蛋白質(zhì)的測(cè)定使用凱氏定氮法解說(shuō)

項(xiàng)目七

食品中蛋白質(zhì)及氨基酸態(tài)氮的測(cè)定本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第1頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分【學(xué)習(xí)目標(biāo)】1、掌握食品中氮含量與蛋白質(zhì)含量之間的換算。2、掌握凱氏定氮裝置的搭建技術(shù)。3、掌握蛋白質(zhì)的測(cè)定技術(shù)。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第2頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分【基礎(chǔ)知識(shí)】1、蛋白質(zhì)及氨基酸概述蛋白質(zhì)由兩性氨基酸通過(guò)肽鍵結(jié)合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是C、H、O、N。一般來(lái)說(shuō)，pro的平均含氮量為16/100，既一份氮相當(dāng)于6.25份蛋白質(zhì)，此數(shù)值稱(chēng)為蛋白質(zhì)系數(shù)。所以在用凱氏定氮法定量pro時(shí)，將測(cè)得的總氮%乘上pro的換算系數(shù)K=6.25即為該物質(zhì)的pro含量。注意：①含N是蛋白質(zhì)區(qū)別其他有機(jī)化合物的主要標(biāo)志。②不同種類(lèi)食品的蛋白質(zhì)系數(shù)有所不同，如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為6.25，花生為5.46，大米為5.95，大豆及其制品為5.71，小麥粉為5.70、全小麥、大麥、燕麥、裸麥和小米是5.83；硬果類(lèi)為5.30；牛乳及其制品為6.38。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第3頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分2、原理蛋白質(zhì)是含氮的有機(jī)化合物。食品與硫酸和硫酸銅、硫酸鉀一同加熱消化，使蛋白質(zhì)分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸胺。然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后以硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，根據(jù)酸的消耗量乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)的含量。氨基酸～HCl～N〖注意〗此法測(cè)定得到的蛋白質(zhì)含量，實(shí)際上包括核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、葉啉和含氮色素等非蛋白質(zhì)氮化合物，故稱(chēng)為粗pro。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第4頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分3、適用范圍國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于各種食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第5頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分4、任務(wù)分解任務(wù)一：濕法消化任務(wù)二：堿法蒸餾硼酸吸收任務(wù)三：鹽酸滴定任務(wù)四：數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第6頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)一：濕法消化子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第7頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備試劑作用硫酸銅a催化作用：加速有機(jī)物的氧化分解。b消化完全的指示劑：藍(lán)綠色，澄清，透明；c蒸餾時(shí)堿性反應(yīng)的指示劑：變深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀硫酸鉀提高溶液沸點(diǎn)，從而加快有機(jī)物分解濃硫酸氧化作用：有機(jī)物質(zhì)氧化分解為H2O和CO2本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第8頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)2：樣品預(yù)處理固體試樣0.2~2g半固體試樣2~5g液體試樣10~25g樣品充分混勻直接消化本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第9頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)3：樣品稱(chēng)量、消化1.000g奶粉0.2g硫酸銅6g硫酸鉀20mL濃硫酸玻璃珠小火加熱炭化至泡沫完全停止輕搖

大火加熱保持瓶中液體微沸至藍(lán)綠色澄清透明繼續(xù)加熱0.5～1h冷卻加20mL水冷卻同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第10頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分思考1、玻璃珠的作用？2、小漏斗的作用？3、消化過(guò)程為什么要不斷轉(zhuǎn)動(dòng)凱氏瓶？4、開(kāi)始消化時(shí)為什么用小火？5、消化液不易澄清透明時(shí)可采用的措施？6、消化完成時(shí)的產(chǎn)物？7、加20mL水的作用？8、空白試驗(yàn)的目的？本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第11頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)二：堿法蒸餾、硼酸吸收子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：10mL100mL3只本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第12頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備水蒸氣發(fā)生器：裝水至2/3處，加入數(shù)粒玻璃珠，加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml，使水呈微紅色→按上圖所示搭好裝置〖注意〗①裝置搭建好了之后要先進(jìn)行撿漏，利用虹吸原理。②在蒸汽發(fā)生瓶中要加甲基橙指示劑數(shù)滴及硫酸數(shù)ml以使其始終保持酸性，以防水中氨蒸出。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第13頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備試劑：40%氫氧化鈉20%硼酸溶液混合指示劑1、1份甲基紅乙醇溶液（1g/L）與5份溴甲酚綠乙醇溶液（1g/L）臨用時(shí)混合酒紅色→綠色2、2份甲基紅乙醇溶液（1g/L）與1份亞甲基藍(lán)乙醇溶液（1g/L）臨用時(shí)混合紫紅色→綠色本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第14頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)2：堿化蒸餾、硼酸吸收10.0mL硼酸溶液100mL三角瓶加1～2滴混合指示劑冷凝管下端插入三角瓶液面下準(zhǔn)確吸取10mL試樣由小玻杯流入反應(yīng)室少量水洗滌小漏斗蓋緊玻璃塞量筒取10.0mLNaOH溶液倒入小玻杯提起玻塞使其緩慢流入反應(yīng)室立即塞緊玻璃塞加水于小玻杯防漏氣通蒸汽顏色變化時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)蒸餾5min移動(dòng)接受瓶使液面離開(kāi)冷凝管下端再蒸餾1min用少量水沖洗冷凝管下端外部取下接收瓶本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第15頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分

〖注意〗①加入NaOH一定要過(guò)量，判斷NaOH是否過(guò)量的方法，看反應(yīng)室內(nèi)液體顏色本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第16頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分加堿足量的判斷：溶液會(huì)變成深藍(lán)色或產(chǎn)生黑色沉淀原理：過(guò)量的氫氧化鈉會(huì)跟硫酸銅反應(yīng)生成氫氧化銅藍(lán)色沉淀，藍(lán)色沉淀在加熱的情況下會(huì)分解成黑色的氧化銅沉淀。如果沒(méi)有上述現(xiàn)象，說(shuō)明氫氧化鈉加的量不足，需要繼續(xù)加入氫氧化納，直到產(chǎn)生上述現(xiàn)象為止。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第17頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分②樣液中的硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，為防止樣液中氨氣逸出。一是加入氫氧化鈉溶液要過(guò)量，二是要水封，三要夾緊廢液蝴蝶夾后再通蒸汽，四要在蒸餾過(guò)程中要注意接頭處有無(wú)松漏現(xiàn)象③加熱蒸餾出來(lái)的氨可以用硼酸進(jìn)行吸收，因?yàn)榕鹚嶂怀饰⑷跛嵝?，不影響指示劑的變色反?yīng)，但是具有吸收氨的作用，與氨形成強(qiáng)堿弱酸鹽。④冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸餾。吸收液溫度不應(yīng)超過(guò)40℃，避免氨氣逸出，若超過(guò)時(shí)可置于冷水浴中使用。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第18頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分⑤檢驗(yàn)蒸餾是否完成的方法：奈氏試紙法。原理:NH4+或NH3遇奈氏試劑會(huì)反應(yīng)生成綜紅色的碘化汞銨化合物，如NH4+或NH3含量較少，試紙呈黃色，若含量過(guò)多，呈棕黃色或棕紅色的沉淀反應(yīng)⑥在蒸餾時(shí)，蒸汽發(fā)生要均勻充足，蒸餾過(guò)程中不得?；饠嗥?否則會(huì)發(fā)生倒吸。⑦蒸餾完畢后，應(yīng)先將冷凝管下端提離液面，再蒸1分鐘，將附著在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶?jī)?nèi)，再將吸收瓶移開(kāi)，最后關(guān)閉電源，絕不能先關(guān)閉電源，否則吸收液將發(fā)生倒吸。⑧所用的試劑溶液必須用無(wú)氨蒸餾水配制。本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第19頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)三：鹽酸滴定子任務(wù)1：儀器及試劑的準(zhǔn)備儀器：25mL酸式滴定管1套試劑0.0500mol/LHCL標(biāo)準(zhǔn)溶液本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第20頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子任務(wù)2：鹽酸滴定接收瓶以HCL標(biāo)準(zhǔn)滴定液滴定灰色終點(diǎn)記錄VHcl（1）硼酸吸收液的顏色（2）吸收氨氣后的硼酸吸收液的顏色（3）鹽酸滴定終點(diǎn)的顏色本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第21頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分〖注意〗①混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。②酸式滴定管的正確使用本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第22頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分項(xiàng)目名稱(chēng)檢測(cè)日期樣品名稱(chēng)檢驗(yàn)依據(jù)內(nèi)容123空白樣品質(zhì)量m/gV初/mLV終/

mL消耗的體積V1/mL吸取消化液體積V3/mL蛋白質(zhì)含量（g/100g）平均值（g/100g）兩次測(cè)定之差/平均值精密度Cy

（g/100g）

F：牛乳及其制品的蛋白質(zhì)換算系數(shù)6.38任務(wù)四、數(shù)據(jù)記錄與計(jì)算本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第23頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分有效數(shù)字：蛋白質(zhì)含量≥1g/100g時(shí)，結(jié)果保留三位有效數(shù)字蛋白質(zhì)含量＜1g/100g時(shí)，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。精密度：在重復(fù)性條件下的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的10%（g/100g）本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第24頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分小結(jié)步驟反應(yīng)前后顏色變化濕法消化凱氏燒瓶：樣品無(wú)色（加硫酸前）→加硫酸炭化黑色→消化后紅棕色→棕褐色→消化終點(diǎn)藍(lán)綠色/墨綠色→淡藍(lán)色（冷卻后溶液）堿化蒸餾反應(yīng)室：深藍(lán)色或黑色沉淀硼酸吸收紫紅色→綠色鹽酸滴定甲基紅和溴甲酚綠混合指示劑：綠色→灰色甲基紅和亞甲基藍(lán)混合液：綠色→藍(lán)紫色本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第25頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分凱氏定氮法用于所有動(dòng)物、植物類(lèi)食品的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定，但因樣品中含有核酸、生物堿、含氮類(lèi)脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質(zhì)含氮化合物，所以測(cè)定結(jié)果為粗蛋白質(zhì)含量。若要測(cè)定樣品的蛋白氮,則需要向樣品中加入三氯乙酸溶液,使其最終濃度為5%,然后測(cè)定未加入三氯乙酸的樣品及加入三氯乙酸溶液后樣品中的含氮量,進(jìn)一步計(jì)算出蛋白質(zhì)含量:

蛋白氮=總氮-非蛋白氮本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第26頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)五：試驗(yàn)器具的清洗整理本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第27頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分【拓展學(xué)習(xí)】1、其他蛋白質(zhì)測(cè)定方法——分光光度法（1）原理食品中的蛋白質(zhì)在催化加熱條件下被分解，分解產(chǎn)生的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙酰丙酮和甲醛反應(yīng)生成黃色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長(zhǎng)400nm下測(cè)定吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)系列比較定量，結(jié)果乘以換算系數(shù)，即為蛋白質(zhì)含量。（2）特點(diǎn)快速、污染少、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)第二法本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第28頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分2、改良式凱氏裝置江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院泰州市質(zhì)監(jiān)局本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第29頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分3、自動(dòng)凱氏定氮法1.原理同常量凱氏定氮法2.主要儀器

自動(dòng)凱氏定氮儀：該裝置內(nèi)具有自動(dòng)加堿蒸餾裝置，自動(dòng)吸收和滴定裝置以及自動(dòng)數(shù)字顯示裝置。消化裝置：由優(yōu)質(zhì)玻璃制成的凱氏消化瓶及紅外加熱裝置組合成的消化爐。3、試劑

除硫酸銅與硫酸鉀制成片劑外，其他試劑與常量測(cè)定相同。4、優(yōu)點(diǎn)靈敏、準(zhǔn)確、快速以及用量少本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第30頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分準(zhǔn)確稱(chēng)取某乳粉樣品0.800克，經(jīng)凱氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液進(jìn)行蒸餾，用20ml硼酸吸收，再用0.05000mol/lHCl滴定，結(jié)果消耗5.00ml，試計(jì)算該乳粉的蛋白質(zhì)含量？試述蛋白質(zhì)測(cè)定中，樣品消化過(guò)程所必須注意的事項(xiàng)，消化過(guò)程中內(nèi)容物顏色發(fā)生什么變化？為什么？樣品經(jīng)消化進(jìn)行蒸餾前，為什么要加入氫氧化鈉？這時(shí)溶液發(fā)生什么變化？為什么？如果沒(méi)有變化，說(shuō)明什么問(wèn)題？須采用什么措施？本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第31頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分子項(xiàng)目二14醬油中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定（GB/T5009.39-2003）本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第32頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)一：相關(guān)儀器設(shè)備及試劑的準(zhǔn)備

儀器設(shè)備：堿式滴定管、移液管、200mL燒杯、100容量瓶、酸度計(jì)、磁力攪拌器、滴定臺(tái)試劑：濃度為36%中性甲醛；氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.05mol/L（需臨用前標(biāo)定）本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第33頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分任務(wù)二：成分分析

1.原始記錄表格的設(shè)計(jì)本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第34頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分項(xiàng)目名稱(chēng)檢測(cè)日期樣品名稱(chēng)檢驗(yàn)依據(jù)樣品滴定次數(shù)加甲醛前加甲醛后空白滴定V2初讀數(shù)末讀數(shù)消耗體積初讀數(shù)末讀數(shù)消耗體積V112氨基酸態(tài)氮含量X（g/100mL）=平均值精密度本文檔共42頁(yè)；當(dāng)前第35頁(yè)；編輯于星期三\17點(diǎn)57分2.樣品中游離酸中和吸取5mL試樣→100mL容量瓶中→定容→混勻后吸取20.0mL→200mL燒杯→加水60mL→插入酸度計(jì)的指示電極和參比電極→開(kāi)動(dòng)磁力攪拌器→0.050mol/L氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定至