎng)液粘度增加，液固分離速度受影響，而且還會(huì)影響后續(xù)的分離純化操作無機(jī)鹽類：不僅影響成品質(zhì)量，而且在采用離子交換法提取時(shí)，由于樹脂大量吸附無機(jī)離子而減少對(duì)目的物的交換本文檔共37頁；當(dāng)前第6頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分加熱是最簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理方法，即把發(fā)酵液（培養(yǎng)液）加熱到所需溫度并保溫適當(dāng)時(shí)間。加熱能使雜蛋白變性凝固，從而降低發(fā)酵液（培養(yǎng)液）的粘度，使固液分離變得容易。但加熱的方法只適合對(duì)熱穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)

（二）細(xì)胞及蛋白質(zhì)的處理1變性沉淀蛋白變性的其它方法：大幅度改變pH，加有機(jī)溶劑（丙酮、乙醇等）、重金屬鹽（如Ag＋、Cu2＋、Pb2＋等）和表面活性劑天然蛋白質(zhì)分子受到某些物理的或化學(xué)的因素影響時(shí)生物活性喪失、溶解度降低、不對(duì)稱性增高以及其他的一些物理化學(xué)常數(shù)發(fā)生變化，這個(gè)過程就稱為變性作用本文檔共37頁；當(dāng)前第7頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分2凝聚和絮凝凝聚和絮凝預(yù)處理對(duì)象細(xì)小菌體或細(xì)胞（分泌胞外產(chǎn)物）、細(xì)胞的碎片以及蛋白質(zhì)等膠體粒子的去除培養(yǎng)中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體顆粒的表面一般都帶有電荷，帶電原因很多，主要是吸附溶液中的離子或自身基團(tuán)的電離膠粒能保持分散狀態(tài)的原因是帶有相同電荷，一旦布朗運(yùn)動(dòng)使離子間距離縮小到它們的擴(kuò)散層而部分重疊時(shí)，即產(chǎn)生排斥作用，使兩個(gè)離子分開，從而阻止了粒子的聚集膠體能穩(wěn)定存在的另一個(gè)原因是其表面的水化作用，即形成了離子周圍的水化層，阻礙膠粒間的直接聚集處理過程將一定的化學(xué)藥劑預(yù)先投加到培養(yǎng)液，改變細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，破壞其穩(wěn)定性，使它們聚集成可分離的絮凝體，再進(jìn)行分離本文檔共37頁；當(dāng)前第8頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分凝聚劑主要是一些無機(jī)類電解質(zhì)，由于大部分被處理的物質(zhì)帶負(fù)電荷（如細(xì)胞或菌體一般帶負(fù)電荷），因此工業(yè)上常用的凝聚劑大多為陽離子型，分為無機(jī)鹽類、金屬氧化物類凝聚凝聚是指在某些電解質(zhì)作用下，破壞細(xì)胞、菌體和蛋白質(zhì)等膠體粒子的分散狀態(tài)，使膠體粒子聚集的過程常用的無機(jī)鹽類凝聚劑Al2（SO4）3·18H2O（明礬）AlCl3·6H2OFeCl3ZnSO4MgCO3常用的金屬氧化物類凝聚劑Al(OH)3Fe3O4Ca(OH)2石灰等膠體是物質(zhì)以一定分散程度而存在的一種狀態(tài)。即將一物質(zhì)分成許多小粒子，然后分散在一種介質(zhì)中即可得到一種分散體系。在這種分散體系中，粒子叫分散質(zhì)(或分散相)，介質(zhì)叫分散劑(或分散介質(zhì))當(dāng)分散質(zhì)的直徑在0.1μm～1nm之間，這個(gè)體系就叫膠體。膠體按分散質(zhì)和分散劑聚態(tài)的不同可分為許多種本文檔共37頁；當(dāng)前第9頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分

在發(fā)酵液中加入具有相反電性的電解質(zhì)：①中和膠粒電性，降低雙電層排斥力②離子的水化作用，破壞膠粒的水化層影響凝聚作用的主要因素

無機(jī)鹽的種類、化合價(jià)以及無機(jī)鹽的用量等陽離子對(duì)帶負(fù)電荷的膠粒凝聚能力的次序?yàn)椋?/p>

Al3+>Fe3+>H+>Ca2+>Mg2+>K+>Na+>Li+

無機(jī)鹽促進(jìn)膠粒顆粒凝聚的原因：本文檔共37頁；當(dāng)前第10頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分

絮凝影響絮凝效果的因素絮凝劑的分子量絮凝劑用量溶液pH攪拌速度時(shí)間等絮凝劑具有長(zhǎng)鏈線狀的結(jié)構(gòu)，易溶于水，其分子量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，在長(zhǎng)的鏈上含有相當(dāng)多的活性功能團(tuán)當(dāng)往膠體懸液中加入絮凝劑時(shí)，膠粒可強(qiáng)烈地吸附在絮凝劑表面的活性功能團(tuán)上，而且一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的顆粒的表面上，產(chǎn)生架橋聯(lián)接，形成粗大的絮凝團(tuán)沉淀出來，有助于過濾，這一過程稱為絮凝作用絮凝是指使用絮凝劑（通常是天然或合成的大分子量電解質(zhì)），在懸浮粒子之間產(chǎn)生架橋作用而使膠粒形成粗大的絮凝團(tuán)的過程本文檔共37頁；當(dāng)前第11頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分影響絮凝劑絮凝效果的因素絮凝劑分子量：分子量越大，鏈越長(zhǎng)，吸附架橋效果就越明顯；但是分子量過大，絮凝劑在水中的溶解度降低絮凝劑濃度：濃度較低時(shí)，增加用量有助于架橋，提高絮凝效果；但是濃度過高反而引起吸附飽和，在膠粒表面上形成覆蓋層而失去與其他膠粒架橋的作用，降低了絮凝效果本文檔共37頁；當(dāng)前第12頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分溶液的pH：pH的變化會(huì)影響離子型絮凝劑功能團(tuán)的電離度，提高電離度可使鏈分子上同種電荷間的電排斥作用增加，鏈從卷曲狀態(tài)變?yōu)樯煺範(fàn)顟B(tài)，發(fā)揮最佳架橋能力攪拌速度：剛加入絮凝劑時(shí)，攪拌速度快能使絮凝劑迅速分散，發(fā)揮絮凝作用，但當(dāng)絮凝團(tuán)形成后，高的剪切力會(huì)打碎絮凝團(tuán)本文檔共37頁；當(dāng)前第13頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分常用的絮凝劑殼聚糖、海藻酸鈉、明膠和酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物及聚丙烯酸類等本文檔共37頁；當(dāng)前第14頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分3去除雜蛋白質(zhì)的其它方法

等電點(diǎn)沉淀

蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最小，能沉淀而除去各種沉淀劑沉淀某些化學(xué)試劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物沉淀在酸性溶液中加有機(jī)酸如三氯乙酸、水楊酸、苦味酸、鞣酸、過氯酸等形成沉淀；在堿性溶液中，能與一些陽離子如Ag+、Cu2+、Zn2+、Pb2+、Fe3+形成沉淀吸附在發(fā)酵液中，加入一些反應(yīng)劑，它們互相反應(yīng)生成的沉淀物對(duì)蛋白質(zhì)具吸附作用而使其凝固加入吸附劑如活性碳，可以去除熱原本文檔共37頁；當(dāng)前第15頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分（三）不溶性多糖的去除黏多糖的去除黏多糖可以和一些陽離子表面活性劑如十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）和十六烷基氯化吡啶（CPC）等形成季銨鹽絡(luò)合物而沉淀，因而可以通過向培養(yǎng)液中引入這些物質(zhì)使多糖沉淀去除當(dāng)發(fā)酵液中含有較多不溶性多糖時(shí)，粘度增大，液固分離困難，可用酶將它轉(zhuǎn)化為單糖以提高過濾速度

例如在蛋白酶發(fā)酵液加α－淀粉酶，將培養(yǎng)基中多余的淀粉水解稱單糖，就能降低發(fā)酵液粘度，提高濾速本文檔共37頁；當(dāng)前第16頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分（四）高價(jià)金屬離子的去除對(duì)提取和成品質(zhì)量影響較大的無機(jī)雜質(zhì)主要是Ca2＋、Mg2＋、Fe3＋等高價(jià)金屬離子，尤其在后期采用離子交換法時(shí)，這些離子會(huì)降低樹脂的交換容量，預(yù)處理中應(yīng)將它們除去鈣離子：常采用草酸鈉或草酸鎂離子：去除也可用草酸，但草酸鎂溶解度較大，故沉淀不完全，也可采

用磷酸鹽，使生成磷酸鈣鹽和磷酸鎂鹽沉淀而除去鐵離子：可采用黃血鹽，形成普魯士蘭(亞鐵氰化鐵)沉淀離子交換法和沉淀法本文檔共37頁；當(dāng)前第17頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使胞內(nèi)產(chǎn)物得到最大程度的釋放目的影響細(xì)胞破碎的因素：1細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)2破碎方法第二節(jié)細(xì)胞破碎本文檔共37頁；當(dāng)前第18頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分一細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁主要由肽聚糖層（約20－80nm）組成革蘭氏陰性菌肽聚糖層較薄，僅2－3nm，在肽聚糖層外還有兩層外壁層。外壁層約8－10nm可見革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁較厚，較難破碎！本文檔共37頁；當(dāng)前第19頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分霉菌的細(xì)胞壁較厚，約100－250nm酵母的細(xì)胞壁比革蘭氏陽性菌的細(xì)胞壁厚，更難破碎本文檔共37頁；當(dāng)前第20頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分機(jī)械法勻漿法珠磨法超聲波化學(xué)法

化學(xué)試劑處理

酶解法制成丙酮粉物理法干燥凍融滲透壓沖擊二破碎方法本文檔共37頁；當(dāng)前第21頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分機(jī)械法高壓勻漿法：適用于酵母菌、大腸桿菌、巨大芽孢桿菌和黑曲霉等。不適用于高度分枝的微生物高速珠磨法：利用玻璃小珠與細(xì)胞懸液一起快速攪拌，由于研磨作用，使細(xì)胞破碎超聲波破碎法：實(shí)驗(yàn)室常用影響因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時(shí)間等本文檔共37頁；當(dāng)前第22頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分FrenchPress壓榨

壓榨是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高壓下使幾十毫升的細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。這是一種較理想的破碎細(xì)胞的方法，但儀器費(fèi)用較高本文檔共37頁；當(dāng)前第23頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分超聲波振蕩器本文檔共37頁；當(dāng)前第24頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分`^非機(jī)械法化學(xué)法：采用化學(xué)試劑處理細(xì)胞，溶解細(xì)胞或抽提細(xì)胞組分酶解法：利用酶（溶菌酶、蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等）反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵，以達(dá)破壁的目的需與其它方法配合使用（輻射、滲透壓沖擊、反復(fù)凍融法等）

途徑：在細(xì)胞懸液中加酶或采用自溶作用;

自溶作用：利用微生物自身產(chǎn)生的酶來溶菌，而不需外加其它的酶

自溶的方法：加熱法、干燥法滲透壓沖擊法：先把細(xì)胞放在高滲溶液中，由于滲透壓作用，細(xì)胞內(nèi)水分向外滲出，細(xì)胞發(fā)生收縮，當(dāng)達(dá)到平衡后，將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中，由于滲透壓發(fā)生突然變化，胞外的水分迅速滲入胞內(nèi)，使細(xì)胞快速膨脹而破裂凍融法：將細(xì)胞放在低溫（-15℃），然后在室溫中融化，反復(fù)多次，細(xì)胞壁破裂干燥法：經(jīng)干燥后的菌體，其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化，同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí)，胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來

方法：空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥化學(xué)法1用堿處理2用脂溶性有機(jī)溶劑3表面活性劑4制成丙酮粉堿處理：可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分，酸堿還可以調(diào)節(jié)溶液的pH，改變細(xì)胞所處的環(huán)境，從而改變蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)，使蛋白質(zhì)之間或蛋白與其他物質(zhì)之間的作用力降低而易于溶解到液相中去，便于后面的提取脂溶性有機(jī)溶劑：如丁醇、丙酮等，它們能溶解細(xì)胞膜上的脂類化合物，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，而將胞內(nèi)產(chǎn)物抽提出來表面活性劑：常能引起細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來制成丙酮粉：組織經(jīng)丙酮脫水干燥制成丙酮粉，不僅可以減少酶的變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的破碎使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合的某些化學(xué)鍵打開，促使某些結(jié)合酶釋放到溶液中本文檔共37頁；當(dāng)前第25頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分細(xì)胞破碎率定義為被破碎細(xì)胞的數(shù)量占原始細(xì)胞數(shù)量的百分比數(shù)，即：

Y(%)=[(N0-N)/N0]×100

N0－原始細(xì)胞數(shù)量

N－經(jīng)t時(shí)間操作后保留下來的未損害完整細(xì)胞數(shù)量三破碎率的評(píng)價(jià)目前N0和N主要通過下面的方法獲得：直接計(jì)數(shù)法

在血球計(jì)數(shù)板用顯微鏡觀察，直接對(duì)適當(dāng)稀釋后的樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)間接計(jì)數(shù)法

間接計(jì)數(shù)法是在細(xì)胞破碎后，測(cè)定懸浮液中細(xì)胞釋放出來的化合物的量（例如可溶性蛋白、酶等）具體操作：將破碎后的細(xì)胞懸浮液離心分離掉固體（完整細(xì)胞和碎片），然后用Lowry法測(cè)量上清中的蛋白質(zhì)含量本文檔共37頁；當(dāng)前第26頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分高壓均漿和高速珠磨兩種機(jī)械破碎方法，處理量大，速度非?？?，目前在工業(yè)生長(zhǎng)上應(yīng)用最廣泛。但在機(jī)械法破碎過程中，容易產(chǎn)生大量的熱量，使料液溫度升高，而易造成生化物質(zhì)的破壞，特別是在超聲波處理時(shí)，因此，超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎

非機(jī)械法一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用滲透壓沖擊和凍結(jié)－融解法都屬于較溫和的方法，但破碎作用較弱它們常與酶解法結(jié)合起來使用，提高破碎效果干燥法屬于較激烈的一種破碎方法，容易引起蛋白質(zhì)或其它組分變性四各種破碎方法的評(píng)述本文檔共37頁；當(dāng)前第27頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分細(xì)胞破碎方法綜合比較本文檔共37頁；當(dāng)前第28頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分本文檔共37頁；當(dāng)前第29頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分處理量規(guī)模及成本高壓勻漿和珠磨機(jī)處理量大，速度快，適用于工業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)物對(duì)破碎條件（溫度、化學(xué)試劑、酶等）的敏感性以及產(chǎn)物在細(xì)胞中的位置生化物質(zhì)的穩(wěn)定性細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度破碎效果和產(chǎn)物釋放率提取分離的難易

五破碎方法的選擇依據(jù)總之，適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后續(xù)提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡本文檔共37頁；當(dāng)前第30頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分固液分離將發(fā)酵液（或培養(yǎng)液）中的懸浮固體，如細(xì)胞、菌體、細(xì)胞碎片以及蛋白質(zhì)等的沉淀物分離除去第三節(jié)液—固分離本文檔共37頁；當(dāng)前第31頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分料液流向平行于過濾介質(zhì)（過濾介質(zhì)通常為微孔膜或超濾膜）（一）

常規(guī)過濾料液流動(dòng)方向與過濾介質(zhì)（能使固液混合料液得以分離的某一介面）垂直（二）錯(cuò)流過濾一過濾本文檔共37頁；當(dāng)前第32頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分錯(cuò)流過濾的優(yōu)點(diǎn)過濾收率高由于過濾過程中，洗滌充分、合理，少量多次，故濾液稀釋量不大的情況下，獲得高達(dá)97～98％的收率濾液質(zhì)量好凡體積大于膜孔的固體，包括菌體、培養(yǎng)基、雜蛋白等均不能通過膜進(jìn)入濾液，大部分雜質(zhì)被排除掉，給后續(xù)分離及最終產(chǎn)品質(zhì)量均帶來好處減少處理步驟鼓式真空過濾器一般需預(yù)涂助濾劑，板框過濾則需清洗、拆裝，都費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而錯(cuò)流過濾只需在18～20小時(shí)連續(xù)操作之后，用清水沿原管流洗4～6小時(shí)對(duì)染菌罐易于批處理，也容易擴(kuò)大生產(chǎn)本文檔共37頁；當(dāng)前第33頁；編輯于星期三\10點(diǎn)15分（三）過濾設(shè)備：板框過濾機(jī)特點(diǎn)：板框壓濾機(jī)的過濾面積大，能耐受較高壓力差，對(duì)不同過濾特性的料液適應(yīng)性強(qiáng)，同時(shí)還具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，造