實驗一光合細菌的培育

關于實驗一光合細菌的培育第1頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三一、實驗目的：通過本實驗，了解并掌握光合細菌的培養(yǎng)方法。第2頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三二、實驗儀器設備：光和細菌的培養(yǎng)設備：包括滅菌設備、培養(yǎng)容器、培養(yǎng)用具和檢測儀器。1.滅菌設備：高壓蒸汽滅菌鍋，用于高壓濕熱滅菌。2、培養(yǎng)容器(1)試管：φ15mm×L160mm(中型試管)。主要用于液體培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)。

φ20mm×L180mm(大型試管)。主要用于制平板深層試管或盛無菌水等。(2)培養(yǎng)皿：

φ6～10cm(常用φ9cm).用于制作平板培養(yǎng)基，以分離菌種和觀察菌落形態(tài)。(3)移液管：容量1～10ml(常用1ml、5ml、10ml)，制備培養(yǎng)基、稀釋液體、吸取樣品等使用。第3頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(4)錐形瓶(有、無具塞磨口兩種)：30～500ml。用于各種光和細菌單體或組合連續(xù)培養(yǎng)的逐級擴大培養(yǎng)用。(5)三角燒瓶：500～5000ml，用于擴大培養(yǎng)。(6)細口瓶：5000～20000ml，用于擴大培養(yǎng)和生產性大量培養(yǎng)。(7)塑料薄膜袋：用于生產性大量培養(yǎng)。(8)大型塑料水槽：一般為圓柱形。容量為300～500L，用于生產性大量培養(yǎng)。第4頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3、培養(yǎng)用具(1)操凈工作臺：用于菌種的分離和接種。(2)恒溫培養(yǎng)箱（或人工氣候箱，光照培養(yǎng)箱）：主要用于培養(yǎng)菌種和小型培養(yǎng)使用。箱內必須帶有鎢絲燈泡的人工光源。(3)電冰箱和冷藏冰柜：主要用于菌種和某些有機試劑的保存以及光和細菌母菌種液的長期保存(5-10)℃。(4)接種環(huán)：用于菌種取樣、接種。(5)電動離心機：用于液體菌種濃縮和采收。第5頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(6)空壓機：用于微氣方式培養(yǎng)。(7)電風扇和排氣風扇：用于培養(yǎng)時控溫、調穩(wěn)。(8)分析天平：用于試驗產品烘干后的稱重及分析稱樣等。(9）此外，應還有分液漏斗、載波片、蓋玻片、酒精燈及電光源(碘鎢燈、白熾燈泡等)設施及其支架、控溫設備和充氣設備。

第6頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三三、實驗內容：1.光和細菌培養(yǎng)基的制備2.光合細菌菌種的分離3.菌種的培養(yǎng)4.菌種的保存5.光和細菌的大量培養(yǎng)6.光合細菌的培養(yǎng)技術和保種技術。第7頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三四、實驗步驟與方法：（一）光和細菌培養(yǎng)基的制備Sawad培養(yǎng)基(1975)：用于單菌落分離和莢膜紅假單孢菌的培養(yǎng)。

第8頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三1.微量金屬元素(T.m.)貯液培方EDTA2.5gZnSO4·7H2O10.95gMgSO4·H2O1.54gCuSO4·5H2O0.39gCoCl2·6H2O0.2gFeSO4·7H2O7.0g蒸餾水1000ml第9頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2.生長素貯液培方：生物素1mg煙酸(尼克酸)0.1mg對氨基苯甲酸10mg維生素B1100mg蒸餾水1000ml。酵母膏和生長素貯液二者有一即可(即：有了酵母膏就不必加生長素)。第10頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（二）光合細菌菌種的分離培養(yǎng)光和細菌，首先要有菌種，菌種可以從別的單位獲得。如果別的單位沒有適合的菌種，就要從自然生態(tài)環(huán)境中分離。分離菌種的工作要求雖然比較高，但也并非高不可攀，只要按照要求操作，就能分離出需要的菌種。第11頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三1.采樣

要根據光和細菌的生態(tài)特點，選擇光和細菌大量分布的地方采樣。目前，水產養(yǎng)殖業(yè)使用的光和細菌，主要是紅螺菌科的一些種類。這些光和細菌是以有機質作為光和細菌的碳源和供氫體，故廣泛分布在被有機質污染的地方，如河底、湖底、海底、水田、溝渠和污水池塘的泥土以及豆制品廠、淀粉廠和食品工業(yè)等廢水排水溝處呈橙黃色或分紅色的泥土中。

第12頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三光和細菌在污水池塘等有機質含量豐富的地方，分布數量更大。在以上所述地方都可以采集樣品。采樣工具有杯、采水器和采泥器，淺水處直接用杯舀取少量樣品，深水處借用采水器和采泥器采樣，采集到的底泥連同水一起放入廣口瓶中帶回。第13頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2.富集培養(yǎng)采集的樣品中光和細菌的數量一般較少，并且含有不少雜菌，難以直接進行分離，必須進行富集培養(yǎng)。所謂富集培養(yǎng)，就是為要分離的光和細菌提供適宜的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件，使其大量增殖。同時抑制雜菌的生長。第14頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三

富集培養(yǎng)除了培養(yǎng)基以外，還要給培養(yǎng)物制造缺氧的培養(yǎng)環(huán)境。為此，先將采回的樣品(泥土或水)裝入玻璃圓筒或大型試管或具塞的磨口玻璃瓶中，再倒入預先配制好的液體培養(yǎng)基，充分攪拌，使樣品與培養(yǎng)基充分分散混合，然后在玻璃圓筒或大型試管中加入液體石蠟，以完全隔絕空氣，防止空氣中的氧氣溶解于培養(yǎng)基中（圖1，a）。光和細菌的富集培養(yǎng)法

a.玻璃圓筒富集培養(yǎng)法b.具塞磨口玻璃瓶富集培養(yǎng)法

1.液體石蠟2.橡皮圈3.塑料布第15頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三如果用具塞的磨口瓶，則要加滿培養(yǎng)液，蓋上瓶塞，讓多余的培養(yǎng)液總瓶口溢出，瓶內不能有氣泡存在。瓶口套上塑料薄膜，用橡皮筋扎以減少水分蒸發(fā)（圖1，b）。第16頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三為了加快光和細菌的增殖，除了缺氧的環(huán)境條件以外，適宜的溫度和光照度也很重要。培養(yǎng)溫度一般為25～30℃，光照強度為5000～10000lx，最好一天24h連續(xù)光照，經過2～6周的富集培養(yǎng)，在培養(yǎng)容器的內壁逐漸出現光和細菌菌落，或整個培養(yǎng)液長成紅色。一般地說，海水光和細菌比淡水光和細菌生長緩慢，故富集培養(yǎng)的時間更長。第17頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三如果富集培養(yǎng)初步獲得成功，就用吸管或移液管插入菌液中或光和細菌大量繁殖的泥層中，將菌液吸入大型試管或具塞磨口瓶中，加入培養(yǎng)基，按前述的方法和條件繼續(xù)培養(yǎng)。反復多次后，光和細菌壓倒其他細菌而占絕對優(yōu)勢，培養(yǎng)液呈深紅色，這時富集培養(yǎng)成功。第18頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三（3）分離方法一旦富集培養(yǎng)成功，就可以分離培養(yǎng)。淡水生長的紫色非硫細菌生長速度較快，在一周左右移植比較合適，而海水生長的紫色非硫細菌生長速度較慢，培養(yǎng)三周以上才能移植。菌種的分離一般采用平板分離法。平板分離法是使待分離的菌種以單個細胞在平板培養(yǎng)基上分散開，形成一個個菌落，從而達到分離的目的。第19頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三紅螺菌屬的分離方法:利用紅螺菌屬細菌具有快速運動的能力來分離這種細菌的方法。在載波片上加一滴無菌水，再在它的近旁加一滴紫色非硫細菌的富集培養(yǎng)液，無菌水旁加一滴培養(yǎng)液，當培養(yǎng)液與無菌水滴結合時，紅螺菌較其他微生物更快地達到培養(yǎng)液的部位，用微吸管吸出到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，這樣反復移植幾次后，就能在瓊脂斜面或平板上分離取得紅螺菌的菌落，并進一步分離而取得純培養(yǎng)物。第20頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三4.菌種的培養(yǎng)(1)培養(yǎng)方式大量培養(yǎng)光和細菌，通常采用兩種方式進行培養(yǎng)。一種是全封閉式厭氣光照培養(yǎng)方式，另一種是開放式微氣光照培養(yǎng)方式。第21頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(1)全封閉式厭氣光照培養(yǎng)全封閉式厭氣光照培養(yǎng)是采用無色透明的玻璃容器或塑料薄膜袋，經消毒后，裝入消毒好的培養(yǎng)液接入20%～50%的菌種母液，使整個容器均被液體充滿，加蓋（或扎緊袋口），造成厭氣的培養(yǎng)環(huán)境，置于有陽光的地方或人工光源進行培養(yǎng)，定時攪動，在適宜的溫度下，因經過5～10天的培養(yǎng)，即可達到指數生長期高峰，此時可采收或進一步擴大培養(yǎng)。第22頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(2)開放式微氣光照培養(yǎng)開放式微氣光照培養(yǎng)，一般采用容量為100～200L的塑料桶或500L的鹵蟲孵化桶為培養(yǎng)容器。底部成錐形并有排放開關的鹵蟲孵化桶比較理想。在桶底部裝一氣石，培養(yǎng)時微充氣，是桶內的光和細菌呈上下緩慢翻動。在桶的正上方距桶面30cm左右裝一有罩的白熾燈泡，使液面照度達2000lx左右。培養(yǎng)前把容器消毒，加入消毒好的培養(yǎng)液，接入20%～50%的菌種母液，照明，微氣培養(yǎng)。在適宜的溫度下，因經過7～10d的培養(yǎng)，即可達到指數生長期高峰，此時可采收或進一步擴大培養(yǎng)。第23頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三(2)培養(yǎng)方法光和細菌的培養(yǎng)，按次序分為容器、工具的消毒，培養(yǎng)基的制備，接種和培養(yǎng)管理四個步驟(1)容器、工具的消毒所有培養(yǎng)用容器(如試管、三角燒瓶等)、工具(如移液管、分液漏斗等)都必須在用前用去污粉、洗液、或肥皂粉等刷洗并沖洗干凈，如果玻璃瓶壁上有白色菌膜或碳酸容器、工具洗刷干凈后，用以下幾種方法進行消毒滅菌:第24頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三1)加熱消毒法A直接燒灼消毒B煮沸消毒C高溫烘箱干燥消毒(干熱滅菌)D高壓蒸汽消毒(濕熱滅菌)E化學藥品消毒法a.酒精(C2H5OH)：b.高錳酸鉀(KMnO4)：c.石炭酸(酚C6H6OH)：d.鹽酸(HCl)：第25頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三2)培養(yǎng)基的配制3)滅菌和消毒

(3)接種培養(yǎng)基配好后(培養(yǎng)基需冷卻的要冷卻到適宜的溫度，應立即進行接種。開始時由于菌種數量少，先在試管中培養(yǎng)，然后再逐漸往大培養(yǎng)容器接種。隨著菌種數量增加，可以加大接種量，掌握在20%～50%，即菌種母液量和新配培養(yǎng)液量之比為1:4(20%)～1:1(50%)，尤其是微氣培養(yǎng)，接種量不應低于1:4(20%)。(4)培養(yǎng)管理第26頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三光和細菌的培養(yǎng)過程中，管理工作包括：

A.日常管理操作和測試；

B.生長情況的觀察和檢查；

C.出現問題的分析處理。第27頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三1)日常管理操作和測試a.攪拌和充氣b.調節(jié)光照度c.調節(jié)溫度：2)生長情況的觀察和檢查3)問題的分析和處理第28頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三3)問題的分析和處理通過日常管理、檢測、檢查，了解光和細菌的生長情況，就可以結合當時的環(huán)境條件的變化進行分析，找出影響光和細菌生長繁殖的原因，采取相應的措施。第29頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三影響光和細菌生長的原因很多：內因：菌種是否優(yōu)良。外因：光照、溫度、pH值、營養(yǎng)、敵害、厭氣程度等。光照、溫度、pH值同時影響著光和細菌的生長，而且光照、溫度、pH值之間是互相制約的，即溫度高，光照應弱；溫度低，光照應強。如果溫度高，光照強，pH值就會迅速升高，培養(yǎng)基產生沉淀，抑制光和細菌的生長。如果溫度低，光照弱，光和細菌得不到最佳能源，生長速度也慢。經試驗得出光和細菌生長的最適條件是：①溫度15～20℃時，光照30000～50000lx，培養(yǎng)基pH值為7.0；②溫度25～30℃時，光照為3000～5000lx，培養(yǎng)基pH值為7.0。第30頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三光和細菌培養(yǎng)過程中的問題分析例1出現問題：測定pH值無大變化，O.D.值不上升，生長受阻。檢查結果：水溫42℃，其余條件正常。分析原因：溫度超出生長適應范圍。第31頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三例2出現問題：測定O.D.值，升高較慢，光和細菌生長繁殖不快。檢查結果：磁力攪拌棒偏于邊緣，不起攪拌作用，其余條件正常。分析原因：菌液無攪拌，影響光和細菌的生長。第32頁，講稿共38頁，2023年5月2日，星期三例3出現問題：測定pH值和O.D.值均不上升，發(fā)生附壁現象。檢查結果：環(huán)境條件正常，培養(yǎng)措施得當。分析原因：