新型神經(jīng)支架材料的構(gòu)建及其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的實(shí)驗(yàn)研究

新型神經(jīng)支架材料的構(gòu)建及其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合的實(shí)驗(yàn)研究【摘要】［目的］研制出一種可用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的組織工程支架材料，并觀察體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在支架材料中的生長情況。［方法］以I型膠原蛋白和明膠通過冷凍干燥技術(shù)制備膠原蛋白支架材料。掃描電鏡觀察內(nèi)部結(jié)構(gòu)的排列規(guī)律及走行，測(cè)量其孔徑大小、孔隙率等指標(biāo)。將骨髓基質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合到膠原蛋白支架材料中共培養(yǎng)5d后，掃描電鏡下觀察其在材料內(nèi)部的生長情況。［結(jié)果］構(gòu)建的材料均為圓柱狀，內(nèi)部為孔徑均勻且平行排列的微管結(jié)構(gòu)，體外培養(yǎng)的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成功種植在支架材料上，在材料內(nèi)部生長良好。［結(jié)論］構(gòu)建的支架材料具有良好的三維空間構(gòu)形和生物相容性，為神經(jīng)損傷的修復(fù)提供了一種新型的支架材料。

【關(guān)鍵詞】組織工程;膠原；明膠；骨髓基質(zhì)干細(xì)胞

周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)的一大難題，自體神經(jīng)移植是臨床上修復(fù)神經(jīng)缺損常用的方法，但是，由于其存在增加一次手術(shù)、造成供區(qū)神經(jīng)功能喪失、供受區(qū)神經(jīng)不匹配等不足，應(yīng)用受到了限制。人們用導(dǎo)管修復(fù)神經(jīng)缺損已經(jīng)有100多年的歷史，近年來組織工程的發(fā)展為神經(jīng)缺損的修復(fù)提供了可能，作者以膠原蛋白為主要原料制備了具有軸向微管結(jié)構(gòu)的組織工程支架材料［1］，并將其與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)復(fù)合，觀察支架材料的生物相容性。

1材料與方法

膠原蛋白支架材料的制備

分別稱取I型膠原蛋白(SigmaC9879)150mg，明膠(SigmaG9382)75mg，溶于mol/L醋酸溶液中，在恒溫4℃條件下，18000r／min攪拌90min，負(fù)壓抽真空后，4℃冰箱過夜，充分混合成凝膠狀懸濁液，將懸濁液注入內(nèi)徑3mm，長10cm的硅膠管中，密封兩端，順軸向用自制微型調(diào)速儀以2×10-5m／s的速度浸入冷凝劑中，將懸濁液-硅膠管冷凍物放入預(yù)冷的鋁盤中，于-40℃，100mtorr條件中凍干48h，即可制得干燥成形的膠原蛋白支架材料［2］。支架材料用戊二醛交聯(lián)，CO60消毒密封備用［3］。

支架材料內(nèi)部掃描電鏡觀察

將上述方法制備的支架材料噴金鍍膜，以掃描電鏡觀察其橫截面、縱截面及材料外表面，并測(cè)量材料微孔的直徑。

支架材料孔隙率的測(cè)量

把已知重量W1，體積V０的材料浸入裝有水的密閉容器中，采用負(fù)壓抽吸的方法排除材料孔隙內(nèi)的空氣，此時(shí)材料內(nèi)部充滿水，將材料取出，吸干表面的液體，稱重為W2。W2-W１／1(水的比重為1)，得V１即為材料的孔隙體積，V1／V0即可得出材料的孔隙率。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)

斷頸處死SD大鼠，取雙側(cè)股骨，暴露出骨髓腔，培養(yǎng)液沖洗骨髓腔2～3次，將所獲的沖洗液過濾，然后加入相同體積的％NH4CL溶液［4］。850r/min離心10min后棄去上清，培養(yǎng)液(DMEM／F12+15％FCS)稀釋后制成單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃、5％CＯ2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72h后換液除去未貼壁細(xì)胞，以后每周換液3次，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)85％融合時(shí)，用％胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)［5］。

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與支架材料的復(fù)合

將培養(yǎng)的BMSCs胰酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，將BMSCs懸液以1×10６／ml的密度用微量注射器分別注入10根4cm的支架材料內(nèi)，然后將材料置于骨髓基質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，隔天換液，共培養(yǎng)5d后，將支架材料取出，固定、干燥、噴金鍍膜，掃描電鏡下觀察細(xì)胞在支架材料內(nèi)的生長情況。

2結(jié)果

支架材料的構(gòu)建

作者通過冷凍干燥技術(shù)制備了新型的周圍神經(jīng)組織工程支架材料(圖1)，可以根據(jù)需要，制備成不同的外形和長度，作者所制備的橋接材料均為圓柱狀；經(jīng)物鏡及電鏡觀察外表面為封閉結(jié)構(gòu)，掃描電鏡觀察橫切面顯示微管內(nèi)徑較均一(圖2)，其內(nèi)部為軸向平行排列的微管結(jié)構(gòu)(圖3)，孔徑在20μm～80μm，與坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)相似，從而為神經(jīng)纖維再生提供了通道。作者隨機(jī)選取20根已稱重W１的材料，測(cè)量其截面直徑、長度，計(jì)算出體積V0，按照上述方法稱重W2，通過公式計(jì)算出孔隙率為％。

BMSCs的分離、培養(yǎng)

BMSCs接種后48h開始貼壁伸展生長，大多數(shù)呈梭形，可見細(xì)胞團(tuán)落形成，初次換液后，細(xì)胞迅速增殖生長，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到85％融合時(shí)，傳代接種培養(yǎng)，通過傳代換液除去未貼壁細(xì)胞來純化BMSCs。當(dāng)傳至第3代時(shí)，BMSCs形態(tài)較一致，呈梭形生長，折光性較強(qiáng)(圖4)。

掃描電鏡觀察結(jié)果

BMSCs注入支架材料并共培養(yǎng)5d后，見有大量的BMSCs在支架材料內(nèi)部貼附，細(xì)胞突起整合于支架材料內(nèi)壁，且生長良好(圖5、6)。

3討論

近年來，應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有良好生物相容性的支架材料修復(fù)外周神經(jīng)損傷成為研究的熱點(diǎn)。應(yīng)用神經(jīng)修復(fù)導(dǎo)管橋接兩神經(jīng)斷端，引導(dǎo)神經(jīng)軸突軸向生長，避免外生和形成神經(jīng)瘤，為神經(jīng)再生提供一個(gè)相對(duì)隔絕的微環(huán)境，可修復(fù)周圍神經(jīng)節(jié)段的缺損。目前神經(jīng)組織工程支架材料主要分為天然材料(血管，膠原等)和合成材料(PLA、PGA等)，PLA、PGA在降解過程中降低了pH值，而pH值的降低可加速材料的自身催化降解，結(jié)果在材料周圍將形成一個(gè)強(qiáng)酸環(huán)境，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的功能，以天然的細(xì)胞外基質(zhì)為原料制備支架材料成了研究的新方向，膠原蛋白和明膠是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，膠原蛋白不僅對(duì)細(xì)胞具有趨化作用，而且還具有促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖，無免疫原性，降解產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無毒性等優(yōu)點(diǎn)。并可參與組織愈合過程，在燒傷創(chuàng)面敷料、組織再生誘導(dǎo)方面得到廣泛應(yīng)用，應(yīng)用在神經(jīng)導(dǎo)管中能刺激改善周圍神經(jīng)的再生［6］。作者以I型膠原和明膠為主要原料，通過冷凍干燥技術(shù)制備了具有軸向微管排列結(jié)構(gòu)的神經(jīng)支架材料，微管直徑在20～80μm，使其不僅在組成成份上，更在三維結(jié)構(gòu)上高度仿生神經(jīng)。這種軸向排列的微管結(jié)構(gòu)，有利于引導(dǎo)再生軸突定向生長，材料的外表面為致密結(jié)構(gòu)，可有效阻止體內(nèi)纖維結(jié)締組織的長入。有研究報(bào)道，BMSCs在周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)中能夠有效的促進(jìn)軸突的再生［７］，本實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs種植在支架材料并共培養(yǎng)后，有大量的細(xì)胞在支架材料內(nèi)部黏附，生長良好，發(fā)出的偽足長入支架材料內(nèi)，支架材料具有良好的生物相容性。綜上所述，作者制備的膠原蛋白支架材料，為周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)開辟了一條新的途徑，具有良好的應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】

［1］ChamberlainLJ,YannasIV,HsuHP,etal．CollagenGAGsubstrateenhancesthequalityofnerveregenerationthroughcollagentubesuptolevelofautograft［J］．ExpNeurol,1998,154：315-329．

［2］梁偉，羅卓荊，王樹森，等．修復(fù)神經(jīng)缺損的組織工程支架材料的研制及其生物相容性研究［J］．中華創(chuàng)傷骨科雜志,2004,6(9)：1037-1041．

［3］EtohS,TakakudaK,KawabataK,etal．Evaluationofcrosslinkingproceduresofcollagentubesusedinperipheralnerverepair［J］．Biomaterials,2002,23(23)：4475-4481．

［4］AymanA，TakeshiK，KazumasaE，etal．Morphologicaldifferentiationofbonemarrowstromalcellsintoneuronlikecellsaftercoculturewithhippocampalslice［J］．BrainRes，2004，1029(1)：114-119．

［5］馮林杰，羅卓荊，王曉礽，等．嗅鞘細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用研究［J］．中國矯形外科雜志,2006,14(24)：1894-1895．

［6］ChamberlainLJ,YannasIV,HsuHP,etal．NearterminusaxonalstructureandfunctionfollowingratsciaticnerveregenerationthroughacollagenGAGmatrixinatenmillimetregap［J］．NeurosciRes,2