第七章 分子生物學(xué)方法上

第七章分子生物學(xué)研究方法第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧第二節(jié)DNA基本操作技術(shù)第三節(jié)RNA基本操作技術(shù)第四節(jié)SNP的理論與應(yīng)用第五節(jié)基因克隆技術(shù)第六節(jié)蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)7/2/20231第一節(jié)重組DNA技術(shù)回顧一、重組DNA技術(shù)發(fā)展史上的重大事件第一，在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者：即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)，解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；

7/2/20232第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制，解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；

第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō)，成功地破譯了遺傳密碼，闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。7/2/20233但是：當(dāng)時(shí)由于缺乏有效的分離和富集單一DNA分子的技術(shù)，科學(xué)家無(wú)法對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行直接的生化分析。隨著DNA分子體外切割與連接技術(shù)及核苷酸序列分析技術(shù)的進(jìn)步直接推動(dòng)了重組DNA技術(shù)的產(chǎn)生與發(fā)展。7/2/20234重組DNA技術(shù)（recombination）：

是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來(lái)源的DNA分子通過(guò)酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過(guò)程。7/2/20235工具酶：

限制性核酸內(nèi)切酶（restrictionendonuclease）

DNA連接酶（DNAligase）工具酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用是現(xiàn)代生物工程技術(shù)史上最重要的事件。7/2/20236（一）限制性內(nèi)切酶(RE)

1、概念：一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA分子中特異核苷酸序列的DNA水解酶。

2、分類：

I型、II型、Ⅲ型7/2/20237

類型II：識(shí)別位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)一致，具特異性。單體酶，性質(zhì)穩(wěn)定，Mg2+為輔助因子。目前已分離了數(shù)百種。

類型I：識(shí)別的DNA序列長(zhǎng)約十幾個(gè)bp；酶切位點(diǎn)在距識(shí)別位點(diǎn)1kb左右處隨機(jī)切割，非特異性；復(fù)合酶，無(wú)使用價(jià)值。

類型Ⅲ：酶切位點(diǎn)在識(shí)別位點(diǎn)下游24-26bp處，非特異性。單體酶，如HgaI:GACGCnnnnn7/2/202383、II型限制性內(nèi)切酶的基本特性5’…GCTGAATTCGAG…3’3’

…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的識(shí)別序列EcoRI的切割位點(diǎn)(1)識(shí)別dsDNA分子中4～8bp的特定序列(2)大部分酶的切割位點(diǎn)在識(shí)別序列內(nèi)部或兩側(cè)(3)識(shí)別切割序列呈典型的旋轉(zhuǎn)對(duì)稱型回文結(jié)構(gòu)7/2/20239Ec益oRI等產(chǎn)脂生的5‘粘性乖末端5‘頃…兼G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G炭…盜3’3‘降…菜C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C耀…慨5’Ec閥oRI37勁℃5‘票…凡G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G清…遇3’3‘文…漸C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C薦…漠5’退火4-妻7乘℃5‘陶…估G-C-T-G家A-A-T-T-C-G-A-G垂…蘿3’3‘椅…碑C-G-A-C-T-T-A-A飽G-C-T-C爛…誓5’P睜OH6/根26癥/2海02威310（二）DN輕A連接別酶(li桑ga特se)將兩聯(lián)段DN欺A片段平連接百起來(lái)野的酶刻稱為DN熄A連接港酶。1、E.且co短liDN般Ali黨ga稍se:連接粘端,催化無(wú)需要NA香D+參與2、T4DN廣Ali健ga臟se:連接粘端老和平須端，催踏化需族要AT啞P參與都不竊連接輕單鏈6/定26緣瑞/2慮02套311DN衰A連接曉酶的暢基本抄性質(zhì)修復(fù)雙鏈DNA上缺口處的磷酸二酯鍵nickOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’POHDNA連接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’6/阿26僑/2剃02燈312二、盜基因咸克隆謝的載搭體克隆敢用載蘿體：是轎指具糧備自刺我復(fù)罩制能乎力的DN拋A分子臥。常見繳的分晚子克溝隆載念體有湯：病腫毒、燒噬菌具體、述質(zhì)粒劉。克隆斬用載州體的榜選擇具備禮復(fù)制鬧原點(diǎn)挑，能買夠自飾我復(fù)遮制具備規(guī)適合項(xiàng)的酶廢切位睛點(diǎn)，貼且不揭在原站點(diǎn)具有亭篩選載指標(biāo)對(duì)抗公菌素茂的抗殿性基因雷產(chǎn)物很的顯呢色反泄應(yīng)6/害26陸/2出02水313載體雷的功退能運(yùn)送甩外源撞基因高效繞轉(zhuǎn)入薦受體殖細(xì)胞為外帥源基挽因提律供復(fù)制孝能力或整合抽能力為外稠源基聞因的擴(kuò)增違或表砌達(dá)提供明必要您的條折件6/吉26炮/2吩02武314三、言基因摔克隆卸的操杏作1、從刷復(fù)雜女的生達(dá)物有圓機(jī)體井基因墳組中而，經(jīng)梢過(guò)酶辯切消弄化或PC堵R擴(kuò)增壤等步過(guò)驟，分離出帶筒有目沙的基釀因的DN糖A片段面；2、在賴體外再，將疑帶有跨目的疾基因葬的外字源DN付A片段連接到能叔夠自屑我復(fù)燥制的掠并具穿有選富擇記濫號(hào)的珍載體喉分子舟上，呢形成海重組DN潤(rùn)A分子趕；6/折26緩/2吊02國(guó)3153、感受優(yōu)態(tài)細(xì)改胞的宿制備—氯化槍鈣法第一須次搖授菌第二憤次搖拘菌離心抱收集府細(xì)菌0.至1MCa徹Cl2重懸付細(xì)胞,冰浴30圖m償in離心認(rèn)、重漁懸重?cái)[復(fù)一隆次6/猜26質(zhì)/2震02害3164、轉(zhuǎn)螞化（tr議an臘sf傻or奮ma炊ti樂(lè)on）感受蠢態(tài)細(xì)莖胞與旋連接叫產(chǎn)物惰輕輕罩混勻,冰浴30mi六n，42邀℃水浴熱激60兼–9藝0s，快亭速冰浴2稈mi千n加液臉體LB振蕩脅培養(yǎng)拉，使細(xì)胞魯復(fù)蘇心。6/廈26膛/2磚02新3175、篩勿選（sc膏re響en薦in熊g）①根據(jù)誤重組轎載體毀的表嗎型蜘席抗肌藥性診（Am壘pr、Te卷tr）剝其他ma斧rk（-互補(bǔ)貴篩選嗚）②根據(jù)DN挖A限制株酶的六酶譜寨分析③PC軌R反應(yīng)6/處26預(yù)/2通02棉318基因漢克隆洲流程土示意肢圖6/姐26物/2夸02房誠(chéng)319帶有突負(fù)電阻荷的DN販A或RN拉A核苷屢酸鏈夾，依鳳靠無(wú)唱反應(yīng)寫活性寒的穩(wěn)耐定的介質(zhì)（瓊治脂糖輩凝膠密和聚均丙烯撫酰胺道凝膠洗）和宴緩沖從液，魯在電啄場(chǎng)中熟以一武定的湖遷移沙率從趴負(fù)極源移向朵正極雁。根吉據(jù)核眾酸分子諸大小不同孟、構(gòu)型的差星異，擺以及洋所帶電荷的不豎同，寫可以橡通過(guò)證電泳穩(wěn)將其摩混合岡物中爪的不嘆同成刮分彼晌此分魔開。一、童核酸會(huì)的凝包膠電心泳（一社）基本甲原理：第二賽節(jié)DN目A基本洗操作斷技術(shù)6/魯26翅/2浩02陵320電泳醋遷移劑率：電看泳分鑼子在略電場(chǎng)史作用肺下的唱遷移窯速度肥。與電繭場(chǎng)強(qiáng)公度和壓電泳申分子脊所帶壟的凈遷電荷雪成正鎮(zhèn)比。與分縣子的作摩擦把系數(shù)槐成反犬比，招摩擦反系數(shù)遮是分案子大息小、驅(qū)極性艘及介閃質(zhì)粘犁度的漏函數(shù)帳。支持任介質(zhì)：穩(wěn)恒定，矩?zé)o反咸應(yīng)活啟性；6/態(tài)26塌/2奔02喉321（二濤）種域類1)按凝餡膠材鄰料分:聚丙逢烯酰千胺凝紙膠和扇瓊脂歐糖凝疾膠電喊泳2)按電永泳裝璃置分:水平明式/瓊脂章糖凝擁膠;豎式/聚丙股烯酰餅胺凝敬膠3)兩種婚方法江比較百：分滴離效停果和戶分離熔范圍;操作脂難易6/昆26餐/2鐘02沿322瓊脂家糖凝不膠電碗泳瓊脂歉糖是做從紅鄙色海聰藻產(chǎn)醉物瓊遠(yuǎn)脂中蒼提取兄的一漆種線性種多糖津聚合免物。將塌瓊脂綿糖粉惠未加舊熱到摔溶點(diǎn)結(jié)后凝黎固，煮便會(huì)裹形成尖良好解的介焰質(zhì)，腫其密誘度由額瓊脂謎糖的循濃度債所決忍定。特點(diǎn)綿：分辨衛(wèi)能力氣低，氣但應(yīng)河用范朗圍廣村，適窄用于紋較大籍分子麥的分良析。疫適于肯分離20烈0bp~激50綁k申b的DN暴A片段咱。操椒作簡(jiǎn)災(zāi)便。6/渠26伍/2子02步3236/濕26墾/2留02獸324聚丙柳烯酰漢胺凝椒膠電懶泳聚丙織烯酰訴胺凝少膠是沃一種行人工綠合成險(xiǎn)的凝縫膠，圖由丙烯裳酰胺炒單體和交聯(lián)梯劑甲歸叉雙繭丙烯修酰胺在催臭化劑過(guò)硫出酸銨和加眨速劑TE勺ME烏D根(四甲霞基乙唇二胺疫）的作民用下舍聚合斬而成蕉。聚合他時(shí)，英由單自體丙積烯酰晨胺聚戒合成浩鏈狀慕物，養(yǎng)由交蔥聯(lián)劑腔甲叉限雙丙收烯酰漏胺將進(jìn)鏈與閱鏈交令聯(lián)成正網(wǎng)狀準(zhǔn)，形御成立眼體的汁不溶歲于水荷的凝室膠。6/遇26切/2厭02段325特點(diǎn)逐：分辨余能力到高，反但應(yīng)評(píng)用范獄圍小邪，適四用于殲較小翁分子期的分芳析。沫適于治分離5bp~績(jī)50憂0bp的DN師A片段愈。操案作復(fù)屈雜。核酸籍分子腸的染富料溴化乙錠（EB），因具芬有扁平慨分子的空贊間結(jié)姓構(gòu)，行能插魂入到DN屬A分子總或RN才A分子烘的相碎鄰堿弄基之放間，討并在30釋0n貞m波長(zhǎng)惰的紫員外光拔照射緊下發(fā)鍋出熒光。6/忌26然/2吹02張326（三）

用途

瓊脂糖凝膠用于DNA和RNA的常規(guī)分析；聚丙烯酰胺凝膠常用于小分子核酸分析。（四）

凝膠電泳的一般程序制膠點(diǎn)樣電泳染色觀察6/范26擴(kuò)/2守02張3276/歸26命/2麗02鼻3286/模26笛/2有02帝329二、訊細(xì)菌股轉(zhuǎn)化細(xì)菌素轉(zhuǎn)化桿（tr得an似sf戚or存ma魯ti牽on）是指氣一種蘭細(xì)菌利菌株須由于催捕獲戲了來(lái)畜自另孟一種津細(xì)菌下菌株DN色A而導(dǎo)劃致性映狀特芝征發(fā)慮生遺跟傳改頂變的恐生命菜過(guò)程暈。提哪供轉(zhuǎn)肉化的DN銀A菌株園叫供體洞菌株，接森受轉(zhuǎn)鼠化的DN廣A菌株棕叫受體蔥菌株。目前核常用編的轉(zhuǎn)第化方版法有Ca躬Cl2法(化學(xué)栽轉(zhuǎn)化令法)和電轉(zhuǎn)兇化法。6/旬26謀/2創(chuàng)02厘330感受頭態(tài)細(xì)印胞的哲制備—氯化心鈣法第一次搖菌第二次搖菌離心收集細(xì)菌0.1MCaCl2重懸細(xì)胞,冰浴30min離心、重懸重復(fù)一次6/羨26炭/2劍02支331轉(zhuǎn)化（tr昂an盞sf襯or手ma則ti余on）感受德態(tài)細(xì)修胞與言連接盆產(chǎn)物飽輕輕妹混勻,冰浴30分鐘旱，42℃水浴熱激60膜–9媽0秒，快庸速冰浴2分鐘摧加液行體LB振蕩瓣培養(yǎng)籃，使細(xì)胞饞復(fù)蘇鐵。6/發(fā)26寫/2織02簽332三、PC竄R基因主擴(kuò)增聚合肯酶鏈載式反剝應(yīng)（po乓ly辯me筒ra鎮(zhèn)se考c畢ha去in透re僚ac脖ti叉on農(nóng))，即PC養(yǎng)R技術(shù)漆，是捎一種觀在體即外快鐮速擴(kuò)煩增特爐定基絡(luò)因或DN揮A序列猛的方槍法。1985年，美國(guó)PE-Cetus公司的Mullis等人發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,隨后PE-Cetus公司推出了第一臺(tái)PCR自動(dòng)化熱循環(huán)儀1993年，Mullis等因此項(xiàng)技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。6/鈴26撲/2館02都333PC返R特異遷性，即焰所擴(kuò)杰增片胞段是舊由兩維個(gè)人挨工合窗成的坡引物取序列普決定脖的。6/詠26賽/2芝02像334PC噴R反應(yīng)微原理①變貨性②退好火③延卵伸6/丑26甘/2居02講335反應(yīng)胖體系趁的成庸分耐熱斜的DN喜A聚合匙酶PCR反應(yīng)的緩沖液Mg2+Tris?Cl

引物d洽NT便P模板DN驢A6/容26直/2滔02砍336溫度提循環(huán)趴參數(shù)變性：雙汁鏈DN單A分子必加熱單分離與成兩頓條單倒鏈DN井A分子脖的過(guò)您程。變性遲溫度：是素指雙殿鏈DN躲A分子50％發(fā)倉(cāng)生變作性時(shí)填的溫旨度，閥一般掙為94姥∽9賞5℃6/廊26填/2史02承337退火：兩掀引物輔分別頑與兩青條DN夾A的兩幼側(cè)序拐列特秀異性鄉(xiāng)豐互補(bǔ)惜，形蕉成雙診鏈的災(zāi)過(guò)程聰稱為剃退火傲。退火肉溫度一般艷在50雄∽6云5℃之間老，具掏體溫侮度與卷引物柱長(zhǎng)度苗、堿儀基組厚成以茶及濃線度有鈔關(guān)。6/造26沸/2閣02絨338延伸：在私適宜華條件祝下，DN脹A聚合喚酶以匯單鏈DN炒A為模束板，撕以4種脫云氧核查苷三辱磷酸幸（d恩NT籃P在)為底童物,在引討物的角誘導(dǎo)相下，晉按5′區(qū)→搬3′方向貸復(fù)制各互補(bǔ)DN療A的過(guò)炭程。延伸硬溫度一般斯為70滴∽7繁5℃，此拖時(shí)DN得A聚合櫻酶活豈性最旅高。6/道26步/2盞02扇339時(shí)間頂參數(shù)變性搏時(shí)間：決違定于DN漫A的復(fù)稠雜性點(diǎn)，一米般選漢取94℃1答mi救n,因過(guò)登長(zhǎng)的降高溫潮時(shí)間碼，會(huì)載降低DN綁A聚合列酶的擺活性護(hù)；退火捧時(shí)間：一般潤(rùn)情況新下取30絞s跑~1倦m份in，因兔為引達(dá)物比腥較短懲；延伸絲式時(shí)間：根據(jù)悲擴(kuò)增逃片段犯的長(zhǎng)盲度而證定，閱一般缸在1k可b以內(nèi)微的片惱段需掛延伸1m到in聰,更長(zhǎng)譜的片考段需咽相應(yīng)屈延長(zhǎng)普時(shí)間心。6/拆26勺/2類02唐340引成物1、引溫物長(zhǎng)棗度在15∽3法0bp之間舟，引物米的退意火溫丘度Tm飾=桿4盾(G羞+C討)搭+慈2(歸A+嗚T)2、堿蓬基隨瞇機(jī)分料布避免漂一連揪串相屢同堿掘基，皇引物膠本身深不應(yīng)削存在拖互補(bǔ)鴿序列類，兩虜條引踢物間飲也不啊應(yīng)有勇互補(bǔ)丸性，東尤其坦是3′端；6/則26躍/2亮02不3413、G武+煙C含量G秘+布C含量稱一般忠為40％∽60％4、引求物3′端堿額基的筋特異腥性。6/捷26辛/2薪02吧342PC選R技術(shù)因的特輸點(diǎn)：第一甩，特委異性戰(zhàn)強(qiáng)第二宮，效林率高第三眼，靈繡敏度藍(lán)高皮克(p冤g=沖10-1閣2)量級(jí)糧擴(kuò)增診到微趴克(ug=1冶0-6)水平能從10探0萬(wàn)個(gè)脹細(xì)胞貧中檢指出一穗個(gè)靶增細(xì)胞第四隙，對(duì)巴標(biāo)本謀的純厲度要塞求低血液綁、體叮腔液斷、洗展嗽液者、毛釣發(fā)、付細(xì)胞視、活戰(zhàn)組織雅等組桐織的脾粗提DN暮A6/傲26迫/2經(jīng)02偵3436/衡26倡/2途02撲344四、旅實(shí)時(shí)妄定量PC睬R實(shí)時(shí)烤定量PC蓮R技術(shù)壓：指衛(wèi)利用縣帶熒料光檢葡測(cè)的PC功R儀對(duì)鬼整個(gè)PC豬R過(guò)程管中擴(kuò)阿增DN丑A的累奶積速聞率繪抵制動(dòng)鵝態(tài)變彎化圖獨(dú)，利燥用熒監(jiān)光信限號(hào)積綱累實(shí)笨時(shí)監(jiān)乒測(cè)整合個(gè)PC尚R進(jìn)程籃，從視而測(cè)玩定終膛端產(chǎn)盜物的及豐度緊。6/備26憑/2遣02問(wèn)345熒光張?zhí)结樠a(bǔ)事先擦混合廳在反愿應(yīng)管原中，攤只有痛與DN促A結(jié)合貍后才劃能被敘激發(fā)竭出熒育光。6/京26至/2懼02傅3465’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’5’TaqTaq3’5’3’TaqTaq5’5’Re鎖pe侮at非序柏列特敢異性少的DN冶A結(jié)合漁的熒討光探饑針BDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllll與雙斜鏈DN淺A結(jié)合崗；與DN末A結(jié)合充后才碌發(fā)出訊熒光道。6/結(jié)26擱/2監(jiān)02工347特異擴(kuò)性的塘熒光膠探針特異海性的碰熒光門探針茶是把附熒光唯化合狹物標(biāo)竄記到班特異潤(rùn)性的研寡核鐘苷酸叮上形跟成熒反光標(biāo)中記的DN妖A探針盛。通抓過(guò)探簡(jiǎn)針與PC寫R產(chǎn)物曠特異塵性的秩結(jié)合蜂，在PC煙R過(guò)程賤中可桃對(duì)產(chǎn)年物實(shí)速現(xiàn)實(shí)鄭時(shí)、鼻定量格檢測(cè)語(yǔ)。6/繞26程/2狂02躬348Ta邀qM跪an探針記是一策小段紛被設(shè)忍計(jì)成搏可以加與靶DN去A序列始中間害部位棒結(jié)合捆的單追鏈DN款A(yù)（一厭般為5~搞50bp），粉并且奧該單添鏈DN瞎A的5’和3’端帶姥有短為波長(zhǎng)裝和長(zhǎng)鄙波長(zhǎng)評(píng)兩個(gè)定不同嚷熒光五基團(tuán)償。6/父26缸/2膝02悔349當(dāng)探助針單廚獨(dú)存蛋在時(shí)替，由安于熒店光共匯振能豆量轉(zhuǎn)醋移的洲作用宿而發(fā)恒生熒眼光猝養(yǎng)滅?？h在PC曠R過(guò)程兼中，殿由于Ta腹qD折NA酶的5’累-3?！馇胁济富钫仔缘募遄饔煤?，使野探針談的5’端的坑基團(tuán)潮被切突斷，踩加大構(gòu)了熒盜光基鋸團(tuán)間磁的的作距離笑，被下切下漲來(lái)的擁熒光冰基團(tuán)遺恢復(fù)永熒光驗(yàn)。一分吼子的畝產(chǎn)物危生成動(dòng)就伴黎隨著炒一分貞子的蛇熒光朽信號(hào)訓(xùn)的產(chǎn)導(dǎo)生。幸隨著嶼擴(kuò)增伍循環(huán)柏?cái)?shù)的舊增加平，釋益放出厘來(lái)的雜熒光懇基團(tuán)板不斷織積累靈。因濟(jì)此，Ta蔽qm謠an探針企檢測(cè)呀的是賀積累辜熒光致。6/何26輝/2青02暢3505’5’3’3’d.NT塌PsTh菠er汁ma誼l走St爺ab澤leDN挨A踐Po挺ly比me鳥ra趕sePr趕im傍er粉s5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’Ad勞d并Ma丙st竄er襲M四ixan量d妻Sa桂mp抄leDe幅na揉tu京ra抱ti肅on5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’An卸ne翁al貿(mào)in奪gRe秘ac浪ti依on讀T蘆ub炒eTaql5’3’RQProbe5’3’RQ應(yīng)用Ta課qM引an探針乓的實(shí)悠時(shí)定堡量PC認(rèn)R技術(shù)6/柜26聞/2收02批3515’3’5’3’5’3’RQ5’3’Taq3’QR5’5’3’3’QTaqR5’5’3’QTaqR3’5’5’3’3’QTaqR5’lR6/屬26容/2富02琴352實(shí)時(shí)能定量PC趕R的絕香對(duì)定色量Ct值：指PC筍R擴(kuò)增很過(guò)程安中，徒擴(kuò)增心產(chǎn)物騎熒光蔑強(qiáng)度掃首次棒超過(guò)喜設(shè)定群閾值沫時(shí)，PC要R反應(yīng)淘所需慌的循悶環(huán)數(shù)斃。6/油26另/2乖02粥353模板博起始惑濃度丘越高翅，Ct值越獨(dú)小Ct值與旬模板峰起始奏拷貝我數(shù)的柄對(duì)數(shù)贈(zèng)存在恥線性穩(wěn)關(guān)系Ct值與羞模板慘起始五濃度輩的關(guān)悄系如果里模板算濃度辦增加1倍，Ct值就求提前1個(gè)循勻環(huán)到碌達(dá)如果親模板勺濃度焦減少1倍，Ct值就鼠滯后1個(gè)循拳環(huán)到你達(dá)6/麻26轉(zhuǎn)/2搖02村354絕對(duì)導(dǎo)定量可以虹得到糖某個(gè)矮樣本簽中基堵因的桂拷貝電數(shù)和弦濃度毯。（圖5-杏11）相對(duì)柿定量（兩規(guī)個(gè)樣猴本中脂的基森因表醬達(dá)水烘平進(jìn)趣行比牙較艙）（圖5-井12）五、莖基因默組DN字A文庫(kù)義構(gòu)建是指曲將某損種生烤物體錢的全險(xiǎn)部基慘因組DN下A用限制財(cái)性內(nèi)副切酶或機(jī)械扶力量切割查成一傾定長(zhǎng)漆度范梯圍的DN吵A片段錘，再授與合焰適的義載體織在體往外重組并轉(zhuǎn)化相應(yīng)肯的宿貧主細(xì)匪胞獲煮得的所有至陽(yáng)性蒼菌落，這教個(gè)群之體就奏稱為禍該生俱物基因云組文社庫(kù)。6/預(yù)26戚/2姥02喪356基因圖組DN遠(yuǎn)A文庫(kù)缺的類例型根據(jù)始所選罩用的性載體得可以篩分為貝：質(zhì)無(wú)粒文慢庫(kù)、匪噬菌腳體文忙庫(kù)、羽粘粒蘇文庫(kù)雹、人大工染霜色體重文庫(kù)導(dǎo)（細(xì)淹菌人撫工染衣色體演文庫(kù)涌、酵較母人疲工染言色體產(chǎn)文庫(kù)嘗）。6/絕26曲/2桐02仿357基因乞組DN飾A文庫(kù)聾的質(zhì)狂量標(biāo)們準(zhǔn)一個(gè)托理想蹦的基梳因組DN該A文庫(kù)沾應(yīng)具河備下返列條虜件：重組魔克隆震的總則數(shù)不弟宜過(guò)館大，圈以減破輕篩裂選工襪作的壩壓力;載體餃的裝封載量推最好最大于陷基因菠的長(zhǎng)陷度，給避免說(shuō)基因醋被分歪隔克陳隆;克隆醫(yī)與克咐隆之葛間必運(yùn)須存村在足換夠長(zhǎng)登度的質(zhì)重疊擊區(qū)域雅，以黑利克襪隆排遞序;克隆臂片段芳易于傲從載珠體分桌子上勒完整御卸下;重組嫌克隆傅能穩(wěn)辛定保覺存、忍擴(kuò)增自、篩攝選。6/歉26集/2曾02改358基因器組DN勞A文庫(kù)絨構(gòu)建螺的程企序①載體DN服A的制菜備；②桿基因厚組DN牙A的提腰??；③拴基因膨組DN沸A的部鴨分酶驗(yàn)切、走分離肚與回牙收；④性載體更與外徐源片小段的財(cái)連接洽與轉(zhuǎn)眼化或通侵染概宿主誕細(xì)胞疼；⑤朝重組晃克隆近的挑梯選和堂保存默。6/路26續(xù)/2攔02怨3596/禍26早/2宋02靜360第三猴節(jié)RN備A基本孩操作伸技術(shù)一、蠢總RN趴A的提潤(rùn)取液氮冷研磨警組織貢、勻旦漿加入Tr道iz邀ol試劑灑（異學(xué)硫氰巧酸胍-苯酚丑）溶們解細(xì)虹胞氯仿詞抽提異丙議醇胡沉淀溶課解在變拾性條載件下漏采用刷電泳煮方法軟對(duì)其飾進(jìn)行混檢測(cè)6/序26反/2臣02賽361二、mR吵NA的純搬化

大部分真核生物的mRNA有3’poly（A）尾巴

oligo(dT)能與poly(A)尾巴互補(bǔ)，由此來(lái)獲得mRNA。AAAAAAAAAAn5’cap6/赴26牲/2太02對(duì)3626/貸26賽/2牧02鹽363分離mR懇NA的試辰劑盒可應(yīng)蜘用Pr訊om漆eg榴aPo螺ly射ATtr拔ac午t莊mR巷NA分離抬系統(tǒng)分離po鑰ly淘(A趟)m放RN劑A。將用生物征素標(biāo)陡識(shí)的寡血聚(dT)引物荒與細(xì)卵胞總RN己A共溫彈育，燈加入霞與微掩磁球貓相連絨的抗生象物素梯蛋白，用糕磁場(chǎng)型吸附礦通過(guò)惱寡聚(dT)引物宿與抗虜生物順?biāo)氐案准爸蹚?qiáng)力寺微磁恥球相棚連的mR贊NA。6/畝26鈴/2格02表364三、cD匆NA的合小成新可同來(lái)時(shí)在陡反轉(zhuǎn)諸錄系服統(tǒng)中翁加入Ol爛ig高o（dT）12涉-1屆8-該me地r及隨機(jī)山引物R6，以森保證殘得到柔全長(zhǎng)cD害NA；綱應(yīng)圣選用佩活性剪較高丑的反轉(zhuǎn)污錄酶藏（Re佳ve駁rs損e喘tr錄an段sc岔ri濕pt駁as敲e）；凝應(yīng)燦選用甲基腳化dC扣TP(防止鼠被限浮制性揉內(nèi)切撒酶切秋割)；見應(yīng)診保證料所獲斯得雙飽鏈cD巡壽NA的方向源性(cD餅NA兩端漿加上謝不同京內(nèi)切然酶所顫識(shí)別嚷的接睡頭序桌列);因?yàn)槭劢^大垂多數(shù)頓大腸圍桿菌階細(xì)胞嬌都會(huì)綠切除什帶有5’紹-m協(xié)et倍hy穗l曾C的外工源DN衰A，所趕以，寧應(yīng)選匯用mc漸rA-托,mc毛rB-菌株味。6/枯26何/2抱02窯3656/畫26敬/2閥02鏡366定向cD伍NA的合黎成及浴分子個(gè)修飾6/賄26賤/2稅02抽367四、cD床NA文庫(kù)將某銅種細(xì)藝胞的秋全部mR飯NA通過(guò)元逆轉(zhuǎn)垂錄合顫成cD散NA，與積載體講連接攝，然普后轉(zhuǎn)貞化宿級(jí)主細(xì)穩(wěn)胞，淡得到撇含全仆部表?yè)徇_(dá)基金因的假種群樂(lè)，稱療為cD榜NA文庫(kù)肉。cD謎NA文庫(kù)漏具有低組織棵細(xì)胞刺特異紫性。構(gòu)建cD洽NA文庫(kù)貌，材規(guī)料來(lái)討自mR芒NAcD日NA文庫(kù)朱只含駱有mR糠NA的分牙子結(jié)匹構(gòu),不含英真核香基因膠的間愚隔序袋列和柏調(diào)控這區(qū)。6/動(dòng)26工/2局02使368cD茂NA文庫(kù)梅的特怨點(diǎn)：①出發(fā)積材料爭(zhēng)是一堅(jiān)定時(shí)糞空條卷件下銅的細(xì)愛胞總mR嫁NA冶,在轉(zhuǎn)因錄水桶平上樂(lè)反映軟生物錄在特材定發(fā)撕育時(shí)軌期、太特定樓組織(或器后官)在一垂定環(huán)慨境條析件下泡的基刑因表脖達(dá)情復(fù)況。②不同添組織蠻、細(xì)襪胞在捕不同宏時(shí)段伙的mR符NA種類倘不同(即基脫因的截表達(dá)獲譜不值同)，同裂種生拆物的cD企NA文庫(kù)斤有組被織細(xì)成胞的稍界定躬，如廈肝組振織或旁胚胎湊組織棋。6/禮26絞/2耕02自369分離包純化匙目的霸基因目的伴基因+材ve莖ct藏or拼=重組DN齡A分子6/回26眉/2滋02充370噬菌奶粒的癥包裝含有cD邁NA插入堤片段壘的重孤組噬明菌粒巡壽只有悠經(jīng)過(guò)昆體外對(duì)蛋白靠外殼偏包裝雙反應(yīng)鼻，才號(hào)能成極為具鋒有侵勉染和投復(fù)制濱能力嫂的成愉熟噬得菌體世。6/酒26估/2輛02鞭371與載體連接成重組DNA侵染大腸桿菌進(jìn)行克隆合成雙鏈DNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA從細(xì)胞中分離出mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶噬菌粒的包裝6/休26亡/2爹02傘372五、異基因鐮文庫(kù)薪的篩拼選1、核綢酸雜諒交法平板戴上的讀菌落轉(zhuǎn)移硝酸陸纖維刃素膜溫育堿變板性用蛋謊白酶K去除偏蛋白遣質(zhì)形成孤菌落DN留A印跡80適℃烘烤坊濾膜DN誤A固定與探嚇針雜繁交檢測(cè)鴨雜交柱結(jié)果6/恐26遵/2猾02才3732、PC魯R篩選扁法1）、默設(shè)計(jì)后特異蓮性引溜物；2）、復(fù)將文壯庫(kù)保駕存在撫多孔歉培養(yǎng)冷板上障，對(duì)漫每個(gè)陸孔進(jìn)唐行PC犯R擴(kuò)增服；3）、瞧對(duì)陽(yáng)械性孔快進(jìn)行徹稀釋渾至次合級(jí)孔韻，再裳對(duì)每傻個(gè)孔靠進(jìn)行PC轟R擴(kuò)增膨，直柜至鑒治定出項(xiàng)與目相的基蜓因?qū)Ω畱?yīng)的抖單克盜隆。6/許26棄/2瞇02損3743、免拔疫篩宰選法適用只范圍頑：表覆達(dá)文餓庫(kù)用某蠶個(gè)基寸因產(chǎn)爪物的惹特異文性抗掛體對(duì)尸重組摸克隆西進(jìn)行杏篩選綱。文庫(kù)鋪于平板轉(zhuǎn)移至NC保存原板,λ噬菌體表達(dá)加入一抗洗去一抗,加入二抗加底物顯色從保存板中挑出陽(yáng)性菌落6/灶26程/2碌02精3756/是26旨/2遇02紫376第四削節(jié)SN缸P理論冊(cè)及應(yīng)柿用SN屈P，中寄文翻棟譯為反單核法苷酸夫多態(tài)嚴(yán)性，京指基煙因組DN嗓A序列括中由需于單農(nóng)個(gè)核鳳苷酸勾的突沒變而伙引起訊的多物態(tài)性香。SNP轉(zhuǎn)換（2/3）：C→T，A→G顛換（1/3）：C→A，G→T，C→G，A→T位置基因編碼區(qū)（cSNP)基因周邊區(qū)（pSNP)基因間（iSNP)同義cSNP非同義cSNP6/北26派/2咳02善377單倍見型：位于做染色災(zāi)體上蝴某一絡(luò)區(qū)域凡的一眼組相敲關(guān)聯(lián)箱的SN遞P等位說(shuō)位點(diǎn)還被稱惹作單網(wǎng)倍型(ha狼pl懷ot滲yp礙e)。6/歪26壺/2界02稿378SN繼P的檢夠測(cè)技笨術(shù)1、基做因芯友片技女術(shù)概念粘：就是告將大沙量探近針?lè)謵雷庸陶`定于節(jié)支持訂物上邪，根糖據(jù)堿宣基互錘補(bǔ)配國(guó)對(duì)原捏理，箱與標(biāo)麗記的循樣品飛分子瓣進(jìn)行墊雜交井，通釣過(guò)檢谷測(cè)雜決交信硬號(hào)的牲強(qiáng)度約及分介布進(jìn)叮而獲譽(yù)取樣城品中睛靶分魚子的奸數(shù)量帽和序揉列信餡息。6/抹26換/2額02防379基因林芯片喝的工勝作原扔理：應(yīng)用路已知凡核酸淘序列兇作為伯靶基鮮因與槽互補(bǔ)發(fā)的探辟針核割苷酸腹序列雜交，通忘過(guò)隨劣后的信號(hào)醋檢測(cè)進(jìn)行丹定性剃與定做量分京析。具體建操作:①將許若多特獎(jiǎng)定的耍寡核默苷酸保片段甘或cD檔NA基因沾片段戶作為持靶基萄因，茶有規(guī)持律地轉(zhuǎn)排列袋固定仍于支直持物仔上；②樣品DN桐A/范RN妻A通過(guò)PC貌R擴(kuò)增忠、體企外轉(zhuǎn)司錄等秩技術(shù)福摻入總熒光思標(biāo)記靜分子傻或放邀射性?shī)释诲\素作牛為探朵針；6/亮26鞭/2嘆02越380③然后關(guān)按堿乘基配黨對(duì)原燥理將埋兩者倆進(jìn)行珠雜交;④再通田過(guò)熒江光或廁同位法素檢抹測(cè)系富統(tǒng)對(duì)卡芯片縣進(jìn)行汁掃描塞，由喬計(jì)算耀機(jī)系趣統(tǒng)對(duì)謠每一仔探針瓦上的才信號(hào)賢作出藝比較斧和檢帽測(cè)，棗從而幣得出緒所需胡要的嘴信息題。6/醉26可/2災(zāi)02沿3812、Ta炎qm粘an技術(shù)在反溫應(yīng)體店系中勒加入2種不同酒熒光走標(biāo)記羨的探酬針，勁這兩增個(gè)探天針?lè)之媱e與齡兩個(gè)捧等位經(jīng)基因衣完全儉配對(duì)福。探針劇設(shè)計(jì)俘運(yùn)用碧了熒龍光共犁振能籃量轉(zhuǎn)寸移；Ta蜻q酶5'→3'外切肚酶的拴活性甲；通過(guò)插不同扇熒光鍛值的綠變化指，對(duì)牙基因難型進(jìn)團(tuán)行分遮型。6/臨26勤/2圍02螺3823、分座子信踏標(biāo)（Mo籍le偵cu固la范r械Be視ac棋on滲P國(guó)ro蹲be）是一傍種呈長(zhǎng)環(huán)狀推結(jié)構(gòu)沉的熒軋光標(biāo)起記的去寡核燃苷酸貴，環(huán)座狀區(qū)敵與靶想序列掩特異沉性結(jié)斤合，辜莖干月區(qū)由5~練8個(gè)堿僵基對(duì)果組成章，5'端帶浙有熒持光發(fā)賞生基長(zhǎng)團(tuán)，3'端帶量有熒只光猝鋼滅基欣團(tuán)。6/征26勢(shì)/2描02貢383RQQRExcitation分子辯信標(biāo)（Mo惹le盒cu級(jí)la持r皂Be鋒ac題on貌P釘ro椅be）6/坊26村/2淚02嚼3844、焦粥磷酸伏測(cè)序反法是一壺種短句片段軋焦磷磨酸測(cè)辦序技氧術(shù)，也在測(cè)猶序引燒物的甲引導(dǎo)愁下，鋤完成悉短片陵段（嚷含SN步P）的夜測(cè)序羞，從秒而實(shí)斤現(xiàn)基角因分局型。缺點(diǎn)愧：不挖能檢售測(cè)長(zhǎng)嚇片段帶，對(duì)摸于重隆復(fù)序場(chǎng)列沒蛾有辦誦法。6/光26旦/2澡02奴385原理:生成1分子dNTP加入1分子PPi與APS反應(yīng)ATP硫酸化酶的作用下生成ATP使螢光素氧化螢光素生成雙磷酸酶降解6/左26姑/2駛02千386原理1、測(cè)序騰引物地與PC閃R擴(kuò)增陣的單晨鏈DN辣A模板約相結(jié)售合。然港后將援其與DN峰A聚合伍酶、AT昏P硫酸傾化酶歷、熒吐光素坑酶和拆雙磷愿酸酶英，以團(tuán)及底則物AP票S和熒剪光素久一起蚊孵育沉。2、4種dN筑TP之一促被加荷入反桑應(yīng)體碌系，額如與井模板幟配對(duì)性，此dN剪TP與引衛(wèi)物的湊末端救形成犁共價(jià)趴鍵，dN縮慧TP的焦勝磷酸筆基團(tuán)炭（PP適i）釋岔放出洪來(lái)。而捧且釋輛放出筆來(lái)的PP戚i的量錄與和載模板杏結(jié)合買的dN喪TP的量啊成正筒比。6/赴26卵/2敗02梨3873、AT俯P硫酸喘化酶泊在5’鼠-磷酰端硫酸曉腺苷(ad喉en辱os雞in跪e絕5′ph飯os蒙ph換os俱ul芳fa往te,棟AP餡S）存在名的情競(jìng)況下割催化PP貫i形成AT界P，AT弊P驅(qū)動(dòng)碗螢光動(dòng)素酶蠢介導(dǎo)叮的螢光斬素向氧化辯螢光腫素的轉(zhuǎn)踩化，宗氧化蟻螢光理素發(fā)奔出與AT聽P量成性正比絲式的可見控光信湊號(hào)。光擺信號(hào)讀由CC疫D攝像寸機(jī)檢呢測(cè)并司由相榆應(yīng)的躬軟件樣反應(yīng)柏為峰聰。每科個(gè)光對(duì)信號(hào)尸的峰搞高與役反應(yīng)扛中摻幟入的悼核苷舒酸數(shù)顯目成韻正比彎。6/笨26應(yīng)/2封02跌3884、AT或P和未憶摻入武的dN熔TP由雙已磷酸跌酶降顏解，嗚淬滅男光信際號(hào)，元并再覽生反深應(yīng)體逃系。5、然防后加井入下啦一種dN愛TP。最節(jié)終待敵測(cè)序演列的騰順序膀，即化可從帽反應(yīng)篇光強(qiáng)化的信腿號(hào)峰演中讀雄出。在體秀系中職使用鳴的是dA擦TP拳S而非dA犁TP，因冤為dA孕TP功S不是呼熒光苦素酶徹的底輪物，拼而且DN共A聚合梢酶對(duì)dA錘TP著S的催彎化效相率更尺高。6/東26良/2衫02餓389SN隔P的應(yīng)蝦用1、人微類基臟因單倉(cāng)倍型夫圖的赴繪制策；2、SN光P與人赤類疾宰病易珍感基蓄因的姐相關(guān)仗性分雁析；3、指穩(wěn)導(dǎo)用洽藥與州藥物察設(shè)計(jì)炭。6/溉26句/2側(cè)02督390第五欣節(jié)岡基隸因克也隆技耳術(shù)克隆個(gè)體水平細(xì)胞水平基因水平6/個(gè)26欺/2蘇02忠391一、RA濁CE(Ra舌pi救d匠am殺pl擇if乞ic頌at河io陪n飄ofcD銳NAen赤ds)主要側(cè)通過(guò)PC拆R技術(shù)驕由已窮知的借部分cD帳NA序列刻來(lái)得詞到完趟整的cD勢(shì)NA的5′和3′端，增又被正稱為鞭單邊PC齡R澆(o演ne權(quán)s么id征ed倒P裁CR礎(chǔ))和錨編定PC售R累(a悠nc蛙ho鴿re領(lǐng)d唐PC剩R)。6/喬26棄/2搬02養(yǎng)392主要時(shí)步驟欠：1、獲延得高姿質(zhì)量RN持A;2、去磷欠酸化您作用；（手帶帽慈子結(jié)綠構(gòu)的mR鑄NA不受壤影響吵）3、去掉mR管NA的帽裂子結(jié)衰構(gòu)，蜜加特異拿性RN期A接頭并用RN健A連接務(wù)酶連晚接；4、以特異祥性寡摔聚dT為引忌物，得在反衛(wèi)轉(zhuǎn)錄聚酶的綢作用賞下合成瘦第一綢條cD五NA鏈，其略包括宣寡聚抬接頭延的互蓋補(bǔ)序底列；5、分戒別以誘第一爬條cD帳NA鏈為親模板南進(jìn)行RA扶CE反應(yīng)字。6、純岸化后蘿的PC限R產(chǎn)物蓬克隆廣到載木體進(jìn)燙行序列憑分析。6/備26瞎/2討02友393Ca植lf子I齒nt毛es膜ti竭na郊lPh境os鍛ph哪at掩as青e(CI此P)牛小尾腸磷杯酸酶To隸ba聰cc災(zāi)o邪Ac循idPy淺ro彈ph柔os樹ph陰at售as棉e(TA駕P)煙草席酸性航焦磷喂酸化稈酶高質(zhì)描量RN癢A去磷箱酸化去掉mR扇NA的帽槳子結(jié)閃構(gòu)加特馬異性RN允A接頭以特兼異性場(chǎng)寡聚dT為引揮物，壯合成骨第一耳條cD穗NA鏈6/幻玉26堵/2藥02倡394二、壩應(yīng)用cD箏NA差示時(shí)分析誘法克表隆基采因PCR指數(shù)形式擴(kuò)增雙鏈線性形式擴(kuò)增單鏈原理通過(guò)酶切，降低基因組DNA的復(fù)雜性更換cDNA兩端接頭6/五26狡/2際02轉(zhuǎn)3956/點(diǎn)26劍/2寇02奧396試驗(yàn)澡材料(T胖es幟te弊r)探針額材料(D辣ri芳ve店r)酶切試驗(yàn)咱材料(T蛇es理te啦r)探針蘆材料(D伍ri故ve淚r)標(biāo)記加上潛接頭,擴(kuò)增兩者競(jìng)混勻,變性,復(fù)性,具有院同源旬性的披片段國(guó)雜交,是非蘇特異聾性基榨因沒雜沫交的引，可然能是貓?zhí)禺惔刃曰?，餡經(jīng)過(guò)刮這樣2-謠3次循痕環(huán)，馬基本寸上可繪以把幣特異留性基遺因分跪離出鋸來(lái)6/絨26碑/2霞02謙397第六狠節(jié)牽蛋蜜白質(zhì)周組與裁蛋白緞質(zhì)組抓學(xué)技忘術(shù)雙向素電泳填（tw沸o假di閘me敬ns容io攀na塌l椅el捐ec飛tr斥op驢ho守re開si弓s,膏2-壩DE彈)技術(shù)亡，是椒大多肉數(shù)蛋姥白質(zhì)車組研征究中焰分離蘋復(fù)雜鵝蛋白雷質(zhì)混推合物范的首廚選技扔術(shù)蹲。將來(lái)靈自于全細(xì)墳胞、組織或生瓶物體遞中所飛包含挽的多丙達(dá)幾鑰千種混合四蛋白箭質(zhì)進(jìn)行分離、檢測(cè)和分析。一、腳雙向橋電泳且技術(shù)6/屯26秋/2暫02臟3982-勢(shì)DE包括素等電柄聚焦那（is坊oe結(jié)le麻ct牧ri非cfo縮慧cu議si昆ng倡,朝IE晚F）及SD瞎S-淺PA疏GE兩種廊電泳穴技術(shù)轎。該塌方法峰根據(jù)鴿蛋白押質(zhì)的王兩個(gè)墓性質(zhì)尖即等電煮點(diǎn)和分子日量。以兩拴性電譽(yù)解質(zhì)焰為介告質(zhì)的急電泳梢體系渣，不子同等滿電點(diǎn)永蛋白撇會(huì)聚原集在尺介質(zhì)李的不煮同區(qū)他域（餐等電篩點(diǎn)）化；SD沈S-樂(lè)PA桂GE將不獄同分凝子量腥的蛋娘白質(zhì)泰分離胃。6/峰26揀/2亭02擊399凝膠辟的圖脅像處痕理和仔分析典型今流程凝膠墊圖像輔的掃叢描：圖像紅加工蛛：斑點(diǎn)判檢測(cè)歉和定吊量：凝膠案配比習(xí)：數(shù)據(jù)雪分析境：數(shù)據(jù)厘呈遞皺和解進(jìn)釋：2-寨DE數(shù)據(jù)浪庫(kù)的帝建立井：6/關(guān)26醬/2堆02受310飾0二、渠蛋白慶質(zhì)免罷疫印謊跡實(shí)召驗(yàn)原理引：確保挎蛋白超質(zhì)解柴離為裹單個(gè)櫻多肽包亞基絨能與SD恢S結(jié)合月；通過(guò)劈燕分離睡膠的瓶篩分僵作用金，將濟(jì)蛋白減質(zhì)多蜜肽按孝分子趟量的易大小杜不同性得到均分離里；將蛋白萌質(zhì)固止定于皮膜上哭；以抗萬(wàn)體識(shí)泄別待今檢蛋記白（博抗原逢）。固定物2AbE蛋白質(zhì)（抗原）1Ab6/覺26還/2勸02楊310筑1典型使的印支跡實(shí)聞驗(yàn)包貝括五掛個(gè)步誰(shuí)驟：①叔蛋白汽樣品肉的制太備；②濤經(jīng)過(guò)SD成S-濱PA糾GE分離著樣品使；③辟將電破泳后信凝膠羊上的覺蛋白蹲質(zhì)轉(zhuǎn)碑移至塵固體挽膜上愉，用躲非特她異性喝，非肉反應(yīng)族活性赴分子江封閉責(zé)固體鋼膜上索未吸基附蛋趴白質(zhì)襪區(qū)域堂；④晶用固酬定在盡膜上道的蛋鞋白質(zhì)辜作為拋抗原怎，與巴固定慮的非此標(biāo)記孤抗體醬結(jié)合勵(lì)；⑤洗去勸未結(jié)濃合的銹一抗梨，加捆入標(biāo)危記的河二抗開，通患過(guò)顯造色或影放射吉自顯雅影法扯檢測(cè)堆凝膠噴中的鋒蛋白俘質(zhì)成闊分。6/導(dǎo)26暗/2梳0