圓二色譜原理

關(guān)于圓二色譜原理第1頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三光學(xué)活性分子對左、右圓偏光的吸收率的差值第2頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三1、自然光光具有波、粒二象性，是橫電磁波。只有橫波才有偏振現(xiàn)象:光矢量的振動方向與光的傳播方向垂直，

在垂直于光傳播方向的平面內(nèi),有不同的振動方向。電場矢量E和磁場矢量H互相垂直、位相相同。v0HE第3頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三由于感光作用都是E引起的，因而，將E作為光矢量。振動面：E與光傳播方向組成的平面。E傳播方向振動面第4頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三從統(tǒng)計規(guī)律上說，自然光的光振動:在垂直于光速的平面上遍布所有方向，沿各方向振動的光矢量呈對稱分布,相應(yīng)光矢量的振幅（光強(qiáng)度）相等。第5頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三（1）高亮度的點光源；

（2）日光色。色溫接近6000K；

（3）在可見光區(qū)連續(xù)光譜；

（4）高顯色性，顯色指數(shù)＞95；

（5）在整個壽命期內(nèi)維持光色特性；

（6）高電弧穩(wěn)定性；

（7）熱重啟能力；

（8）啟動后即能達(dá)到接近最大光輸出；

（9）電弧光斑小、易聚光。超高壓短弧氙燈:在高壓純凈氙氣中放電發(fā)光。第6頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三自然光平面偏振光圓偏振光樣品橢圓偏振光第7頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三雙折射現(xiàn)象：一束光射入各向異性晶體后有兩束折射光。尼科耳棱鏡。2、光的偏振在生物樣品中，肌肉纖維、骨骼和牙齒等具有各向異性，淀粉粒、染色體和紡錘體等具有雙折射性，因此被用于組織細(xì)胞的化學(xué)研究。第8頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三名稱折射定律折射率傳播方向?qū)こ９猓╫光）遵守對于晶體一切方向都具有相同的折射率在入射面內(nèi)非常光（e光）不遵守折射率隨方向而變化不一定在入射面內(nèi)第9頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三o光和e光：頻率相同、振動方向相互垂直、平面偏振光第10頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三自然光入射到某些晶體（電氣石、硫酸金雞鈉堿晶體等）時，晶片吸收振動面與晶軸垂直的光，而只允許振動面平行于晶軸的光通過。第11頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三自然光平面偏振光起偏器檢偏器晶軸相互平行時，透射光強(qiáng)度最大；晶軸相互垂直時，透射光強(qiáng)度為零；晶軸夾角為α?xí)r，透射光強(qiáng)度與cos2α成正比。.................第12頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三也稱線（完全）偏振光，簡稱偏振光。它的振動面稱為其偏振面。振動方向保持不變振幅發(fā)生周期性變化E之端點在空間的軌跡為一平面正弦曲線投影到垂直于光傳播方向的平面上為一直線段3、平面偏振光（Planepolarizedlight）第13頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三4、布儒斯特角當(dāng)入射光射到兩種介質(zhì)界面上時，反射光和折射光的偏振情況與入射光不同。第14頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三5、四分之一波片使o光和e光的光程相差1/4波長的晶片。此時，相位差為π/2，透射的合成光是長軸與晶軸重疊的正橢圓偏振光。第15頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三朝光源看，電場矢量方向按順時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為右圓偏振光；電場矢量方向按逆時針方向旋轉(zhuǎn)的，稱為左圓偏振光。若入射平面偏振光的電矢量與晶體晶軸的夾角θ＝45°，則Eo=Ee，合成光是圓偏振光（Circularpolarizedlight）。第16頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三6、光的疊加一束自然光可以看作是兩束相互垂直而沒有相位關(guān)系的平面偏振光的加和。第17頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三旋轉(zhuǎn)方向相反的左、右圓偏光透過一光學(xué)活性物質(zhì)后透過的左、右圓偏光振幅相位矢量和相等相同平面偏振光相等不同平面偏振光，方向改變不等相同橢圓偏振光不等不同橢圓偏振光，方向改變第18頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三振幅相等、振動方向相互垂直、相位相差1/4波長的兩平面偏振光合成圓偏振光右旋第19頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三7、旋光色散（Opticalrotatory

dispersion，ORD）旋光性：光學(xué)活性分子對左、右圓偏光的折射率不同，透射光雖然仍然為平面偏振光，但其偏振面旋轉(zhuǎn)了一定的角度。旋光物質(zhì)又稱為光學(xué)活性物質(zhì)。旋光度：偏振面旋轉(zhuǎn)的角度

旋光色散：不同波長的偏振光的旋轉(zhuǎn)角度不同。旋光儀是測量旋光性與波長的函數(shù)關(guān)系，從而得到一個旋光色散譜。第20頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三圓雙折射：某個物質(zhì)對于左、右圓偏光的折射率分別為nL和nR，

若

nL=nR，則為光學(xué)各向同性物質(zhì)；若

nL≠nR，則為光學(xué)各向異性物質(zhì)；左、右圓偏光的相位改變，若nL＞nR，透射光的偏振面右旋。若nL＜nR，透射光的偏振面左旋。旋光現(xiàn)象是圓雙折射的一種特殊形式。旋光物質(zhì)使左、右圓偏振光的速度不同，即其色散大小的折射率不同，旋光現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于光學(xué)各向異性物質(zhì)的折射率nL≠nR的結(jié)果。第21頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三旋光，雙折射第22頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三化合物在正常情況下，處于低能的基態(tài)，電子占據(jù)所有的成鍵軌道（σ、π、n軌道）。如果電子吸收了外界的能量，它就從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)能級。如果所有的躍遷僅在基態(tài)的最低振動能級和第一激發(fā)態(tài)之間，吸收光譜將是很狹窄而不連續(xù)的譜線。由于分子的價電子躍遷總伴隨著振動和轉(zhuǎn)動能級的躍遷，所以，紫外分光光度計測定物質(zhì)的吸收光譜，雖然有一最大吸收峰值，但都是具有一定波長寬度并相對平滑的曲線。8、光的吸收和圓二色性（circulardichroism,CD）第23頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三光的吸收若溶液中的溶質(zhì)對某一波長的入射光有吸收，則透射光的光強(qiáng)度小于入射光。第24頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三圓二色性的存在將通過該物質(zhì)傳播的左、右圓偏光變成橢圓偏振光。并且只在發(fā)生吸收的波長處才能觀察到。第25頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三理論計算的圓二色性與該橢圓偏振光的摩爾橢圓率的關(guān)系：[θ]=100θ/（c·l）=3300（εL-εR）ε：介質(zhì)對圓偏振光的摩爾消光系數(shù)，

c：樣品摩爾濃度，l：樣品厚度（cm），[θ]單位：℃/（mol·cm）或℃·

cm2/dmol。第26頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三圓二色性的表示吸收（率）差

=L-

R

A=AL–AR

橢圓度，摩爾橢圓度[]

=2.303（AL–AR）/4

[]=3298（L-

R）3300（L-

R）

在蛋白質(zhì)研究中，常用平均殘基摩爾橢圓度第27頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三園二色＋雙折射第28頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三9、ORD與CD光譜同時產(chǎn)生，包括同樣的分子結(jié)構(gòu)信息：光學(xué)活性物質(zhì)分子中的不對稱生色團(tuán)。CD反映光與分子間能量的交換，旋光性則是與分子中電子的運動有關(guān)?？梢杂蒏ronig-Krammers轉(zhuǎn)換方程相互轉(zhuǎn)換。第29頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三CD譜的極值處與吸收峰一致（科頓效應(yīng)，cottoneffect），因而分子中不同生色團(tuán)對于譜的貢獻(xiàn)比在ORD中更容易分辨。ORD是漸近線，兩端不回歸ORDCD吸收帶附近，旋光度由負(fù)到正正Cotton效應(yīng)正CD帶吸收帶附近，旋光度由正到負(fù)負(fù)Cotton效應(yīng)負(fù)CD帶第30頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三CD比ORD容易辨別重疊峰CD比ORD弱帶易檢測CD比ORD更容易擬合CD比ORD提供較多意義明確的信息表明有三個生色團(tuán)，其中兩個有光學(xué)活性第31頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三CD能夠提供的信息：primarystructure,secondarystructuretertiarystructureAlpha-helix,beta-sheet肽鏈骨架的構(gòu)象變化蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜主要有兩個峰：190-250nm：肽鍵280-290nm：酪氨酸t(yī)yr，色氨酸t(yī)rp第32頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三10、J-810圓二色光譜儀S1-S2:第一級單色器；S2-S3:第二級單色器;M：球面反光鏡；P：晶體石英棱鏡；L:透鏡；F:濾光器；第33頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三由CDM交互形成的左、右旋圓偏光通過光學(xué)活性物質(zhì)，透射光強(qiáng)度隨時間的變化當(dāng)調(diào)制電壓過其峰值（正和負(fù)）時，εR＞εL時，透過的右旋圓偏光的光強(qiáng)對應(yīng)于最大值，而左旋最?。▽嵕€）；εR＜εL時，透過的左旋圓偏光的光強(qiáng)對應(yīng)于最大值，而右旋最?。ㄌ摼€）。PMT的輸出信號由正比于IA的直流分量和正比于S的交流分量所組成。直流成分IA=（IL+IR）/2交流成分S相當(dāng)于圓二色性透射光強(qiáng)的變化頻率與外加調(diào)制電壓的頻率相同。第34頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三圓二色光譜儀工作原理用相同強(qiáng)度，相同頻率的左、右旋圓偏光交替照射樣品測得透過樣品后的強(qiáng)度IR和IL由于IR和IL十分接近，令I(lǐng)A=（IL+IR）/2，S=IR–IL只放大相應(yīng)于S的PMT輸出電壓Es（交流信號），而不放大相應(yīng)IA的輸出電壓EA。（適當(dāng)選取放大倍數(shù)G值，使ESG與EA可比）。第35頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三PeltierCellHolderCD/TotalFluorescenceFMOStoppedFlow-20～200℃第36頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三Thepeptidebondisinherentlyasymmetricandisalwaysopticallyactive蛋白質(zhì)的光學(xué)活性第37頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三1、氨基酸的圓二色性可見光區(qū)：各種氨基酸都沒有光吸收。紫外光區(qū)：只有芳香族色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸有吸收。氨基酸分子內(nèi)的紫外生色基團(tuán)：吲哚基、酚羥基、苯基、二硫鍵、咪唑基和羧基等。第38頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三2、肽的圓二色譜活性肽構(gòu)象與其生理功能的關(guān)系肽的構(gòu)象也是蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種模型。肽的圓二色性為研究肽在溶液中的構(gòu)象提供了重要信息。第39頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三Far-UV(250-170nm)SecondaryStructure:α-helix,β-sheet,β-turn,randomTertiaryStructureClass:all-α,α+β,α/β,all-βI,all-βIINear-UV(320-250nm)：aromaticsidechainNear-UV~Near-infrared(300-1000nm)：coloredproteins第40頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三苯丙氨酸（phenylalanine，

Phe）：255、261和268nm附近；酪氨酸（tyrosine，

Tyr）：277nm左右；色氨酸（tryptophan，

Trp）：279、284和291nm附近；二硫鍵的變化反映在整個近紫外區(qū)。芳香氨基酸殘基及二硫鍵處于不對稱微環(huán)境時，在近紫外區(qū)表現(xiàn)出CD信號第41頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三FarUVCDspectraofpoly-L-Lys1、100%α-螺旋2、100%β-折疊3、100%無規(guī)卷曲第42頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三-band(nm)+band(nm)α-helix222208192β-sheet216195β-turn220-230(weak)180-190(strong)205polyproIIhelix190210-230weakRandomcoil200212MainCDfeaturesofprotein2ndarystructures第43頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三3、估算蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)含量僅適合含量較高的蛋白質(zhì)！將測得的CD曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合。xa+xb+xc=1.0qt=xaqa+xbqb+xcqc改變xa、xb和xc，使qt與樣本曲線最佳擬合（最小二乘法，leastsquaresminimization）未知結(jié)構(gòu)的蛋白的CD信號第44頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三myoglobin

qt=xaqa+xbqb+xcqcfitsbestwith

xa=80%

xb=0% xc=20%

agreeswellwithstructure 78%helix,22%coilForfurtherdetails:/cd/cdtutorial.htm第45頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三GCN4-p1

0oC：100%helix 75oC：0%helixwhatabout50oC?

qt=xoqo+x75q75fitsbestwith

xo

=50%

x75=50%

Showsthatat50oC

1/2ofpeptidea-helixdimer

1/2ofpeptiderandomcoilmonomer第46頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三

Lau,TanejaandHodges(1984)J.Biol.Chem.259:13253-13261螺旋二聚體分解為單螺旋三氟乙醇（trifluoroethanol，TFE）誘導(dǎo)肽鏈形成螺旋TFE對卷曲螺旋（coiled-coil）的影響

第47頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三——

chymotrypsin(allb)——lysozyme(a+b)——triosephosphateisomerase(a/b)——myoglobin(alla)CDsignalofaproteindependsonits2ndarystructure第48頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第49頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三pH變化引起的肌球素變性前后CD譜的動力學(xué)變化第50頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三稀釋前后的熒光和CD譜從伸展到折疊α螺旋含量的變化的動力學(xué)檢測KineticTraceat222nm(secondarystructureregion)Unfoldingstate(random)Refoldingstate(α-Helix)第51頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三Kinetictracesat289nm(Aromaticsidechainregion)細(xì)胞色素c伸展和折疊狀態(tài)的CD和熒光光譜反映了芳環(huán)側(cè)鏈（色氨酸殘基）的變化鹽酸胍中的細(xì)胞色素c(伸展?fàn)顟B(tài))與PBS混合后的CD和熒光光譜第52頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三6、磁圓二色譜

（MagneticCircularDichroism，MCD）磁性材料對左、右圓偏光的吸收不同而產(chǎn)生的二色性現(xiàn)象。利用法拉第效應(yīng)，在外加磁場的作用下，許多原來沒有光學(xué)活性的物質(zhì)也具有了光學(xué)活性，原來可測得CD譜的，在磁場中CD信號可增大幾個數(shù)量級。7000Gauss

第53頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三實驗要點第54頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三SampleconcentrationAgoodsuggestionistoruninadvanceanabsorptionUV-VISspectra.CDspectroscopycallsforsamerequirementsasUV-VIS:bestS/Nisobtainedwithabsorbancelevelintherange0.6to1.2.It’susuallydifficulttogetproperdatawhenabsorbance(ofsample+solvent)isover2O.D.第55頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三樣品杯：高度均勻的熔融石英，不會帶來附加的圓二色性。光程：0.01cm-1cm，為了降低溶劑影響，一般提高樣品濃度，用短光程。cellpathlength第56頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三NitrogenflushingFlushingtheopticswithdrynitrogenisamust:Xelamphasaquartzenvelope,soifoperatedinairit’lldevelopalotofozone,harmfulforthemirrorsbelow195nmoxygenwillabsorbradiation第57頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三HTplotTheHTplotisveryimportant,sincereadingsabove600-650Vmeanthatnotenoughlightisreachingthedetectorsoasampledilutionortheuseofshorterpathcellarerequired.theHTplotisinrealtyasinglebeamspectraofoursample,sincethereisadirectrelationbetweenHTandsampleabsorbance.BydatamanipulationHTconversionintoabsorbanceandbufferbaselinesubtractionispossible.AlternativelysinglebeamabsorbancescalecanbeusedalreadyinCH2duringdatacollection,loosinghoweverabitthealertingfunctionsofthischannel.第58頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三第59頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三Bandwidth(SBW)selectionSettingofslitsshouldbeaslargeaspossible(todecreasenoiselevel),butcompatibletothenaturalbandwidth(NBW)ofthebandstobescanned.AsaruleSBWshouldbekeptatleast1/10oftheNBW,otherwisethebandwillbedistorted.IfNBWisnotknownaseriesoffastsurveyspectraatdifferentSBWwillhelpproperselection.Tradeinofaccuracyversussensitivity(i.e.theuseoflargerthantheoreticalSBW)isoccasionallyrequired.2nminthefarUVregion1nminthearomaticregion(wherefinestructuresmaybepresent),optimalband-pass(aslargeaspossible,butnotloosinginformation)canbedeterminedafteratrial第60頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三標(biāo)準(zhǔn)操作時譜帶寬度選為1nm；高分辨率測量用較窄的狹縫寬度，此時PMT電壓較高，信噪比差；當(dāng)樣品的光密度很高、CD很小時，就要保持測試CD峰多需要的足夠濃度，并用較寬的狹縫寬度。此時，由于樣品OD值過高，可能存在有熒光或雜散光引起的某些假象。第61頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三Numberofdatapointdatapitch,i.e.numberofdatapointspernm,willnotdirectlyinfluencethenoiselevel.Howeverifpostrunfurtherdataprocessingwillbeappliedtoreducethenoise,it’sadvisabletocollectasmanydatapointsaspossibletoincreasetheefficiencyofthepostrunfilteringalgorithm第62頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三AccumulationanotherwaytoimproveS/Nistoaveragemorespectra.HeretootheS/Nwillimprovewiththesquarerootofthenumberofaccumulations.Averagingisveryeffectivesinceitcompensatesshorttermrandomnoise,butit’llnotcompensatelongtermdrifts(mainlyofthermalorigin).Soiflongaccumulationsareusedwerecommendasuitablelongwarm-upofthesystemand/ortheuseofasamplealternator(tocollectsequentiallysampleandblankandaveragetheirsubtractedvalues).Forlongovernightaccumulationsit’sessentialthatroomtemperatureiswellkeptstable.第63頁，講稿共72頁，2023年5月2日，星期三BufferSystemsforCDAnalysesAcceptable:

1.PotassiumPh