瓊脂糖凝膠電泳

AgaroseGelElectrophoresis

瓊脂糖凝膠電泳2023/7/11Aftertheexperimentisfinished,studentsshouldknowhowtomakeanagarosegel.

掌握瓊脂糖凝膠電泳的操作的方法。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?ExperimentalPurpose)2023/7/12Gelelectrophoresis2023/7/13二、實(shí)驗(yàn)原理(ExperimentalPrinciple)Electrophoresisisatechniqueusedtoseparateandsometimespurifyproteinsandnucleicacids,whichdifferinsize,chargeorconformationfromeachother.Electrophoresishasbecomethemostwidelyusedtechniquesinbiochemistryandmolecularbiology.電泳常用于分離和純化那些分子大小、電荷性狀或分子構(gòu)象有所不同的生物大分子——尤其是蛋白質(zhì)和核酸。正因?yàn)槿绱?，電泳已成為生物化學(xué)和分子生物學(xué)中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。2023/7/14Agaroseisapolysaccharideextractedfromseaweed.Agarosegelshavealargerangeofseparation,butrelativelylowresolvingpower.Byvaryingtheconcentrationofagarose,fragmentsofDNAfromabout200to50,000bpcanbeseparatedusingstandardelectrophoretictechniques.

瓊脂糖是一種海藻多糖，瓊脂糖膠分離范圍很大，但其分辨率卻相對較低。通過改變瓊脂糖凝膠的濃度，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的電泳技術(shù)可以分離200到50,000bp大小的DNA片斷。瓊脂糖凝膠濃度越大，凝膠就越硬。較高濃度的瓊脂糖膠有利于較小的DNA片斷分離，而較低濃度的瓊脂糖膠則可以分離較大的DNA片斷。Thehighertheagaroseconcentration,the"stiffer"thegel.HigherconcentrationsofagarosehelpintheseparationofsmallDNAs,whilelowagaroseconcentrationsallowresolutionoflargerDNAs.

2023/7/15

Agaroseistypicallyusedatconcentrationsof0.5%to2%.

ThedistanceDNAhasmigratedinthegelcanbejudgedbyvisuallymonitoringmigrationofthetrackingdyes.瓊脂糖膠濃度一般在0.5％到2％之間。

通過觀察示蹤染料的遷移距離可以判斷DNA的遷移距離。溴酚藍(lán)染料在瓊脂糖凝膠的遷移速率最大。

當(dāng)遷移足夠距離后，就可以通過Gelview染色來觀察DNA片斷。Whenadequatemigrationhasoccured,DNAfragmentscanbevisualizedbystainingwithGelview.2023/7/16瓊脂糖凝膠濃度0.3%0.6%0.9%1.2%1.5%2%DNA片段分離范圍6-60kb1-20kb0.5-7kb0.4-6kb0.2-3kb0.1-2kb2023/7/17Gelview

isafluorescentdye.Itisoftenincorporatedintothegelsothatstainingoccursduringelectrophoresis,butthegelcanalsobestainedafterelectrophoresisbysoakinginadilutesolutionofGelview.TovisualizeDNAorRNA,thegelisplacedonaultraviolettransilluminator.

Gelview是一種熒光染料。它可以在做膠時混入其中在電泳時進(jìn)行染色，也可以待電泳完成后將凝膠浸泡在稀釋的Gelview溶液中進(jìn)行染色

。但必須將凝膠置于紫外透射儀中才可以對凝膠中的DNA或RNA進(jìn)行觀察。2023/7/18三、試劑與器材（Reagentsandapparatus）

1.Agarose.2.TBE[5×stocksolution(1liter):54gTrisbase,27.5gboricacid,20ml0.5MEDTA,pH8.0].3.10×loadingbuffer:0.25%bromophenolblue,40%sucroseinwater.4.Equipment:beaker,graduatedcylinder,stirbar,microwave,Panbalance,comb,electrophoresistank,andElectro-phoresisSystem,Ultraviolettransilluminator.5.Gelview2023/7/19Ⅰ.喚P詞re瘡pa辰ra唯ti疼on紫o良f頓t聽he忙g柜el（凝太膠的庭制備革）1.制備1％瓊捕脂糖獵凝膠旋。稱趕取0.帝5g瓊脂盞糖，疤放人鞠錐形彩瓶中缸，加壁入50棚mL的0.覆5×播TB韻E緩沖薯液，放栗入微余波爐戒加熱言至完充全溶淡化，噴則為1％瓊鬧脂糖睜凝膠暴液。守（由于笛蒸發(fā)趁作用歲，溶催解前悲在容駱量瓶臂上作身一個乞記號白，溶助解后最用三舍蒸水瞎補(bǔ)足）四、絲式實(shí)驗(yàn)賴步驟(E筋xp情er會im衡en衫ta墳l辭Pr他oc驗(yàn)ed貍ur估es悲)20竄23將/6閣/2風(fēng)6102.制膠嗎器的某安裝①取曉多功范能制臟膠器灑，洗未凈，表晾干盤；②將多滿功能編制膠艘器放比置于歲一水捎平位隆置，愁選擇12貌×6胃cm制膠蠟架，剃然后貸選擇1.趟5m房誠m傾18止te耕et限h的梳街子（庸最大榆加樣喂量25μl）；③將所桃選擇層規(guī)格饅的梳愚子插按入制脂膠架場的定棚位槽膠中。20少23攪/6廈/2悲6113.將熔區(qū)化的姜瓊脂治糖凝他膠液么轉(zhuǎn)入Ge鞭lv碌ie著w專用酒的三豆角瓶中，仗然后禾加入Ge疊lv生ie考w5μl。4.將冷死到60珠℃左右絨的瓊憲脂糖沸凝膠終液，茄緩緩績倒入碼所選肚擇的械制膠籍槽內(nèi)鍛，直爐至有塘機(jī)玻諒璃板化上形還成一躁層均沖勻的頑膠面(注意美不要吧形成區(qū)氣泡)。5.待膠叨凝固累后（30嫩-6貿(mào)0m穴in），椅輕輕剃拔掉仁梳子秒，將奏凝膠剝盤從桶制膠負(fù)槽中塌取出某，放睛入電傻泳槽枝內(nèi)。6.加入火電泳羞緩沖鐵液(0.泳5×)至電銳泳槽殃中。20同23票/6瞎/2挺612Ⅱ.Lo蠟ad束in脅g逐DN轎A夢sa缸mp貸le楚s(加樣)用移利液槍盯緩慢恥將DN分A樣品租垂直踐加入漁加樣這孔直月至開軋口下爺方。1.DN藍(lán)A飲sa蛙mp新le僅s：10μl2.Lo頌ad茶in答gbu痛ff壘er(6邀X)：2μl3.渠D速NA警m蔽ar英ke命rs：6μlTot洲al12彎μl20揮23紡/6田/2鞠613Ⅲ.要Ge講l（電盈泳）1.接通非電泳恐槽與肢電泳淹儀的混電源(注意正負(fù)集極，DN議A片段川從負(fù)厘極向娛正極枕移動)。保萬持電屈壓60－80念V。2.當(dāng)溴磁酚藍(lán)知染料歇移動揮到距這凝膠濁前沿1-貪2c雀m處，咳停止綠電泳慚。20滋23無/6端/2柱614Ⅳ.印G鐘el捉I去nt紋er霸pr衛(wèi)et啊at卵io危n（凝綿膠圖冠像解元釋）Th追e贏un臘cu談t挺DN萌A懷la敬ne吳m藥ay戴h臂av通e適se來ve坦ra軋l族ba抽nd獅s頌in姜i宵t.悉T擾hi術(shù)s揉oc囑cu炎rs罪b夾ec餡au仆se意t恭he愉mob豎il若it跪yof缺p晌la獄sm可id量D砍NA驗(yàn)i同n服anag鵲ar堤os真ege雜l驢de舅pe甲nd專s垮on公i像ts胃m垃ol斃ec池ul復(fù)ar嬌c膏on閉fo緊rm返at龍io嚼n顏as池w牧el涉l局as貢i急ts宵s湯iz持e扭in技b變as遭e梯pa消ir際s.滲P暗la光sm柱id臟D趟NA碧c佛an株e禾xi底st兄i惹n腎an裹y礎(chǔ)on宿e順of鞠t騾hr麗ee董m鍋aj鍛or腫c雀on升fo蘭rm肢at紫io撿ns攤:未切辟割的股質(zhì)粒DN呼A在其淡泳道慚上也衫許會竄出現(xiàn)構(gòu)幾個成條帶正，之桿所以中這樣椅是由稈于質(zhì)擊粒DN祖A在瓊墾脂糖欣凝膠錘中的揭遷移擁距離劉是由杜其分緞子構(gòu)栗象及腐其堿努基對縫大小臨所決拒定的歇。質(zhì)秒粒DN買A以下乎列三所種主廚要構(gòu)鏡象中談的任豪何一紋種形步式存佩在：20某23陷/6勉/2捏615Su哭pe押rc荷oi音le梯d--蠟p正la另sm處id甩i察s帳us繭ua它ll尸y兆se哲en餅a棗s秤asu佳pe庭rc護(hù)oi骨lin嗓a橋b祖ac尊te劍ri兆al刻c跪el輩l.緣瑞T嶺hi憲s逗fo慎rm泰o飛f妻th雨e膛pl逗as中mi吳d貞wi漫ll落m委ov蛾e盤th徑e達(dá)fa津st淋es戲t百th戰(zhàn)ro陸ug突h游th擁e政ge逆l線du耽e袍to蒜i熊ts糠c宣om采pa煙ct紫s昆tr木uc綢tu宅re病.超螺恨旋——質(zhì)粒殼在細(xì)姻菌細(xì)隊(duì)胞以粥超螺坊旋結(jié)痕構(gòu)存鳴在，塌由于像其結(jié)潑構(gòu)致捎密，練它在觀凝膠庭中的仰泳動鐵速度坊最快畫。20沫23旨/6菌/2狠616Ni辣ck害ed--飄Du喂ri鬧ng立p撕la產(chǎn)sm革id生D膨NA鉗r詞ep隨li漂ca橋ti僚on瞇,to姿po句is既om師er紹-a勝seI址i坐nt亭ro溫du者ce辨s松a拼ni西ck鞠i妙nt籌o誼on蘿e趙st拜ra漲nd租o征f緩th屆e荒DN衣A鋼he慕li江x額an越d券un紫co斧il損s陸th盯e內(nèi)pl跨as顆mi抄d.她P矛hy走si夢ca陳l閥sh復(fù)ea綢ri蜘ng妨a漿nd邊e盆nz露ym腎at但ic降c續(xù)le禾av巨ag酷e奪du凡ri捕ng從p杰la啊sm猛id桐i組so浪la珠ti頑on拾m性ay位a座ls腳o帆in浸tr蹦od年uc你e諸ni而ck沈s泛in斧to殼t父hesu臭pe傳rc府oi植le州dpl陰as賞mi便d克to諸p勿ro猛du叨ce細(xì)a滋r跨el仗ax谷ed照o叛pe命n竊ci暗rc尺ul災(zāi)ar另s恰tr屢uc型tu血re酒.切口——在質(zhì)弓粒DN悅A復(fù)制施過程僑中，熊拓?fù)淦D異構(gòu)粗酶I會在DN列A雙螺術(shù)旋中戴的一多條鏈痛中引貫入一倡個切斧口，痕解開欺質(zhì)粒毯的超柳螺旋軍。在墾質(zhì)粒迫分離科過程蘋中由尺于物桃理剪均切和精酶的篩切割愁作用飄同樣珍也會撥在超弓螺旋軟質(zhì)粒圓中引石入切叉口從勾而產(chǎn)涼生松汗散的論開環(huán)恨結(jié)構(gòu)育。這杠種形攪式的夢質(zhì)粒恒遷移狐速率確介于惰超螺旅旋和翁線性DN秘A之間碎。20瓦23棕/6頌/2稅617Li她ne帽ar——Li鉛ne所arpl層as辣mi學(xué)d齊DN緣瑞A郊o(jì)c齡cu儀rs哄w徐he搬n屑da近ma史ge倉r趨es耳ul欺ts厭i蝕n壯st筒ra筍nd壯n幸ic狗ks斃d姑ir慢ec望tl瓶y挑op該po公si頃te航e然ac驢h惠ot法he餅r雪on成t禍he根D乘NA執(zhí)h族el底ix選.演Th脹is磨f死or壤m(xù)哪is拖t步he肆s威lo蜓we掙st回m毫ig雕ra怖ti告ng孝f庸or居m寨of筐p糟la彩sm蠢id星.繼Th幕e逗pr甜es腸en塘ce比o草f踐li伯ne牽ar判D烏NA想i忍n哥a樹pl坡as喚mi本d除pr炎ep聯(lián)ar爭at固io灘n才is嘴a屋s朽ig劑n針of夾e聞it賭he樹r浙nu劃cl許ea翠se學(xué)c戚on腐ta悠mi撐na慰ti合on睛o臺r味sl果op請py擴(kuò)l膜ab裳p言ro兄ce怪du明re知.線性——當(dāng)DN蟲A損傷憶在DN財(cái)A雙鏈東相對結(jié)應(yīng)的臺兩條蹦鏈上胃同時稠產(chǎn)生們切口奶時，磚就會敗出現(xiàn)決線性儉質(zhì)粒DN體A，這襲種DN垃A的泳促動速軟率最儲慢，勺質(zhì)粒贊制備畜過程搜個出中現(xiàn)線坊性DN黑A說明稀存在偷核酸頸酶污怖染或隱實(shí)驗(yàn)揪操作隔有問呆題。20卡23倆/6弓/2熟618五、紫實(shí)驗(yàn)?zāi)罱Y(jié)果(ex庸pe遲ri沸me媽nt驅(qū)al嚷r燒es插ul鐵ts)1、DN期A相對往分子抗質(zhì)量幅標(biāo)準(zhǔn)柱物（ma凡ke潑r）2、pU偵C1越9質(zhì)粒DN練A經(jīng)Ec至oR途I完全妄酶解3、pU矛C1攜9質(zhì)粒DN纏A經(jīng)Ec弱oR藍(lán)I部分座酶解4、自革提的pU箭C1鍛9質(zhì)粒DN榜A（此多結(jié)果階提得糊較好迅，為1條帶貌，以艷超螺卸旋為載主。勝）20路23顏/6剃/2膊619六、腸注意煉事項(xiàng)(No禮te隊(duì)s)Th旬e騰mob坑il槍it蒜yof冬t織he時D煤NA扔d押ep急en視ds蔽o縮慧n誰th就e躬fo另ll厘ow晨in煮g求fa所ct關(guān)or榮s：Mo拘l(wèi)e雀cu槐la面r鼻si薦ze會o踐f看DN婚ADN禮A的分士子大碼小——分子裳量越糠小，旋遷移侵越快爸。b.Ag北ar武os方eco縫nc名