分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作

-PAGE4-分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)常規(guī)技術(shù)操作目錄HYPERLINK\s"1,24,31,0,,1.質(zhì)粒提取"1.質(zhì)粒提取HYPERLINK\s"1,99,107,0,,1.1小提質(zhì)粒"1.1小提質(zhì)粒HYPERLINK\s"1,1237,1250,28,,1.2小量快提質(zhì)粒鑒定："1.2小量快提質(zhì)粒鑒定：HYPERLINK\s"1,1534,1544,28,,1.3大提質(zhì)粒："1.3大提質(zhì)粒：HYPERLINK\s"1,2504,2510,0,,2.酶切："2.酶切HYPERLINK\s"1,2583,2593,28,,2.1制備型酶切："2.1制備型酶切HYPERLINK\s"1,3192,3203,28,,2.2小量酶切鑒定"2.2小量酶切鑒定HYPERLINK2.3DNA片段5'突出端的補(bǔ)平HYPERLINK\s"1,4201,4212,28,,3.瓊脂糖凝膠電泳："3.瓊脂糖凝膠電泳HYPERLINK\s"1,5545,5551,0,,4.回收："4.回收HYPERLINK4.1從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段HYPERLINK4.2小量膠回收DNA片段試劑盒操作（見操作手冊(cè)）HYPERLINK\s"1,7323,7339,0,,4.3無水乙醇沉淀回收："4.3無水乙醇沉淀回收HYPERLINK\s"1,7810,7816,28,,5.連接："5.連接HYPERLINK\s"1,7887,7898,28,,5.1一般連接："5.1一般連接HYPERLINK\s"1,8212,8225,28,,5.2平端動(dòng)態(tài)連接"5.2平端動(dòng)態(tài)連接HYPERLINK\s"1,8595,8600,0,,6.轉(zhuǎn)化"6.轉(zhuǎn)化HYPERLINK\s"1,8685,8696,0,,6.1質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化："6.1質(zhì)粒快速轉(zhuǎn)化HYPERLINK\s"1,9256,9268,0,,6.2連接物轉(zhuǎn)化："6.2連接物轉(zhuǎn)化HYPERLINK\s"1,9859,9871,0,,7.制普通固體培養(yǎng)板："7.制普通固體培養(yǎng)板HYPERLINK\s"1,9960,9966,0,,8.涂板："8.涂板HYPERLINK\s"1,10042,10048,0,,9.挑菌："9.挑菌HYPERLINK10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)HYPERLINK\s"1,11225,11238,0,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株分離："哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株分離HYPERLINK\s"1,11767,11777,28,,常用溶液、培養(yǎng)基配制"常用溶液、培養(yǎng)基配制1.質(zhì)粒提取：1.1小提質(zhì)粒：本實(shí)驗(yàn)室在常規(guī)條件下采用堿裂解法小量提取質(zhì)粒(1)從平板上挑取單菌落或搖甘油菌(5～50uL)，接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中（加有相應(yīng)的抗生素），37℃振蕩培養(yǎng)至OD2.0*通常DH5а菌株搖12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr*(2)取1.5mL菌液于1.5mLEppendorf管（可取未滅菌的新管）中，12000rpm離心15～30sec，棄上清。通?？扇?.5mL菌液再離心一次，棄去上清后在紙上扣干。*不要忘記將用完的試管及管蓋放入指定處以備回收處理*(3)加入150uL溶液I，振蕩使菌體沉淀充分懸浮。*務(wù)必懸浮完全*(4)加入150uL溶液II，立即輕輕翻轉(zhuǎn)幾下，使菌體裂解。*可觀察到原渾濁的菌懸液變清變粘*(5)加入180uL溶液Ⅲ，立即上下顛倒充分混勻7～10次，不宜太劇烈。*可觀察到白色團(tuán)片狀沉淀出現(xiàn)。*(6)置冰浴10分鐘，也可置于-20℃(7)12000rpm離心8～10分鐘。(8)在離心過程中可取未滅菌的新1.5mLEppendorf管，加入等體積(350～400uL即可)酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）備用；取滅菌過的新1.5mLEppendorf管，加入2倍體積(780uL即可)的無水乙醇置于-20℃?zhèn)溆?加酚-氯仿-異戊醇時(shí)要小心，應(yīng)吸位于下層的酚相，而不要帶入上層的Tris-cl保護(hù)液*(9)離心完將上清迅速倒入已加好的酚-氯仿-異戊醇中,充分混勻。*小心不要將白色沉淀物倒入酚-氯仿-異戊醇中*(10)12000rpm離心4～5分鐘。(11)吸水相，加入已加好的無水乙醇中,顛倒混勻幾次。*小心不要吸入酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些水相*(12)-20℃放置5～(13)12000rpm離心10分鐘。(14)迅速棄上清，沉淀用適量70%乙醇洗一次，于紙上扣干。*小心不要將沉淀洗掉*(15)置于恒溫器上干燥(55℃)至無色透明或無乙醇?xì)馕?，一般大約5～10min(16)加入30～40uL1×TE緩沖液溶解沉淀，-20℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*1.2小量快提質(zhì)粒鑒定：（目前較少采用）(1)取培養(yǎng)的菌液1mL，12000rpm離心30s，收集菌體，在紙上扣干殘留培養(yǎng)液。(2)用50uL無菌水充分懸浮菌體。RNaseA0.5uLddH2O適量限制性內(nèi)切酶A(限制性內(nèi)切酶B0.1uL0.1uL)反應(yīng)體積15～20uL*請(qǐng)根據(jù)保證酶切效率(至少在75%以上)的需要選用合適的反應(yīng)緩沖液，不同公司的酶切反應(yīng)緩沖液基本上可以通用。但需注意有的要另外加BSA(10×和100×的都有)。(2)37℃反應(yīng)2～3小時(shí)(可依據(jù)所使用酶的需要，選用合適的酶切時(shí)間和溫度)(3)取1～2uL電泳鑒定。*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*2.3DNA片段5'突出端的補(bǔ)平:(1)在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：注意：酶要在最后才加，加酶時(shí)要用新的槍頭，動(dòng)作要迅速，酶不要在空氣中暴露過久；要盡量保持低溫，不要用手直接接觸儲(chǔ)存管上裝酶的部位；用完后要蓋緊放回原處；要用新酶或有問題時(shí)請(qǐng)找管理員xxy。欲處理的DNA樣品2ug10×Klenowbuffer3～4uL10mMdNTP2uLddH2O適量DNA聚合酶I(Klenow大片段)5～10U反應(yīng)體積30～40uL(2)37℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*3.瓊脂糖凝膠電泳：制備凝膠：根據(jù)需要，在指定的三角瓶中配制50/100mL特定濃度的瓊脂糖凝膠。首先在電子天平上稱取一定量的瓊脂糖粉，倒入指定的三角瓶中，加入100mL1×TAE,再加入3～4uL溴化乙錠(EB),混勻，在微波爐中煮化(大約4～5min)，混勻后倒入插好樣品梳的凝膠槽中,凝固后備用。*溴化乙錠(EB)有潛在的致癌性，操作時(shí)要戴手套，并且注意不要污染其它操作區(qū)**在微波爐中煮化時(shí)要小心不要讓凝膠暴沸**倒膠時(shí)不要倒太厚，一般可插入梳子5mm*倒回收膠要使用專用的樣品梳和凝膠槽**分離不同大小的DNA片段請(qǐng)選用合適濃度的瓊脂糖凝膠*瓊脂糖凝膠(%)線性DNA的有效分離范圍(kb)0.52～300.81.5～101.01.0～71.20.7～61.52.02.53.00.5～30.2～20.1～1.50.07～1.0待膠凝固后，小心拔去梳子，拔出時(shí)注意不要破壞膠孔。用刀片切下所需的膠塊，放入加有足夠電泳緩沖液(1×TAE)的電泳槽中，緩沖液面高于凝膠表面3～5mm即可。*注意電泳時(shí)使用的是1×TAE緩沖液，而母液是50×的，配制時(shí)要留神**在放入凝膠要上樣前，最好檢查一下樣品孔是否有破損泄漏，尤其是上回收樣品之前*可在一干凈手套上點(diǎn)滴適量(1～3uL)的3×溴酚蘭上樣緩沖液(深綠色)，用槍移取適量的樣品(1～10uL)與滴加好的溴酚蘭上樣緩沖液混合(可觀察到混合液變?yōu)樗{(lán)色)，再將混合液小心加入膠上的樣品孔中。*上樣要迅速準(zhǔn)確，上樣量不要過大以致漫出樣品孔**若樣品要求無污染，可使用新的滅菌槍頭上樣**若樣品無嚴(yán)格要求(如用來做小量酶切鑒定的樣品)，可用一個(gè)槍頭多次上樣，但每次上樣前在電泳緩沖液中洗幾下*接通電極進(jìn)行電泳，電壓一般可在140V～200V。*注意要接對(duì)正負(fù)極，核酸是由負(fù)極向正極方向跑的**打開及關(guān)閉電泳儀時(shí)請(qǐng)?zhí)貏e注意，不要用沾染有EB的手套接觸電泳儀*當(dāng)溴酚蘭遷移至足夠距離時(shí)(至少1cm),*在紫外燈下觀察時(shí)要注意保護(hù)眼睛，不要用裸眼直接觀察**一般質(zhì)粒樣品電泳時(shí)，電泳遷移率從跨快倒慢依次是：RNA、溴酚蘭、cccDNA、LcDNA、OcDNA那些始終跑不出孔的樣品多是染色體*觀察結(jié)束后，要及時(shí)處理凝膠及手套，嚴(yán)禁隨處拋棄**做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*4.回收：4.1從低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收DNA片段將已經(jīng)電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物在合適濃度的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。*最好換用新的電泳緩沖液，即1×TAE*當(dāng)溴酚藍(lán)跑到一定距離后(至少2cm以上)在長(zhǎng)波紫外燈下觀察，用清洗過的刀片在目的片段前切下一與目的片段同長(zhǎng)，寬度適當(dāng)(一般1cm左右)的膠塊。*不要忘記在膠下墊一個(gè)新的塑料手套防止污染**小心不要將回收膠切裂,同時(shí)注意與目的帶相鄰的切面要盡量平整*將切好的回收膠塊放在原回收膠槽內(nèi)，在切去膠塊處加入低熔點(diǎn)瓊脂糖膠，待其凝固后將其小心放回電泳槽繼續(xù)進(jìn)行電泳。*小心低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠塊與原回收膠塊的交界面易斷裂*待目的帶完全進(jìn)入低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠后，在長(zhǎng)波紫外燈下用清洗過的刀片切下含有所需DNA帶的凝膠條，置于新的滅菌過的1.5mLEppendorf管中,加300uLTE。(5)65℃水浴10min或更長(zhǎng)使膠塊完全融化(6)立即加入等體積(300-350uL)Tris-Cl飽和酚（pH8.0）,搖晃混勻。(7)12000rpm離心5min。(8)小心將水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖晃混勻。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相*(9)12000rpm離心5min。(10)小心將水相移置另一1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相*(11)置液氮3分鐘，取出后可于-20℃放幾分鐘。小心防止管子爆裂(12)12000rpm離心10min。(13)迅速棄上清，一般在管底會(huì)有針尖大小的沉淀物，小心用無水乙醇后清洗后置于恒溫器上干燥(55℃)5～10min至無乙醇?xì)馕?，再加?0uLddH2O(14)取2uL電泳定量后－20℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*4.2小量膠回收DNA片段試劑盒操作（見操作手冊(cè)）將已電泳確定的可回收的酶切產(chǎn)物或其它產(chǎn)物在合適濃度的回收用瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。*要換用新的電泳緩沖液，即1×TAE*(2)當(dāng)溴酚藍(lán)跑到一定距離后(至少2cm以上)在長(zhǎng)波紫外燈下觀察，用清洗過的刀片切取含目的DNA的瓊脂糖凝膠，盡可能小，置于一新的已滅菌過的1.5mlEppendorf管。*回收膠下要墊一個(gè)新的塑料手套防止污染*(3)每100mg凝膠加入300uL/450uLS1液，55OC溫育10min，每2min顛倒一次。*務(wù)必完全溶解*(4)加入1/3體積(100uL/150uL)異丙醇，混勻，55OC，溫育1min。(5)將混合液移入吸附柱，高速(10000rpm)離心1min，棄去收集管液。(6)往吸附柱中加入450ulW1，靜置1min，高速離心15sec，棄去收集管液。(7)重復(fù)步驟（6）一次，但無需靜置。(8)棄去收集管液后再高速離心1min。(9)將吸附柱放于一干凈的已滅菌的1.5mlEppendorf管，在吸附膜中央滴入30～40ulT1液或ddH2O，室溫靜置1min，當(dāng)用ddH2O溶解時(shí)可在37OC置5min。(9)高速離心1min，棄去吸附柱。(10)取2uL電泳定量后－20℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*4.3無水乙醇沉淀回收：(1)將已確定的可回收產(chǎn)物溶于加有300uL1×TE緩沖液的滅菌過的新1.5mLEppendorf管。(2)加入等體積的酚-氯仿-異戊醇，搖晃混勻。(3)12000rpm離心5min。(4)小心將水相移置另一滅菌過的新1.5mLEppendorf管中，加入2.5～3倍體積(780uL即可)預(yù)冷的無水乙醇。*小心不要吸入下層雜質(zhì)及酚相，沒把握時(shí)寧愿放棄一些上層水相*(5)置液氮3分鐘，取出后可于-20℃(6)12000rpm離心10min。(7)迅速棄上清，一般在管底會(huì)有針尖大小的沉淀物，小心用無水乙醇后清洗后置于恒溫器上干燥(55℃)5～10min至無乙醇?xì)馕叮偌尤?0uLddH2O(8)取2uL電泳定量后－20℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*5.連接：5.1一般連接：(1)在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合：載體0.5～1.5uL目的基因*適量10×T4LigaseBuffer1～1.5uLT4DNA連接酶ddH2O1uL適量反應(yīng)總體積10～15uL*目的片段所需量(ng)=載體量(ng)×目的片段長(zhǎng)度×3/載體長(zhǎng)度(2)14～16℃連接6～14*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*5.2平端動(dòng)態(tài)連接(1)在滅菌過的新0.5mLEppendorf管中加入下列成分混合:線性化載體(平端酶SmaI/EcoRV/HincII處理）目的片段 10×T4LigaseBuffer相應(yīng)平端酶(SmaI/EcoRV/HincII)T4DNA連接酶 ddH2O200ng適量*2uL5～8U10U適量反應(yīng)總體積20uL*目的片段所需量(ng)=載體量(ng)×目的片段長(zhǎng)度×3/載體長(zhǎng)度(2)25℃(SmaI)或37℃(EcoRV/HincII)作用3*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*6.轉(zhuǎn)化6.1質(zhì)?？焖俎D(zhuǎn)化：(1)根據(jù)需要，從超低溫冰箱中迅速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中10min以上，并請(qǐng)注明取出的日期時(shí)間。不要取出后立即使用或使用已放置6hr以上的感受態(tài)細(xì)胞。(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)取一轉(zhuǎn)化用1.5mlEppendorf管，先吸取20uL感受態(tài)細(xì)胞，再加入質(zhì)粒(若質(zhì)粒濃度大，只要槍頭蘸一下即可，若低可取1～2uL用于轉(zhuǎn)化)與之混合，混勻后冰浴15min。*小心不要污染*(3)42℃熱休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min(4)加入200uLLB培養(yǎng)基（無抗性）,37℃振蕩培養(yǎng)15-30(5)取相應(yīng)抗性的平板置于37℃(6)振蕩培養(yǎng)15～30min后取100uL菌液涂板。(7)37℃培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(菌株不同，培養(yǎng)溫度和時(shí)間均有不同)通常DH5а菌株培養(yǎng)12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr；BL219-11hrGI72430℃培養(yǎng)20～24hr(IMC平板*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*6.2連接物轉(zhuǎn)化：根據(jù)需要，從超低溫冰箱中迅速取出一管感受態(tài)細(xì)胞，用手捂化后，置于冰浴中15min以上,并請(qǐng)注明取出的日期時(shí)間。不要立即使用或使用已放置6hr以上的感受態(tài)細(xì)胞。在超凈工作臺(tái)內(nèi)取一轉(zhuǎn)化用1.5mlEppendorf管，吸取40uL感受態(tài)細(xì)胞和5uL連接物混合，混勻后冰浴30min。*小心不要污染*(3)42℃熱休克90～120sec，取出迅速置冰浴中2min(4)加入360uLLB培養(yǎng)基（無抗性），37℃振蕩培養(yǎng)40～60*若連接物需用藍(lán)白斑來鑒定，則在菌液涂板前30min，需預(yù)先在平板上均勻涂布上適當(dāng)濃度的X-gal與IPTG，并在37℃中正放30min(5)取相應(yīng)抗性的平板置于37℃(6)振蕩培養(yǎng)40～60min后涂布平板。(7)37℃培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間(菌株不同，培養(yǎng)溫度和時(shí)間均有不同)通常DH5а菌株培養(yǎng)12～14hr;JM1017～8hr;ER256610～12hr；BL219-11hrGI72430℃培養(yǎng)20～24hr(IMC平板*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*7.制普通固體培養(yǎng)平板：(1)固體瓊脂培養(yǎng)基的配制：本實(shí)驗(yàn)室常用的是LB固體瓊脂平板，濃度為1.5%，即在100mLLB液體培養(yǎng)基中加入1.5g的瓊脂，滅菌后可使用。(2)使用時(shí)取一瓶滅過菌的固體瓊脂培養(yǎng)基，放在電爐上小心煮化。*在電爐上煮化時(shí)一定要小心看守，防止其暴沸**有時(shí)會(huì)有部分固體瓊脂沉積在瓶底，在煮化時(shí)要小心不要煮焦*將固培冷卻至45～60℃，在超凈工作臺(tái)內(nèi)按比例加入需要的抗生素，混勻。*固培煮化后，可在流水下冷卻，但須小心玻璃會(huì)卒冷爆裂**當(dāng)冷卻至手摸不燙時(shí)即可，冷卻過頭易于凝固*(4)在超凈工作臺(tái)內(nèi)按比例加入需要的抗生素，混勻后，將培養(yǎng)基倒入已滅菌過的平皿內(nèi)，厚度適當(dāng)。*培養(yǎng)基不要倒太厚，一般3～5mm(5)平皿可正放在超凈工作臺(tái)內(nèi)，待其冷卻凝固后使用或放入冰箱4℃*在放入冰箱4℃*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*8.涂板：(1)若所要使用的平板儲(chǔ)存于冰箱4℃，則使用前須預(yù)先取出放在室溫或37℃中*取用平板時(shí)一定要注意抗性**平板預(yù)熱時(shí)最好倒置*(2)在超凈工作臺(tái)內(nèi)用槍將所要涂布的菌液移入平板。*質(zhì)粒轉(zhuǎn)化一般只要涂100uL左右的菌液，連接物涂200～400uL*(3)將涂布器先在酒精燈的外焰上灼燒，再浸入乙醇中，取出后再通過燈焰，燃盡其上的乙醇，待其冷卻后方可使用。*如平板的蓋子內(nèi)面上覆有水珠，可用于冷卻涂布器**涂板時(shí)不要心急，一定要等涂布器充分冷卻后方可使用*(4)用涂布器將平板上的菌液涂布均勻，平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，除GI724(30℃)外，其它菌株均在*做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*9.挑菌：(1)待平板上的菌落長(zhǎng)至足夠大即達(dá)到可挑的水平。(2)在超凈工作臺(tái)中，在滅菌過的試管內(nèi)倒入3～4mL滅菌過的培養(yǎng)基，培養(yǎng)基根據(jù)需要預(yù)先加入抗生素(由菌落所攜帶的質(zhì)粒上的抗性基因決定)。*抗生素要按比例加入培養(yǎng)基，并要加了抗生素的培養(yǎng)基上做清楚標(biāo)記，沒有用完的培養(yǎng)基要封好放入冰箱4℃，不要放在外面*請(qǐng)盡量使用冰箱內(nèi)已加好抗生素的培養(yǎng)基*(3)用鑷子夾取滅菌過的牙簽挑取平板上的單菌落，在試管內(nèi)的培養(yǎng)基中蘸洗幾下，旋緊管蓋后再將牙簽丟棄于超凈臺(tái)外的收集桶內(nèi)，并請(qǐng)您扔準(zhǔn)。*挑菌時(shí)不提倡將牙簽直接投入培養(yǎng)基中**挑菌時(shí)一定要挑清晰正常的單菌落**挑過菌的牙簽一定不能留在超凈工作臺(tái)中*(4)挑菌后請(qǐng)將裝滅菌牙簽的小燒杯封好，并及時(shí)將工作臺(tái)清理干凈。接種過菌落的試管放在搖床中在合適溫度下?lián)u動(dòng)培養(yǎng)，搖速一般170～230r/min。*試管要在搖床放好，有適當(dāng)?shù)膬A斜角度(45。左右)**要注意不同的菌株和搖菌目的，可能需要不同的溫度和搖速。**做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*10.血清中病毒核酸的提取(蛋白酶K法)：將血清裝入新的滅菌過的1.5mLEppendorf管，每管200uL。*使用血清，尤其是未滅活的血清時(shí)要注意安全，不要污染環(huán)境**一旦發(fā)生血清污染環(huán)境，請(qǐng)立即用84消毒液處理*(2)在每管中加入STE156uL10%SDS40uL100×Pro-K4uL然后在56℃中水浴2-3小時(shí)，每幾分鐘(一般5～10min)*管子一定要仔細(xì)蓋嚴(yán)，防止泄漏及外面的水進(jìn)入*(3)加入400uL的酚-氯仿-異戊醇，搖勻后靜置幾分鐘(5～10min)，不宜劇烈。(4)12000rpm離心10min。(5)小心將上清取出，加入兩倍體積以上(780uL即可)的無水乙醇和終濃度為0.2M的NaAc(40uL)，置于液氮中3min*小心不要吸入中間的蛋白和下層的酚相*(6)取出后可先置于-20℃(7)12000rpm離心10min。(8)迅速棄去無水乙醇，再用無水乙醇洗一下(也可不洗)，*最好用滅菌槍頭吸干管內(nèi)液體*(9)在恒溫器(55℃)干燥5min左右至無乙醇?xì)馕叮偌尤?0uLddH2O溶解。-20*操作過程中要嚴(yán)防污染**做完實(shí)驗(yàn)請(qǐng)及時(shí)收拾實(shí)驗(yàn)臺(tái)*哺乳動(dòng)物細(xì)胞單克隆株分離：(1)把轉(zhuǎn)染72hr后的細(xì)胞從六孔板中的用Verson液消化洗下，經(jīng)稀釋后轉(zhuǎn)入50mL螺口玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至基本貼壁時(shí)再加入含作用濃度為400ug/mLG418的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。以2～3天為間隔換液，如此培養(yǎng)一星期后可觀察到有大量細(xì)胞死亡，相應(yīng)降低G418壓力繼續(xù)培養(yǎng)2～3星期后，可觀察到有細(xì)胞克隆形成。(2)將已形成細(xì)胞克隆的培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下，觀察克隆的位置，并用記號(hào)筆將其標(biāo)出。(3)用鑷子夾取滅菌過的小濾紙片，在Verson中蘸濕后將其覆蓋在細(xì)胞克隆上，5～20s后取出在加有完全培養(yǎng)基(600uL/孔)的24孔板中刷洗數(shù)次，將附著上的細(xì)胞洗下。(4)將轉(zhuǎn)移有細(xì)胞克隆的24孔板置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃(5)待24孔板中的細(xì)胞生長(zhǎng)并達(dá)到80%以上滿底后，分別取細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。(6)將經(jīng)檢測(cè)可表達(dá)目的基因的細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)入50mL螺口培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，并在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候進(jìn)行傳代換液，擴(kuò)增細(xì)胞，進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。常用溶液、培養(yǎng)基配制LB培養(yǎng)基:每1000mL加分析純NaCl10g