章植物原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交演示文稿

章植物原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交演示文稿本文檔共51頁；當前第1頁；編輯于星期一\18點20分（優(yōu)選）第九章植物原生質體培養(yǎng)與體細胞雜交本文檔共51頁；當前第2頁；編輯于星期一\18點20分二、原生質體的分離1.材料的選取

根、莖、葉、花、果實、種子及愈傷組織和懸浮細胞等都可作為分離原生質體的材料。但要獲得高質量的原生質體，應選用生長旺盛、生命力強的組織。材料的生理狀態(tài)是原生質體質量的決定因素之一，實踐證明水肥條件、生長季節(jié)、植物年齡、光照等都顯著影響原生質體的獲得和活力。用懸浮細胞為材料時應每隔3-5天繼代一次，使細胞處于旺盛生長狀態(tài)。一般在繼代后的第三天分離原生質體。用葉片作材料時，一般選用剛展開的幼嫩葉片。此外植物生長的濕度、溫度等條件對原生質體的分離效果也的明顯的影響。如生長在相對濕度為70%，溫度為26度的蕓苔葉片只能得到少量不能持續(xù)分裂的原生質體，而在相對濕度為40-45%，溫度為19-21度條件下生長的葉片可得到理想的原生質體。本文檔共51頁；當前第3頁；編輯于星期一\18點20分

植物細胞壁是由纖維素（25%~50%）、半纖維素（50%左右）、果膠質（5%）組成。因此常用三種相應的酶來降解細胞壁。一般認為纖維素酶和果膠酶是必需的，有些材料要加半纖維素酶。商品酶制劑常含有雜質，對原生質體有不良影響，有時要純化。常用的方法是將酶液在4oC下過Bio-GelP6或SephadexG-25。2、酶的種類本文檔共51頁；當前第4頁；編輯于星期一\18點20分常用的商品酶制劑：纖維素酶類（主要來源于綠色木霉）

纖維素酶EA-867（中國）(Tricodermaviride)CellulaseOnzukaR-10（Japan）CellulaseOnzukaRS（Japan）Cellulase（Sigma）Cellulysin（USA）

果膠酶類（主要來源于黑曲霉）

PectolyaseY23（Japan）MacerozymeR-10（Japan）Macerozyme（Japan）Pectinase（Sigma）Pectinal（USA）本文檔共51頁；當前第5頁；編輯于星期一\18點20分

如果溶液的滲透壓和細胞內的滲透壓不同，原生質體有可能被漲破或收縮。因此在酶液、洗滌液和培養(yǎng)液中滲透壓應和原生質體內的相等或略大一些。廣泛使用的滲透壓調節(jié)劑是山梨醇和甘露醇，此外還有蔗糖、葡萄糖、和麥芽糖，濃度約在0.40~0.80mol/L。加入CaCl2、KH2PO4等能夠提高原生質膜的穩(wěn)定性，增加完整原生質體的數(shù)目和活力。3、滲透壓的調控本文檔共51頁；當前第6頁；編輯于星期一\18點20分4、原生質體的游離（1）材料的預處理：有些材料經預處理后可提高原生質體分裂的頻率，如暗處理、預培養(yǎng)、低溫處理等。（2）

材料的滅菌：除試管苗、培養(yǎng)細胞等外，材料要進行表面滅菌。

（3）酶解處理：酶的選擇因材料而異，愈傷和懸浮細胞用活性較強的酶，且酶的濃度也要大一些；葉片等材料酶濃度可小一些。pH值一般調在5.6~5.8，酶解處理一般靜止暗中進行，懸浮細胞和愈傷組織則要置搖床低速振蕩。酶解時間5~24h，溫度一般為250C。本文檔共51頁；當前第7頁；編輯于星期一\18點20分滅菌試劑濃度（%）去除時間（min）效果次氯酸鈉2易5~30很好次氯酸鈣9~10易5~30很好過氧化氫10~12最易5~15好二氯化汞0.1~1.0較難5~15最好乙醇70~75易5~30秒好

常用的滅菌試劑本文檔共51頁；當前第8頁；編輯于星期一\18點20分

5、原生質體收集與純化

通常用過濾和離心相結合的方法收集與純化。（1）

原生質體混合液過篩（40~100m），除去未消化的細胞團、篩管、導管等雜質。（2）濾液離心沉淀原生質體。（3）沉淀重新懸浮，再離心，重復洗三次。（4）用培養(yǎng)基清洗一次，最后用培養(yǎng)基調節(jié)原生質體的濃度（104~106/ml）進行培養(yǎng)。本文檔共51頁；當前第9頁；編輯于星期一\18點20分

（1）細胞壁染色法：

熒光增白劑——細胞壁染色劑，既可以鑒定細胞壁是否除凈，也可檢查原生質體細胞壁的再生情況。染色后在熒光顯微鏡下觀察（360~440nm），染料與細胞壁形成顯眼的綠色熒光，無細胞壁處則無熒光反應，略帶紅色。6、原生質體的活力鑒定本文檔共51頁；當前第10頁；編輯于星期一\18點20分

（2）原生質體活力的測定：

有多種方法，如觀察細胞質環(huán)流、Evans藍活性染料染色、測熒光素雙醋酸酯（FDA）染色、測定原生質體光合活性等。一般常用的方法是FDA染色，F(xiàn)DA本身無熒光，進入原生質體，在原生質體中受酯酶的分解而產生有熒光的極性熒光物質，積累在有活力的原生質內，便產生熒光。無活力的原生質不能分解FDA，也就無熒光產生。本文檔共51頁；當前第11頁；編輯于星期一\18點20分

矮牽牛（Petuniahybrida）葉片原生質體分離的具體操作過程：

（1）取幼嫩葉片，用自來水洗凈，無離子水中浸泡1~2小時，無菌條件下在70%乙醇中浸泡兩秒鐘，0.1%升汞中浸泡分鐘，無菌水洗滌葉片（3~5次）。（2）

滅菌后撕去葉片的下表皮，平放于盛有酶液的培養(yǎng)皿中。酶液的組成為：2%纖維素酶（75-343，上海生化所東風試劑廠）；0.5mol甘露醇，pH5.6，使用前用04.5m微孔濾膜抽濾滅菌。（3）酶液處理：260C度，約3小時，將懸浮有原生質體的酶液200目鎳絲網過濾，離心（500rpm，3~5min），棄去酶液。收集原生質體，用0.5mol甘露醇洗一次（離心），再用液體培養(yǎng)基洗一次，最后添加培養(yǎng)基，制成密度為1~2104/ml的原生質體懸浮液。（原生質體呈球形，葉綠體分布均勻，呈亮綠色。）

本文檔共51頁；當前第12頁；編輯于星期一\18點20分

原生質體經分離純化后，在合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件才能正常生長發(fā)育，最后再生成完整植株。由于沒有細胞壁，原生質體對環(huán)境的刺激更敏感，培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)方法的變化都會引起細胞內部生理、生化變化。三、植物原生質體的培養(yǎng)本文檔共51頁；當前第13頁；編輯于星期一\18點20分1、原生質體培養(yǎng)基

原生質體培養(yǎng)基一般是在組織、細胞培養(yǎng)基的基礎上加以改進而制成。如常用的KM8P培養(yǎng)基是以B5培養(yǎng)基為基礎，NT培養(yǎng)基是以MS培養(yǎng)基為基礎改進而成。

（1）滲透壓穩(wěn)定劑：常用的是甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖等。這些物質既保持培養(yǎng)基的滲透濃度，同時也是原生質體生長的碳源。本文檔共51頁；當前第14頁；編輯于星期一\18點20分

（2）無機鹽：是培養(yǎng)基的主要成分，分大量的微量元素兩部分。大量元素中影響最大的是Ca2+和NH4+。

較高的Ca2+濃度能提高原生質體的穩(wěn)定性，同樣也有利于原生質體的生長發(fā)育。因此常用大量元素減半的MS培養(yǎng)基時，Ca2+濃度不降低；

高濃度NH4+

對原生質體生長發(fā)育不利，很多原生質體培養(yǎng)采用除去銨鹽而用有機氮做氮源的方法。其他如有機營養(yǎng)、激素等在組織、細胞培養(yǎng)基的基礎上根據(jù)培養(yǎng)要求適當改進。本文檔共51頁；當前第15頁；編輯于星期一\18點20分

（1）

液體培養(yǎng)法：

培養(yǎng)基中不加固化劑，原生質體懸浮在液體培養(yǎng)基中。常用的有液體淺層培養(yǎng)法、微滴培養(yǎng)法。

液體淺層培養(yǎng)法操作簡便，對原生質體傷害小，且便于添加培養(yǎng)基和轉移培養(yǎng)物，是廣泛應用的方法之一；

2、原生質體的培養(yǎng)方法本文檔共51頁；當前第16頁；編輯于星期一\18點20分

微滴培養(yǎng)法是將懸有原生質體的培養(yǎng)液用滴管以0.1ml左右的小滴接種到無菌清潔干燥培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿封口防止干燥和污染（如果把培養(yǎng)皿翻轉過來則成為懸滴培養(yǎng)）。該法的優(yōu)點是在一個培養(yǎng)皿中可做很多種培養(yǎng)基的對照實驗，且其中一滴發(fā)生污染不會殃及整個實驗；缺點是原生質體分布不均勻（集中在中央），且易蒸發(fā)干燥。

本文檔共51頁；當前第17頁；編輯于星期一\18點20分

（2）固體培養(yǎng)法：

該法是將懸浮在液體培養(yǎng)基中的原生質體與熱融的含瓊脂（0.6%）的培養(yǎng)基等量混合，冷卻后原生質體包埋在瓊脂培養(yǎng)基中。由于原生質體被機械地彼此分開并固定了位置，因而避免了細胞間有害代謝產物的相互影響，且便于定點觀察，追蹤單個細胞的發(fā)育過程。本文檔共51頁；當前第18頁；編輯于星期一\18點20分

（3）固液結合培養(yǎng)法：

即在培養(yǎng)皿的底部先鋪一層固體培養(yǎng)基（含或不含原生質體），再在其上進行液體淺層培養(yǎng)。這樣固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分可緩慢向液體中釋放，以補充培養(yǎng)物對營養(yǎng)物的消耗，也可吸收培養(yǎng)物產生的一些有害物質，對培養(yǎng)物的生長更為有利。

用上述各方法，一般培養(yǎng)1~2d原生質體體積顯著增大，2~3d即可形成新的細胞壁，3~7天后開始分裂，15d左右形成小的細胞團(20~40個細胞)，30~40d發(fā)育成肉眼可見的小愈傷組織。本文檔共51頁；當前第19頁；編輯于星期一\18點20分

當愈傷組織直徑為1~2mm時，可將其轉移到固體分化培養(yǎng)基上，一般是先誘導芽分化，再誘導根分化。小愈傷組織在固體分化培養(yǎng)基上生長迅速，約30d后直徑可達礎0.5cm，同時愈組織變綠（不同來源的材料表現(xiàn)不一），進一步誘導分化形成綠芽。然后轉移到生根培養(yǎng)基上或不含任何激素的培養(yǎng)基上誘導分化形成根，再生完整植株。本文檔共51頁；當前第20頁；編輯于星期一\18點20分3.原生質體的培養(yǎng)的技術流程

原生質體可按Bergmann的細胞植板法用瓊脂平板進行培養(yǎng)。如下圖所示。

本文檔共51頁；當前第21頁；編輯于星期一\18點20分本文檔共51頁；當前第22頁；編輯于星期一\18點20分4.植物原生質體培養(yǎng)再生植株實例玉米小偃麥棉花本文檔共51頁；當前第23頁；編輯于星期一\18點20分玉米原生質體植株再生1、從胚性愈傷組織分離的原生質體。2、培養(yǎng)4天后再生細胞進行第一次分裂。3、培養(yǎng)約三星期的小愈傷組織。4、分化的胚芽鞘。5、分化的小植株。本文檔共51頁；當前第24頁；編輯于星期一\18點20分小偃麥原生質體植株再生本文檔共51頁；當前第25頁；編輯于星期一\18點20分棉花原生質體植株再生本文檔共51頁；當前第26頁；編輯于星期一\18點20分

1、體細胞雜交的概念

凡是兩個細胞或原生質體融合成一個細胞的過程稱為細胞雜交（cellhybridization）。原生質體可從體細胞和性細胞獲得，但植物細胞雜交都用來自葉肉、根尖、莖端、髓部等組織的體細胞原生質體作為雜交親本，故常稱之為體細胞雜交（somatichybridization）。

四、植物體細胞雜交本文檔共51頁；當前第27頁；編輯于星期一\18點20分

通俗地說，細胞雜交（或融合）就是兩個不同種的活細胞緊密接觸在一起，使接觸部位的細胞膜發(fā)生融化，這樣兩個細胞的細胞質、細胞器互相交流，最后完全合并成一個細胞。通過科學的培養(yǎng)技術，這個細胞有可能發(fā)育成完整的生物體，即原來兩個細胞所屬的物種的雜種后代。所形成的雜種后代有可能兼有兩個親本的一些優(yōu)良性狀，因而對改良品種，提高農、林、牧業(yè)產品產量和質量具有重要意義。本文檔共51頁；當前第28頁；編輯于星期一\18點20分起源細胞細胞壁降解親本原生質體誘導融合聚集、粘連胞質融合異核體核融合胞壁再生雜種細胞培養(yǎng)選擇雜種愈傷組織誘導分化雜種植株2、植物細胞雜交程序本文檔共51頁；當前第29頁；編輯于星期一\18點20分

3.植物體細胞雜交技術植物體細胞雜交技術包括以下三個環(huán)節(jié)：

誘導原生質體融合；選擇融合體或雜種細胞；雜種細胞的培養(yǎng)與鑒定。

本文檔共51頁；當前第30頁；編輯于星期一\18點20分

（1）誘導原生質體融合

誘導原生質體融合是體細胞雜交的基本技術環(huán)節(jié)，常用的方法有化學方法和電融合方法。

1）化學方法：

化學方法最早是用硝酸鈣溶液作融合劑，但由于它本身對細胞有毒，且誘導融合的頻率不高。目前最常用的化學融合劑是聚乙二醇（PEG）。本文檔共51頁；當前第31頁；編輯于星期一\18點20分PEG毒性低，且沒有種、屬、科間的特異性，只要掌握好試劑的分子量、濃度、處理時間和操作技術，可得到較高的誘導融合率（一般在10%以上），且誘導的融合體在合適的培養(yǎng)條件下可再生植株。其缺點是易形成多融合體。在PEG溶液中加入融合促進劑如刀豆球蛋白A、15%的二甲基亞砜、鏈霉蛋白酶、精胺、亞精胺等，都能明顯提高融合頻率。

本文檔共51頁；當前第32頁；編輯于星期一\18點20分

PEG溶液加到混合原生質體懸液中，引起原生質體凝集，但PEG誘導融合的機理目前還不清楚，有研究發(fā)現(xiàn)，將商品PEG純化后就完全失去了誘導融合的能力，但并不影響原生質體的凝集。對純化除去的雜質經鑒定是一些抗氧化劑，如-生育酚（Ve）和其它酚類衍生物。如把純化的PEG與低分子量的脂肪酸結合應用，融合頻率比商品PEG高15~20倍。本文檔共51頁；當前第33頁；編輯于星期一\18點20分

常用的PEG和高pH高Ca相結合誘導融合的具體操作程序：

混合雙親原生質體懸液，吸一小滴懸液于小培養(yǎng)皿中，5~15min后原生質體沉到底面形成薄層；每一小滴懸液慢慢加3小滴PEG溶液。PEG溶液的組成：2難度ml溶液（內含0.1mol葡萄糖、10.5mmolCaCI2、0.7molKH2PO4，KOH調節(jié)pH到5.5）加1gPEG-1560（或4000、6000，其它濃度）

250C保溫15~45min

本文檔共51頁；當前第34頁；編輯于星期一\18點20分

用0.5ml高pH高Ca溶液稀釋（50mmolCaCl2、0.3mol葡萄糖、50mmol甘氨酸、1000ml蒸餾水，NaOH調pH到10.5）.

15min后加另一滴（約0.5ml）高pH高Ca溶液；

15min后用1~2ml原生質體培養(yǎng)基稀釋；用總量為20ml培養(yǎng)基洗滌5次；

在0.5ml左右原生質體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本文檔共51頁；當前第35頁；編輯于星期一\18點20分

該技術從建立（1979）以來發(fā)展很快。電融合需要有特制的融合儀和融合板，原生質體放在板上的兩電極之間。先給兩極通以交變電流，使原生質體沿電場方向呈串珠狀排列，接著給以瞬間高強度電脈沖，使原生質體膜局部損傷而導致融合。處理時原生質體的適宜密度、CaCI2的濃度、

變電流的強度、電脈沖的大小、脈沖期寬度與間隔都影響融合的頻率。

2）電融合法：本文檔共51頁；當前第36頁；編輯于星期一\18點20分

兩親本原生質體融合后形成異核體，進行有絲分裂過程中發(fā)生核融合，形成雜種細胞：親合的雜種細胞；部分親合的雜種細胞；胞質雜種；異核質雜種；如何將雜種細胞與未融合的、同源融合的親本細胞區(qū)分開，是體細胞雜交技術的以一重要環(huán)節(jié)。

（2）異核體或雜種細胞的選擇本文檔共51頁；當前第37頁；編輯于星期一\18點20分類型細胞核細胞質產物1234A，BA，B（少量）A（少量），BA（或B）A（或B）A，BA，BA，BA，BA（或B）親和的雜種細胞部分親和的雜種細胞胞質雜種胞質雜種異核質雜種本文檔共51頁；當前第38頁；編輯于星期一\18點20分1）利用生長特性的差異進行選擇：

植物細胞對培養(yǎng)基成分的要求與反應不同可作為選擇的依據(jù)。

如粉藍煙草和朗氏煙草的原生質都需要外源激素，但它們間的雜種細胞能產生內源激素，用無激素的培養(yǎng)基就可將雜種細胞選出來；又如曼陀羅與煙草的雜種細胞愈傷組織比兩親本的愈傷組織生長得快，這種生長速度上的差異也可作為選擇的依據(jù)。本文檔共51頁；當前第39頁；編輯于星期一\18點20分

原生質體再生植株的能力作為選擇的依據(jù)。

在種內、種間、屬間的體細胞雜交實驗中，只要親本一方能再生植株，雜種細胞就能再生植株。因而可將原生質體的再生能力看作顯性性狀，用來淘汰無再生能力的一方親本。再與其它方法相結合，將能再生的一方親本淘汰，選擇出雜種植株。

本文檔共51頁；當前第40頁；編輯于星期一\18點20分

通過人為的方法導致細胞在培養(yǎng)基的生長差異進行選擇。

用不同的生化抑制劑處理親本原生質體，使其代謝機能受阻，不能在培養(yǎng)基上生長。如碘乙酸酯處理使原生質體核失活，羅達明6G能抑制氧化磷酸化過程，這些處理都能使原生質體在培養(yǎng)基上不能分裂，而融合后產生的雜種細胞，由于重建了必要的代謝支路，能在培養(yǎng)基上正常生長可將其選擇出來。這是最為簡便且廣泛應用的選擇方法。本文檔共51頁；當前第41頁；編輯于星期一\18點20分

突變細胞互補選擇是研究的較多的一種選擇方法，包括葉綠素缺失互補、營養(yǎng)缺陷互補和抗性互補。前兩種為隱性性狀，后一種為顯性性狀，其互補的原理是一致的。

2）利用突變細胞系互補的方法選擇：本文檔共51頁；當前第42頁；編輯于星期一\18點20分選擇系統(tǒng)原則自養(yǎng)互補白化互補抗性互補自養(yǎng)aB+自養(yǎng)Ab自養(yǎng)AaBb白化aB+白化Ab綠色AaBb抗aB+抗Ab雙抗AaBb本文檔共51頁；當前第43頁；編輯于星期一\18點20分

當非等位隱基因控制的兩個突變細胞融合后，由于每一親本細胞貢獻一個功能正常的等位基因，糾正了親本對方的缺陷，使雜種細胞表現(xiàn)正常。當兩個抗性系的原生質體融合時，每個親本的藥物敏感性分別被親本對方的抗性所掩蓋，因而兩個單抗的親本細胞融合后產生雙抗的雜種細胞，用相應的選擇培養(yǎng)基就將雜種細胞選擇出來。

本文檔共51頁；當前第44頁；編輯于星期一\18點20分

人們已建立了通用雜交親本。通過有性雜交將硝酸還原酶缺陷的突變體與抗鏈霉素突變體綜合在一個突變系中，建立了同時具有顯、隱性突變的煙草雙突變體。它可以與任何一個無選擇標記的原生質體融合，利用親本對方對鏈霉素敏感及雙突變體特殊的營養(yǎng)要求（還原氮），很容易用選擇培養(yǎng)基將雜種細胞選擇出來。本文檔共51頁；當前第45頁；編輯于星期一\18點20分

目前構建的雙突變體的隱性性狀都是硝酸還原酶缺陷，顯性性狀除鏈霉素