細胞工程概述

細胞工程概述一、細胞工程在現(xiàn)代生物技術(shù)中的地位1.應(yīng)用生命科學及工程學的原理和技術(shù)，對生物進行控制和改造，以實現(xiàn)人類特殊需求的綜合性技術(shù)。第一節(jié)概述基因工程蛋白質(zhì)工程酶工程發(fā)酵工程染色體工程細胞工程2.生物技術(shù)的研究領(lǐng)域基因工程

在分子水平上，用人工方法提取、合成或重組不同生物的遺傳物質(zhì)，并通過載體把重組分子引入受體細胞，使其復(fù)制與表達,最終實現(xiàn)商業(yè)價值的技術(shù)。

基因工程基本過程轉(zhuǎn)化子篩選載體選擇目的基因提取體外DNA重組引入受體細胞重組DNA檢測蛋白質(zhì)工程

蛋白質(zhì)工程就是在對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能認識基礎(chǔ)上，對蛋白質(zhì)進行人工改造與合成，最終獲得商業(yè)化產(chǎn)品的技術(shù)。功能檢測

蛋白質(zhì)工程的基本過程分離純化目的蛋白測定氨基酸序列分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)設(shè)計編碼該蛋白基因分離、純化蛋白

通過預(yù)先設(shè)計，經(jīng)過人工操作控制而獲得大量所需的酶，并采用各種方法使酶發(fā)揮最大催化功能，而應(yīng)用于社會的一門技術(shù)。酶工程酶工程的基本過程分離純化酶反應(yīng)動力學測定酶固化酶的修飾與改造酶的生產(chǎn)

利用現(xiàn)存微生物和經(jīng)DNA重組技術(shù)改造的微生物在全自動發(fā)酵罐或生物反應(yīng)器中生產(chǎn)某種商品的技術(shù)。發(fā)酵工程

發(fā)酵工程的基本過程菌種選育大規(guī)模培養(yǎng)活性產(chǎn)物誘導菌體及產(chǎn)物收獲染色體工程

按照一定設(shè)計，有計劃地削減、添加和替換同源或異源染色體及某一部分，從而達到定向改變遺傳特性和選育新品種的技術(shù)。細胞工程

是在細胞水平上，采用細胞生物學、發(fā)育生物學和分子生物學等理論方法，按人們需要和設(shè)計改變或創(chuàng)造細胞遺傳特性的綜合技術(shù)。

按照人們的設(shè)想，置換細胞質(zhì)或細胞器。細胞質(zhì)工程二、細胞工程的理論基礎(chǔ)三、細胞工程的研究范圍

微生物細胞工程植物細胞工程動物細胞工程轉(zhuǎn)基因生物第二節(jié)細胞工程的主要技術(shù)

一、大規(guī)模細胞體外培養(yǎng)二、細胞融合三、細胞核移植四、基因轉(zhuǎn)移

根據(jù)培養(yǎng)物的不同分為細胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和器官培養(yǎng)。一、大規(guī)模細胞體外培養(yǎng)

將活體中取出的組織或細胞，制成單個細胞懸液，并培養(yǎng)于固體基質(zhì)或培養(yǎng)液中，使之生長和生存，并維持其結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。細胞培養(yǎng)

將一小片活體組織放在盛有培養(yǎng)液的培養(yǎng)器皿中，使之貼壁生長過程。組織培養(yǎng)

使器官原基、一部分或整個器官在體外存活、生長，并保持其原有結(jié)構(gòu)和功能的技術(shù)。器官培養(yǎng)（二）細胞培養(yǎng)概述1.體內(nèi)外細胞培養(yǎng)的差異和分化失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài)，分化特性減弱或不顯，出現(xiàn)類似“反祖”現(xiàn)象；細胞趨單一化，或獲得永生及變成惡性細胞群。體外★排列成放射狀，漩渦狀并不緊靠連成片★細胞—細胞接觸易斷開而單獨行動

★游離的成纖維樣細胞，常有細胞突起★很少脫離細胞群而單個活動2.培養(yǎng)細胞分類粘附型細胞：附著在某一固相支持物表面才能生長的細胞。

（上皮細胞型和成纖維細胞型）

脾、骨髓及白細胞在懸浮中生長良好，細胞圓形，單個或小細胞團生存空間大，數(shù)量多，傳代方便，易收獲，可獲穩(wěn)定狀態(tài)懸浮型細胞：

不附著于固相支持物表面，而在懸浮狀態(tài)下生長的細胞。3.培養(yǎng)細胞形態(tài)不穩(wěn)定性血清高血清-----成纖維細胞樣低血清-----上皮細胞樣pH太酸或太堿-----成纖維細胞樣標準-----上皮細胞樣細胞密度低密度-----

成纖維細胞樣

高密度-----

上皮細胞樣生長狀態(tài)貼附-----成纖維或上皮樣懸浮-----

圓形轉(zhuǎn)化未轉(zhuǎn)化

-----

成纖維細胞樣轉(zhuǎn)化-----

上皮細胞樣Hela3T3（1）貼附（2）接觸抑制（3）密度抑制4.培養(yǎng)細胞的生長特點（1）培養(yǎng)細胞生命期

指細胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間，包括原代培養(yǎng)期、傳代培養(yǎng)期及衰退期。5.培養(yǎng)細胞的生長和增殖原代培養(yǎng)期:也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1-4周。特點:細胞呈活躍移動，可見細胞分裂，但不旺盛。與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上相似性大。傳代期:當細胞增殖達到一定密度后，由于生存空間和營養(yǎng)有限，必需分離出一部分細胞和更新營養(yǎng)液，以保持細胞的繼續(xù)生存，這一過程叫傳代。特點:在全生命期中此期的持續(xù)時間最長，細胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型。衰退期特點:此期細胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。（2）體外培養(yǎng)細胞生存期(潛伏期;指數(shù)增生期;停滯期)細胞的“一代”是指從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間。6.培養(yǎng)細胞生存所需基本物質(zhì)（1）糖（2）氨基酸（3）維生素（4）促生長因子（5）其它物質(zhì)（三）大規(guī)模細胞培養(yǎng)原則

使細胞的高密度和高濃度生長，以制備大量細胞或細胞產(chǎn)物的方法，培養(yǎng)容量常在2L以上。1.增加培養(yǎng)容積2.擴大細胞附著面積3.抑制細胞凋亡3.抑制細胞凋亡

也稱細胞程序性死亡，是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的，細胞自主有序的死亡。凋亡小體大小不等，有完整膜包裹的，內(nèi)含胞質(zhì)、細胞器及染色質(zhì)片段的結(jié)構(gòu).

4.無血清培養(yǎng)基(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(2)生長因子和激素(3)基質(zhì)（四）大規(guī)模細胞培養(yǎng)方法1.懸浮培養(yǎng)系統(tǒng)

細胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長和增殖的培養(yǎng)方法。優(yōu)點：◆設(shè)備簡單，成本低。◆容積可選擇性大。◆可連續(xù)收集培養(yǎng)細胞和產(chǎn)物進行分析、傳代?！魺o須消化，防止細胞損傷?！艏毎麧舛染?，產(chǎn)量恒定。缺點：◆震蕩(避免沉降)。◆不斷充氣(細胞代謝和氣體交換)。◆易產(chǎn)生氣泡(添加抗泡沫劑)。2.固定化培養(yǎng)是細胞限制或定位于特定空間位置的培養(yǎng)技術(shù)。吸附法：使細胞在適當條件下貼附在載體表面、中空纖維膜或容器表面的技術(shù)。包埋法：將細胞包埋于多聚物等海綿狀基質(zhì)中進行培養(yǎng)的技術(shù)。優(yōu)點：◆細胞可維持在較小體積培養(yǎng)液中生長?！艏毎L密度較高。◆培養(yǎng)液易于更換。易進行實時分析。3.氣流驅(qū)動培養(yǎng)系統(tǒng)

通過位于中心氣流管底部的的噴射裝置將混合氣體注入容器，使培養(yǎng)物在容器中循環(huán)流動培養(yǎng)的技術(shù)。優(yōu)點：◆簡化設(shè)計，降低成本.◆以氣體為循環(huán)培養(yǎng)動力，防止機械攪拌損傷.4.微載體培養(yǎng)系統(tǒng)

細胞吸附于微載體表面，并借助于攪拌器作用，均勻懸浮于培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)的技術(shù)優(yōu)點:擴大細胞附著表面積缺點:微載體之間的相互聚集

(蛋白水解酶和適當攪拌力)5.灌注培養(yǎng)系統(tǒng)

將細胞培養(yǎng)在能以相同速率自動替換培養(yǎng)液的容器中的技術(shù).優(yōu)點:◆可使細胞始終處于一個教好的營養(yǎng)狀態(tài)和生存環(huán)境.◆可連續(xù)收集培養(yǎng)細胞所分泌的產(chǎn)物.◆可通過改變培養(yǎng)液的組成實現(xiàn)對細胞狀態(tài)的人為調(diào)控.缺點:

設(shè)備復(fù)雜,需大量培養(yǎng)基質(zhì),細胞狀態(tài)不穩(wěn),易污染.

1)研究對象是活細胞2)研究條件可人為控制3)樣本可達到均一4)便于觀察、檢測和記錄5)研究范圍廣泛6)費用經(jīng)濟1.細胞培養(yǎng)的優(yōu)點（五）細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用1)人工模擬條件與體內(nèi)實際情況不完全相同。2)長期生活在缺乏動態(tài)平衡的體外培養(yǎng)環(huán)境中,細胞特性將發(fā)生變化。2.細胞培養(yǎng)的缺點生物技術(shù)上：生產(chǎn)各種生技術(shù)產(chǎn)品。

狂犬病、小兒麻痹癥等病毒疫苗、表皮生長因子、干擾素、白細胞介素等進行單克隆抗體制備?？茖W研究上：病毒學、免疫學、遺傳學、腫瘤學等。臨床醫(yī)學上：胎兒的遺傳性疾病分析，藥物篩選及某些疾病的治療等。3.細胞培養(yǎng)意義二、細胞融合

也稱體細胞雜交,指兩個或兩個以上的細胞合并形成一個細胞的技術(shù)。（同核體，異核體）（二）細胞融合的基本原理◆基于酶缺陷型細胞和藥物抗性建立篩選◆基于營養(yǎng)缺陷型細胞建立篩選◆由溫度敏感型細胞組成的雜種細胞篩選◆具有所需性狀的雜種細胞篩選異核細胞：非同源細胞的融合體。同核細胞：兩個相同細胞的融合體。多核細胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。2.細胞融合類型根據(jù)融合細胞核的類型:3.融合因素仙臺病毒紫外線喪失感染活性（不感染細胞）保留融合活性（誘導細胞融合）滅活的仙臺病毒新城雞瘟病毒皰疹病毒聚乙二醇4.細胞融合過程2）誘導融合：1）自然融合：(三)細胞融合方法生物法:

物理法:化學法:優(yōu)點:打破了細胞融合的種屬屏障。缺點:病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異。1.生物法(仙臺病毒法)利用滅活病毒特性促進細胞融合的方法.步驟：★兩細胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；★病毒作用細胞膜,使兩細胞膜及胞質(zhì)互相滲透；★兩細胞核互相融合，細胞融為一體；★細胞正常分裂成含有兩種染色體的雜種細胞。2.物理法利用物理條件促進細胞融合的方法.步驟細胞膜接觸→膜擊穿→膜融合電脈沖誘導

在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面電位發(fā)生改變，使異種細胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂并連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。優(yōu)點：

☆融合率高、重復(fù)性強、對細胞傷害小；

☆裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察融合過程；

☆誘導過程可控性強。2.物理法步驟細胞膜接觸→膜擊穿→膜融合3.化學法利用化學試劑促進細胞融合的方法.鹽類融合法高鈣和高pH值融合法聚乙二醇融合法(PEG法)聚乙二醇（PEG）法PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成H鍵，從而在質(zhì)膜之間形成分子橋，使細胞質(zhì)膜發(fā)生粘連和融合。另外，PEG能增加脂膜的流動性，使細胞的核、細胞器發(fā)生融合成為可能。機理◆分子量大于200小于6000者均可用作細胞融合劑,

一般分子量低于1000的PEG作融合劑最好。50％PEG溶液能產(chǎn)生最多雜交細胞。PEG溶液在pH=6.0時細胞融合率最高。條件優(yōu)點:◆易得，用法簡單，勿需特殊設(shè)備，融合成本低；◆融合易控制,效果穩(wěn)定,產(chǎn)生的異核率較高；◆融合過程不受物種限制。缺點:◆融合過程繁瑣，可能對細胞有毒害。

特點步驟細胞混合→PEG處理→膜融合★研究細胞的核質(zhì)關(guān)系★揭示疾病發(fā)生的機制★用于基因定位研究★用于動植物育種和植物種質(zhì)保存★生產(chǎn)單克隆抗體、生物藥和疫苗★用于細胞療法(四)細胞融合的應(yīng)用★發(fā)酵工業(yè)優(yōu)良菌種改良人源單克隆抗體主要困難:（1）缺乏合適的人骨髓瘤細胞株作為融合親本。（2）雜交瘤抗體產(chǎn)生水平低，且細胞不穩(wěn)定，易喪失抗體分泌能力；（3）獲得抗原特異的人B淋巴細胞十分困難；（4）人雜交瘤細胞在鼠類中誘生腹水是很困難的。問題:1.細胞株的遺傳性不穩(wěn)定

2.存在倫理方面的問題前景:1.有望對細胞凋亡、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生、腫瘤發(fā)生、干細胞生物學等生命現(xiàn)象作出詮釋,2.可對癌癥及傳染病進行有效的防護和治療。3.有望克隆出人類胚胎,用于治療性克隆研究,4.可通過人類胚胎干細胞,在體外誘導分化,克隆出人體組織和器官。(五)存在問題及醫(yī)學應(yīng)用前景

利用顯微操作技術(shù)將一個細胞的細胞核移植到另一個去核細胞中，或者將兩個細胞的細胞核（或細胞質(zhì)）進行交換，以獲得重組細胞并發(fā)育成無性雜交新個體的技術(shù)。三、細胞核移植(一)細胞核移植技術(shù)的建立(二)核移植技術(shù)過程核受體細胞制備核供體細胞制備細胞核移植與激活重組細胞的培養(yǎng)胚胎移入1．核受體細胞的準備去核卵母細胞★激素刺激雌體超排卵★直接吸出濾泡卵丘在體外培養(yǎng)成熟2．核供體細胞的準備供體細胞來源胚胎卵裂球體細胞胚胎干細胞3．細胞核移植與激活胞質(zhì)內(nèi)注射（直接）方法透明帶下注射（融合）

重組細胞移入中間受體作體內(nèi)或體外培養(yǎng)，發(fā)育至桑椹胚或囊胚過程。羊、牛、豬——體內(nèi)培養(yǎng)大鼠、小鼠和兔——體外培養(yǎng)4．重組細胞的培養(yǎng)5．胚胎移植代孕母體外部特征明顯與供體品種不同繁殖性能強體格稍大和健康品種同期發(fā)情處理移入子宮個體選擇發(fā)育(三)核移植技術(shù)的應(yīng)用1．制備轉(zhuǎn)基因動物；2．培育優(yōu)良畜種，擴大良種種群；3．開展動物克隆，拯救瀕危動物；4．與干細胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克?。?．進行生物藥物生產(chǎn)；6.研究生物學的基本問題。

從轉(zhuǎn)基因羊的羊奶中提取出治療心臟病的藥物tPA藥物生產(chǎn)(一)基因轉(zhuǎn)移概述

將外源基因?qū)胧荏w細胞,并整合到受體細胞基因組中，使其遺傳性狀及表型發(fā)生一定改變的技術(shù)。四、基因轉(zhuǎn)移1.基因轉(zhuǎn)移概念外源目的基因制備外源目的基因有效導入受體細胞篩選攜有目的基因細胞2.基因轉(zhuǎn)移過程▲采用限制性內(nèi)切酶，從生物組織中獲取?！ㄟ^mRNA合成cDNA。▲

人工合成DNA片段?！?/p>

聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增特定基因片段。（1）目的基因選擇3.基因轉(zhuǎn)移方法（2）目的基因克隆★通過載體在宿主中克隆選擇載體目的基因與載體連接重組體導入受體細胞

★通過

PCR反應(yīng)克?。?）目的基因轉(zhuǎn)移電穿孔法顯微注射法脂質(zhì)體包埋法磷酸鈣介導DNA共沉淀法病毒介導法（二）轉(zhuǎn)基因動物

穩(wěn)定整合入基因組中的外源基因，能通過生殖細胞傳給后代，并發(fā)育成完整個體的動物.1.轉(zhuǎn)基因動物概念

選擇合適的體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物轉(zhuǎn)基因細胞胚胎發(fā)育及鑒定篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物基因轉(zhuǎn)染的受精卵細胞2.轉(zhuǎn)基因動物過程

以RNA為遺傳物質(zhì)，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄生成DNA后嵌入宿主基因組中，通過合成RNA及蛋白質(zhì)殼包裝而成的病毒。如HIV。反轉(zhuǎn)錄病毒法反轉(zhuǎn)錄病毒顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法、胚胎干細胞法1)基因轉(zhuǎn)染1、球狀，直徑80～100nm。2、單股、正鏈RNA：二倍體，7～11kb，非傳染性核酸。3、衣殼：20面體對稱。4、有囊膜：具有糖蛋白纖突(約72個)。5、具反轉(zhuǎn)錄酶，其在病毒感染細胞后即開始反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄病毒特性優(yōu)點：能有效地以單拷貝形式將目的基因整合入受體細胞基因組;

整合率高，且整合后目的基因能穩(wěn)定地遺傳;

整合機制明確，即在TR區(qū)域內(nèi)進行，不會破壞目的基因結(jié)構(gòu).缺點：目的基因載量小，一般只有8kb，以免影響活性和穩(wěn)定。包裝過程易發(fā)生同源重組，形成野生型病毒，因此使用受限。病毒DNA可影響外源基因在宿主動物的表達。操作繁瑣。

胚胎干細胞方法

是從早期胚胎內(nèi)細胞團分離出來的，能在體外培養(yǎng)的一種高度未分化的多能干細胞。含正常二倍體染色體具發(fā)育全能性可在體外培養(yǎng)﹑擴增能以克隆的形式保存干細胞獲得功能基因構(gòu)建基因打靶載體轉(zhuǎn)染ES獲得基因剔除細胞系制備嵌合體篩選進入生殖系小鼠轉(zhuǎn)基因小鼠（F1）表型分析選擇單系同胞交配產(chǎn)生F2代篩選純合子的轉(zhuǎn)基因小鼠優(yōu)點：提高了基因轉(zhuǎn)移效率，能進行定位基因轉(zhuǎn)移。缺點：需多代得到純合的轉(zhuǎn)基因動物；資金投入高。轉(zhuǎn)基因鼠實驗所用各類鼠2)體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物選擇3)轉(zhuǎn)基因細胞及胚胎發(fā)育鑒定DNA提取斑點雜交和PCR擴增Southern雜交Northern雜交表達產(chǎn)物檢測4)轉(zhuǎn)基因動物的篩選1)在生命科學基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用研究基因的結(jié)構(gòu)與功能研究基因的組織特異性表達研究發(fā)育相關(guān)基因的表達與調(diào)控克隆在發(fā)育中起重要作用的基因基因多級調(diào)節(jié)系統(tǒng)的研究細胞功能研究3.轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用基因敲除2)在醫(yī)藥研究領(lǐng)域中的應(yīng)用研究病毒性疾病建立人類疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型轉(zhuǎn)基因動物與基因治療生產(chǎn)天然活性藥物蛋白

已建立的人類疾病