兒科常見皰疹類毒分子診斷及其臨床應(yīng)用課件

兒科常見皰疹類病毒分子診斷及其臨床應(yīng)用磐安縣人民醫(yī)院申屠橋民一、兒科常見皰疹類病毒感染的病原體種類、危害及診治現(xiàn)狀1、兒科常見皰疹類病毒感染現(xiàn)狀全世界每年有1300萬因感染性疾病而死亡，其中1000萬是5歲以下兒童，99%發(fā)生在經(jīng)濟欠發(fā)達的發(fā)展中國家，其死因的70%是因常見的感染性疾病引起。隨著科技水平的不斷提高，各種抗生素、抗病毒藥物日益增多，若能早期快速明確診斷系何種病原體感染，就能有效地控制兒童的病死率。然而，目前感染診斷在我國還局限于生化、培養(yǎng)、病原體分離等常規(guī)方法，缺乏早期、快速、準確診斷的方法在常見感染性疾病中，細菌與病毒共占了90%以上（其中細菌與病毒各占45%左右）。在95重大攻關(guān)項目中，成功地創(chuàng)建了16SrRNA基因PCR—基因芯片快速、準確診斷不同細菌的感染，使細菌診斷上了一新的臺階，其研究成果也列入了全國新生兒敗血癥診斷標準。但病毒的快速早期診斷方法仍未見報道。兒童是祖國的未來，如何早期明確診斷兒童病毒感染將是能否治愈病毒感染的關(guān)鍵。2、兒科皰疹類病毒感染的危害兒童病毒感染造成嚴重危害涉及兒科與圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)二大范疇。兒科領(lǐng)域中，病毒感染致死的主要原因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，典型的感染為單純皰疹病毒Ⅰ型（HSVⅠ）所致的腦膜腦炎（HSE）。HSE是散發(fā)性病毒性腦炎中最常見的病原。其次表現(xiàn)為發(fā)熱、肝脾淋巴結(jié)腫大等原因不明的病毒感染，最具代表性的疾病是傳染性單核細胞增多癥。目前已知主要是由于EB病毒感染所致。EB病毒還對神經(jīng)系統(tǒng)危害嚴重，如引起腦膜腦炎、格林巴利綜合癥、Fisher's綜合癥等。在圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)中，病毒感染的危害在于宮內(nèi)感染，最具典型的是巨細胞病毒（CMV），其次是單純皰疹病毒Ⅱ型（HSVⅡ）。同時，CMV腦炎也是AIDS患者中最常見的并發(fā)癥。皰疹類病毒導(dǎo)致兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染，不及時治療往往造成智力低下、驚厥發(fā)作、語言不清、神經(jīng)性耳聾等中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴重后遺癥，尤其是HSV引起的腦炎，未經(jīng)治療死亡率高達70%，而有效的抗病毒藥物治療后可明顯改善HSE的愈合，使死亡率降至20-30%，但要確保早期用藥。3、兒科感染皰疹類病毒的種類造成兒童感染致死的主要病毒是HSVⅠ、EBV、HCMV、HSVⅡ。這些病毒同屬于皰疹類病毒，分別是α皰疹病毒（HSVⅠ/Ⅱ）、β皰疹病毒（HCMV）、γ皰疹病毒（EBV）。皰疹類病毒尚包括水痘帶狀皰疹病毒（VZV），常易致腦膜腦炎、脊髓炎及神經(jīng)炎；人皰疹病毒6型（HHV6）、7型（HHV7），以及最近發(fā)現(xiàn)的HHV8，已有論據(jù)顯示壞死性腦炎和Griscellis綜合癥的病兒腦組織中發(fā)現(xiàn)了HHV6病毒。4、皰疹類病毒感染診治現(xiàn)狀目前，對皰疹病毒感染仍缺乏快速、敏感、特異的診斷方法。傳統(tǒng)的診斷“金標準”為病毒分離，培養(yǎng)一般需要5-21天，費時費力，且敏感性和特異性均欠佳。大多數(shù)情況下，腦炎的特異性病毒檢測率僅30%，約2/3的感染者無法用病毒分離獲得明確診斷。病毒特異性抗體IgM，在體液中要達到有效濃度需10天左右，同時可與其他病毒感染產(chǎn)生交叉反應(yīng)，從而使其診斷的敏感性和特異性大大降低。而IgG抗體則有95%的患者將維持終生，故IgG抗體的存在只能說明有既往感染，不能說明是現(xiàn)時感染，如要用IgG抗體作為現(xiàn)時感染的診斷依據(jù)，必需動態(tài)觀察其滴度的變化，因而不能滿足臨床早期診斷的需要。聚合酶聯(lián)反應(yīng)（PCR）是近十幾年來發(fā)展起來的分子生物學(xué)技術(shù)，它可在一定條件下，短時間內(nèi)（數(shù)小時）使病原體基因片段發(fā)生上百萬倍的擴增，然后用凝膠電泳、核酸雜交、限制性酶切分析、序列檢測。近幾年來，PCR診斷技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于臨床診斷皰疹類病毒感染，Pozo應(yīng)用多對引物的多重PCR來診斷皰疹類病毒感染，雖然能區(qū)分不同的病毒，但因其引物間可互相干擾，使其敏感性較低。也有人用各種病毒基因的保守區(qū)設(shè)計不同引物進行PCR擴增，但只能檢測一種病毒，易造成漏診。因此，許多學(xué)者提出能否構(gòu)建通用引物來對所有皰疹類病毒進行PCR擴增，從而達到能一次性檢測所有皰疹類病毒，以及它們的混合感染。皰疹類病毒是由一組病毒組成，具有許多相似的生物學(xué)特征及分子結(jié)構(gòu)。具有高度同源序列的基因為DNA多聚酶基因，它所編碼的蛋白質(zhì)是DNA多聚酶，為病毒復(fù)制所必需，該基因為所有皰疹類病毒所共有，且有高度的保守性，理論上可在此區(qū)構(gòu)建通用引物同時對多種皰疹類病毒進行檢測。Yamamoto曾在此區(qū)構(gòu)建通用引物對35例臨床懷疑皰疹病毒感染腦炎患者的腦脊液（CSF）進行PCR擴增，然后進行Southern雜交，檢測了6種皰疹類病毒，但未能區(qū)分各自不同的病毒。由于病毒的生物學(xué)特性比較復(fù)雜，各種病毒差異很大，即使同屬皰疹類病毒，其抗病毒藥差異甚大。如抑制CMV的更昔洛韋，對EBV無任何作用。阿昔洛韋、泛昔洛韋對HSV、VZV有效，但對CMV無效。因此，只有明確具體的病毒感染才能指導(dǎo)臨床用藥。國外在這方面也有過嘗試，如在皰疹類病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計幾對兼并引物進行PCR擴增，雖能檢測各種病毒，但該方法操作繁雜、費時費力，不能滿足臨床需要。二、浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科研項目兒科常見皰疹類病毒分子診斷及其臨床應(yīng)用（一）、國內(nèi)外現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢檢索國內(nèi)外近15年有關(guān)皰疹類病毒的文獻，發(fā)現(xiàn)國內(nèi)外傳統(tǒng)的診斷“金標準”病毒分離因時間需1-3周，敏感性及特異性欠佳，達不到早期準確診斷的目的。免疫、分子生物學(xué)診斷技術(shù)一直是希望提高診斷準確性的方向。特異性IgM、IgG的酶聯(lián)免疫技術(shù)因其出現(xiàn)的時間及維持時間的限制，加之滴度的變化需重復(fù)檢測，限制了該技術(shù)的發(fā)展。近10年來，國內(nèi)外研究的重點主要集中在PCR技術(shù)的診斷。病毒特異性引物建立高度敏感的PCR技術(shù)已經(jīng)在臨床應(yīng)用，如我們的研究團隊于90年代末成功地建立了套式PCR加限制酶分析檢測巨細胞病毒，經(jīng)實驗證明具有高度的特異性與敏感性。然而，皰疹類病毒感染其臨床表現(xiàn)相似，有時幾種皰疹類病毒同時感染需用多對引物進行多次PCR來檢測不同的皰疹類病毒，使得特異性PCR在臨床實際診斷中受到限制。許多學(xué)者因此提出構(gòu)建通用引物擴增所有皰疹類病毒，從而達到一次即能檢測所有皰疹類病毒。Bouquillon用通用引物擴增6種皰疹類病毒，Sakulwira等用通用引物擴增5種皰疹類病毒，并用RFLP區(qū)分不同的病毒。我們的研究團隊對兒童常見的皰疹類病毒運用通用引物進行體外DNA擴增，進一步用RFLP、測序等方法區(qū)分不同病毒，取得較好結(jié)果[7]，但仍存在需多種酶切、Southern雜交等的煩瑣，使得在臨床常規(guī)使用時受到限制。（二）、研究內(nèi)容、研究目標、擬解決的問題和今后研究思路1、研究內(nèi)容基礎(chǔ)部分（1）、以臨床常見皰疹病毒感染的診斷為目標，經(jīng)計算機查索核酸序列庫，選取保守DNA區(qū)域設(shè)計引物，建立能擴增所有6-8種皰疹類病毒的PCR方法。對標準毒株HSVⅠ（F株）、HSVⅡ（G株）、CMV（169株）、EBV（B95-8株）、VZV（EF株），以及HHV6（GS株）進行PCR擴增，并選擇其他病毒如HBV、細菌（大腸桿菌、金葡菌等）、真菌（新型隱球菌）作為對照，以摸索出進行通用引物PCR所需的最小檢出量，及其各自反應(yīng)體系的適宜條件。（2）、在皰疹類病毒的可變區(qū)域設(shè)計特異性引物，建立擴增對各自特異病毒DNA的PCR方法，包括CMV、HSV、EBV、VZV、HHV6、HHV7、HHV8等的PCR方法。并比較各自特異PCR方法與通用引物PCR檢測標準毒株其敏感性、準確性等方面的差異。（3）、經(jīng)核酸序列GenBank比較，設(shè)計各自特異的DNA探針，并進一步分子克隆、序列分析，明確HSV、HHV6的亞型基因，設(shè)計HSVⅠ/Ⅱ、HHV6A/6B等的特異性探針。（4）、對設(shè)計的DNA探針末端修飾，微陣列，制作基因芯片。內(nèi)容包括固相載體的選擇、玻片表面修飾、探針末端修飾、微陣列制備技術(shù)、核酸探針的固定及雜交。（5）、基因芯片雜交系統(tǒng)參數(shù)的確定及檢測，包括DNA固液相雜交、熒光標記與檢測方法，靈敏度及特異性測定等。2、研究內(nèi)容臨床部分我院臨床有中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，包括急性、散發(fā)性、局灶性腦炎，腦膜腦炎等患兒，收取腦脊液及外周靜脈血，對全身不明原因發(fā)熱、皮疹、黃疸、肝脾腫大等患兒抽取靜脈血，進行DNA抽提、PCR擴增，陽性結(jié)果進一步進行基因芯片分析。同時對臨床標本血清（血漿）進行HSV、EBV、CMV等的特異性IgM、IgG檢測。試圖調(diào)查兒童皰疹病毒感染的實際情況，研究兒童病毒感染的早期診斷價值，發(fā)現(xiàn)特定皰疹病毒感染或混合感染情況，以闡明PCR-基因芯片在診斷及區(qū)分不同病毒感染時的實際意義。在研究過程中，同時設(shè)立健康體檢兒童的對照組及非病毒感染的腦脊液標本，進行PCR-基因芯片檢測，以排除假陽性、假陰性等情況，擬在解決目前病毒感染缺乏早期、快速、準確診斷的問題。3、研究目標在皰疹類病毒高度同源序列的DNA多聚酶基因內(nèi)設(shè)計通用引物擴增所有皰疹類病毒DNA，對其PCR擴增產(chǎn)物進行分子克隆、序列測定，通過序列分析找到各自特異的DNA序列及亞型序列，設(shè)計特異探針，建立皰疹病毒DNA基因芯片區(qū)分不同病毒感染，為臨床皰疹類病毒感染的早期、快速診斷提供有效手段。4、擬解決的問題（1）、在皰疹病毒的高度同源序列選擇通用引物，建立能檢測CMV、HSV、VZV、HHV等所有皰疹類病毒的PCR方法。（2）、在皰疹病毒的可變區(qū)選擇特異DNA探針，并對HSVⅠ型與Ⅱ型、HHV6A與HHV6B等亞型進行分子克隆、序列分析，找到各自特異DNA序列，建立基因芯片，區(qū)分不同皰疹病毒及其亞型。5、今后研究思路不斷成熟完善PCR-基因芯片技術(shù)在臨床皰疹類病毒診斷中的應(yīng)用，研發(fā)相關(guān)診斷試劑盒；同時探索該技術(shù)在其他兒童常見病毒感染中的診斷價值。6、研究方法（1）、在PubMed、GenBank中選取通用引物建立能擴增所有病毒的通用引物PCR方法。選取特異引物建立能擴增特定皰疹病毒的PCR方法。引物合成由上海生工有限公司391型儀合成。（2）、經(jīng)計算機GenBank查閱，在皰疹類病毒高度同源序列DNA多聚酶基因中，設(shè)計6種皰疹類病毒特異DNA探針，對HSV、HHV6體外擴增、序列分析，選擇亞型DNA片段，區(qū)分不同的亞型。對以上所有DNA片段探針經(jīng)微陣列，建立基因芯片技術(shù)。特異性探針合成及Amino-link修飾及polydT等由日本TaKaLa生物公司完成。（3）、標準病毒株DNA提取采用分子克隆二版的經(jīng)典方法，血及CSFDNA抽提采用我院自行建立的快速抽提DNA方法。（4）、血特異性IgM、IgG檢測，采用德國歐蒙公司ELISA試劑盒，按說明書操作。（5）、收集臨床懷疑皰疹病毒感染的血及CSF標本約100例進行臨床驗證。標本采集前告知患兒監(jiān)護人該標本將用于科研研究，并與患兒監(jiān)護人簽署臨床研究知情同意書。（6）、統(tǒng)計學(xué)分析，比較PCR-基因芯片技術(shù)在實際應(yīng)用中的敏感性、特異性、似然比、正確診斷指數(shù)等。7、技術(shù)線路（一）基礎(chǔ)部分：設(shè)計皰疹類病毒通用引物CMV、HSV、EBV等特異引物HHV分子克隆HSV引物合成設(shè)計CMV、HSV、VZV、EBV、HHV特異探針序列分析通用引物PCR擴增特異引物PCR擴增微陣列陽性結(jié)果基因芯片HSVⅠ/Ⅱ、HHV6A/6B亞型特異性探針明確系何種皰疹病毒比較結(jié)果（二）臨床部分：臨床血標本白細胞層DNA抽提臨床血標本基因芯片CSF標本血漿特異性IgM、IgG比較結(jié)果統(tǒng)計分析靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率、似然比、正確診斷指數(shù)8、主要創(chuàng)新點（1）、目前臨床皰疹類病毒感染缺乏早期、快速、準確的診斷方法。既有的PCR技術(shù)在區(qū)分病毒種類時需要多種酶切、