細(xì)胞凋亡及其相關(guān)進(jìn)展

細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)及其相關(guān)進(jìn)展昆明(kūnmínɡ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所殷露瑋第一頁，共九十一頁。精選ppt1.細(xì)胞凋亡的概述2.細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑3.重要(zhòngyào)的凋亡調(diào)控基因

4.常見細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法內(nèi)容第二頁，共九十一頁。精選ppt細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的概述一、細(xì)胞凋亡的概念(gàiniàn)1．凋亡概念的形成

1972年，Kerr發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎鼠門靜脈后，電鏡觀察到肝實(shí)質(zhì)組織中有一些細(xì)胞體積收縮、染色質(zhì)凝集。這些細(xì)胞從其周圍的組織中脫落并被吞噬且機(jī)體無炎癥反應(yīng)。1972年Kerr等首次提出了細(xì)胞凋亡(Apoptosis)

的概念。Apoptosis一詞來源于希臘，原意指秋天樹葉的凋落以及花瓣的散落，其語源是apo(off,離去之意),ptosis(falling，凋落之意）。第三頁，共九十一頁。精選ppt英國人悉尼(xīní)·布雷內(nèi)、美國人羅伯特·霍維茨和英國人約翰·蘇爾斯頓，。（2002年）“fortheirdiscoveriesconceringgeneticregulationoforganofdevelopmentandprogrammedcelldeath”第四頁，共九十一頁。精選ppt

英國科學(xué)家悉尼·布雷內(nèi)。1951年在南非威特沃特斯蘭大學(xué)完成了他的碩士學(xué)業(yè)，1954年取得英國牛津大學(xué)博士學(xué)位，現(xiàn)任職于美國加利福尼亞州伯克利的分子科學(xué)研究所。他選擇線蟲作為新穎的實(shí)驗(yàn)生物模型，這種獨(dú)特的方法使得基因分析能夠和細(xì)胞的分裂、分化，以及器官的發(fā)育聯(lián)系起來，并且能夠通過顯微鏡追蹤這一系列過程(guòchéng)。布雷內(nèi)在英國劍橋完成的這些發(fā)現(xiàn)為他獲得諾貝爾獎(jiǎng)奠定了基礎(chǔ)。第五頁，共九十一頁。精選ppt秀麗隱桿線蟲1090－131＝959（cells）屬無脊椎動(dòng)物線形動(dòng)物門線蟲綱個(gè)頭小1mm最大特點(diǎn)：體細(xì)胞數(shù)恒定發(fā)現(xiàn)線蟲ced3

49基因直接(zhíjiē)與細(xì)胞凋亡相關(guān)，而且這些基因在高等哺乳類動(dòng)物也有普遍意義。

第六頁，共九十一頁。精選ppt2．細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的概念細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因嚴(yán)格控制的細(xì)胞自主的有序死亡。也常常被稱為細(xì)胞程序死亡（programmedcelldeath）凋亡細(xì)胞被吞噬細(xì)胞吞噬。第七頁，共九十一頁。精選ppt第八頁，共九十一頁。精選ppt4．細(xì)胞凋亡與細(xì)胞程序性死亡的區(qū)別細(xì)胞凋亡一詞出現(xiàn)之前的1965年，Lockshin等在研究蛾的變態(tài)發(fā)育過程中已發(fā)現(xiàn)存在著細(xì)胞程序性死亡（Programmedcelldeath，PCD）現(xiàn)象。

——PCD是個(gè)功能性的概念(gàiniàn)，描述在一個(gè)多細(xì)胞生物體中某些細(xì)胞死亡是個(gè)體發(fā)育中,一個(gè)預(yù)定的并受到嚴(yán)格程序控制的正常組成部分。

—— 細(xì)胞凋亡則是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念，描述一件有著一整套形態(tài)學(xué)特征的與壞死完全不同的細(xì)胞死亡形式。第九頁，共九十一頁。精選ppt3．細(xì)胞凋亡的生理意義組織(zǔzhī)分化、器官發(fā)育免疫系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡（損傷修復(fù)和衰老細(xì)胞的清除）抵御外界各種因素干擾舉例：1.胸腺

2.哺乳期乳腺發(fā)育第十頁，共九十一頁。精選ppt

凋亡(diāowánɡ)時(shí)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變

空泡化固縮出芽(chūyá)邊集凋亡(diāowánɡ)小體第十一頁，共九十一頁。精選ppt第十二頁，共九十一頁。精選pptDAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)﹐是一種能夠與DNA中大部分A，T堿基相互(xiānghù)結(jié)合的熒光染料﹐常用與熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜﹐它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。

第十三頁，共九十一頁。精選ppt熒光染料標(biāo)記(Hoechst33342、PI)的凋亡細(xì)胞(染色質(zhì)凝聚).流式細(xì)胞儀鑒別(jiànbié):正常細(xì)胞:低藍(lán)(hocehest+)/低紅(PI+);凋亡細(xì)胞:高藍(lán)(hocehest++)/低紅(PI+）壞死細(xì)胞:低藍(lán)(hocehest+)/高紅(PI++);

第十四頁，共九十一頁。精選ppt二、細(xì)胞(xìbāo)凋亡的形態(tài)學(xué)及生化特征1．細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征往往涉及單個(gè)細(xì)胞。凋亡細(xì)胞連接消失，與周圍的細(xì)胞脫落。細(xì)胞體積變小(皺縮)，細(xì)胞質(zhì)濃縮。胞膜結(jié)構(gòu)完整，有泡狀突起。細(xì)胞核染色質(zhì)濃縮，聚集核膜周圍。在胞漿中出現(xiàn)由降解的胞漿和胞核成分(chéngfèn)包裹于膜性成分(chéngfèn)中形成的凋亡小體(Apoptoticbodies)。無內(nèi)容物外溢，因而不引起周圍的炎癥反應(yīng)。第十五頁，共九十一頁。精選ppt生化(shēnɡhuà)特征細(xì)胞色素(sèsù)C誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不同時(shí)間DNA電泳圖第十六頁，共九十一頁。精選ppt生化(shēnɡhuà)特征1胞漿內(nèi)Ca2+濃度升高(繼而激活核酸內(nèi)切酶發(fā)生最早)。2細(xì)胞內(nèi)活性氧增多。3RNA/蛋白質(zhì)合成(說明凋亡是主動(dòng)耗能過程與某些基因表達(dá)變化有關(guān))。4DNA內(nèi)切酶活性被激活升高，雙鏈DNA在核小體之間切斷形成185bp為基數(shù)的有序片段(piànduàn)。5Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶和需鈣蛋白酶（Calpain）活性升高。注：Ⅱ型谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶是Ca2+依賴酶，可促進(jìn)蛋白質(zhì)谷氨酰胺與賴氨酸殘基之間的交聯(lián)，使細(xì)胞膜出現(xiàn)凹陷、皺縮，促進(jìn)凋亡小體的形成。另外絲氨酸蛋白酶（如粒酶B),一氧化氮合酶（NOS),PARP,calpain,等也參與細(xì)胞的凋亡過程。第十七頁，共九十一頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的生化改變和凋亡有關(guān)的兩個(gè)酶DNase作用：切割染色質(zhì)DNA特點(diǎn)：Ca2+/Mg2+增強(qiáng)活性，Zn2+抑制(yìzhì)其活Casepases作用：滅活凋亡抑制物水解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，形成凋亡小體水解凋亡相關(guān)活性蛋白特點(diǎn)：一類特異的在天冬氨酸之后切割靶蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族（cysteine-containingaspartate-specificprotease）第十八頁，共九十一頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)壞死的概述一般過程：因補(bǔ)體反應(yīng)(fǎnyìng)或烈性病毒感染破壞了質(zhì)膜，或者能量依賴性離子泵被破壞產(chǎn)生的鈉鉀等離子沿著各自的濃度梯度進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致細(xì)胞吸水膨脹，最終破膜而死。特征：線粒體膨脹，細(xì)胞骨架降解，溶酶體釋放，細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)沉淀靠近核膜邊，蛋白質(zhì)合成下降，由于膜破裂，出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。第十九頁，共九十一頁。精選ppt3．細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死的區(qū)別細(xì)胞壞死細(xì)胞凋亡細(xì)胞形態(tài) 腫脹(zhǒngzhàng) 皺縮胞漿腫脹濃縮 胞膜 受損完整、泡狀核染色質(zhì) 染色質(zhì)不規(guī)則,移位濃縮聚集核膜周DNA斷裂方式不規(guī)則在核小體間整倍性斷裂結(jié)局 崩潰 凋亡小體誘導(dǎo)原因 病理生理或病理基因調(diào)控 -

+炎癥反應(yīng) 有 無第二十頁，共九十一頁。精選ppt壞死(huàisǐ)細(xì)胞凋亡細(xì)胞第二十一頁，共九十一頁。精選ppt第二十二頁，共九十一頁。精選ppt第二十三頁，共九十一頁。精選ppt細(xì)胞(xìbāo)凋亡的過程大致分為如下四個(gè)階段：凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡基因激活凋亡的執(zhí)行(zhíxíng)凋亡細(xì)胞的清除第二十四頁，共九十一頁。精選ppt第二十五頁，共九十一頁。精選ppt第二十六頁，共九十一頁。精選ppt誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的因子

物理性因子：射線(紫外線X射線等)，較溫和的溫度刺激(如熱激冷激)等化學(xué)及生物因子：活性氧基團(tuán)(jītuán)和分子,DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑,激素,細(xì)胞生長因子缺失,腫瘤壞死因子（TNF)第二十七頁，共九十一頁。精選ppt細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的分子調(diào)控機(jī)理線蟲（C.clengans）凋亡研究(yánjiū)發(fā)現(xiàn)ced3、ced4基因促進(jìn)細(xì)胞凋亡，ced9基因阻止ced3/ced4的激活，抑制細(xì)胞凋亡。Ced3哺乳類同源物是ICE（interleukin－1－converingenzyme）即Caspase-1Ced4哺乳類同源物97年被證實(shí)為Apaf-1(apoptosisproteaseactivtingfactor)一種細(xì)胞凋亡蛋白酶活化因子）Ced-9哺乳類對(duì)應(yīng)物較早證實(shí)為Bcl-2

總結(jié):ced3殺手基因

ced4即使殺手基因又是存活基因且為兩者的聯(lián)系因子

ced9存活基因

第二十八頁，共九十一頁。精選ppt

細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

細(xì)胞凋亡的過程：接受凋亡信號(hào) 凋亡調(diào)控子間的相互作用Caspase激活和級(jí)聯(lián)反應(yīng)(fǎnyìng) 死亡底物的活化 細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的兩大途徑： 由死亡受體(Fas、TNFR)介導(dǎo)的外源途徑。在這條途徑中，caspase-8首先被激活；線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源途徑。在這條途徑中，caspase-9首先被激活。細(xì)胞凋亡后期的共同途徑：Caspase的激活。第二十九頁，共九十一頁。精選ppt

凋亡(diāowánɡ)過程如何發(fā)生？第三十頁，共九十一頁。精選pptCaspase致細(xì)胞(xìbāo)凋亡變化機(jī)制1．凋亡抑制物

正常(zhèngcháng)活細(xì)胞核酸酶和抑制物結(jié)合CAD-ICAD，Caspase激活的脫氧核糖核酸酶（caspase-activated

deoxyribonulease

CAD）2．破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

核纖層蛋白(核膜的骨架結(jié)構(gòu))作為底物被Caspase裂解染色質(zhì)的固縮

3．調(diào)節(jié)蛋白喪失功能

作用于幾種與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)有關(guān)的酶或蛋白，改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)DNA修復(fù)有關(guān)的酶、mRNA剪切蛋白和DNA交聯(lián)蛋白第三十一頁，共九十一頁。精選ppt

胞外信號(hào)分子誘導(dǎo)(yòudǎo)的細(xì)胞凋亡途徑

一、死亡受體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)（外源途徑）

死亡受體均屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，它們(tāmen)與相應(yīng)的配體（Ligand）結(jié)合后信號(hào)分子相互聚集并于細(xì)胞內(nèi)銜接蛋白（adapotorprotein）結(jié)合，這些銜接蛋白又募集在受體部Procaspase相互活化產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。

第三十二頁，共九十一頁。精選ppt

下游Caspase活化后，作用于底物，核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解Dnase結(jié)合蛋白，使Dnase釋放，降解DNA形成DNAladder；裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架(gǔjià)和其他蛋白,使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜質(zhì)PS重排,便于吞噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬。TNFR超家族成員及其配體分子主要包括Fas(又稱CD95)

/FasL、TNFR/TNF、DR3及TRAILR/TRAIL。第三十三頁，共九十一頁。精選ppt死亡(sǐwáng)受體介導(dǎo)的凋亡途經(jīng)示意圖第三十四頁，共九十一頁。精選ppt

二、線粒體介導(dǎo)的凋亡(diāowánɡ)途經(jīng)線粒體不僅是細(xì)胞能量代謝的中心，而且在起源于細(xì)胞內(nèi)部的死亡信號(hào)所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中處于中心位置。這些細(xì)胞內(nèi)部的死亡信號(hào)源自各種因素，如DNA損傷(sǔnshāng)、氧化壓力、X-射線、化療藥物、營養(yǎng)缺乏等等。因而，線粒體所介導(dǎo)的凋亡途徑又稱為細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑，其過程大致如下:1．線粒體滲透轉(zhuǎn)運(yùn)孔（PTP）的開放和線粒體跨膜電位（△ψ）的消失，Bcl-2家族蛋白對(duì)于PT孔的開放和關(guān)閉起關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用2.細(xì)胞色素c從線粒體中的釋放和Caspase-9的激活.第三十五頁，共九十一頁。精選ppt凋亡(diāowánɡ)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑第三十六頁，共九十一頁。精選ppt

2004年4月21日，美國科學(xué)院宣布，王曉東被選為該院院士，這是美國科學(xué)界的最高榮譽(yù)。在目前的美國科學(xué)院院士中，42歲的王曉東是最年輕的一位。主要研究領(lǐng)域(lǐnɡyù)：細(xì)胞凋亡的生化途徑。第三十七頁，共九十一頁。精選ppt凋亡(diāowánɡ)的調(diào)控細(xì)胞凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過程。這些基因在種屬之間非常(fēicháng)保守，如Caspase家族、Bcl-2家族、抑癌基因P53、IAP家族等。抑制凋亡基因：Bcl-2，IAP（凋亡抑制蛋白）促進(jìn)凋亡基因：wtP53，Bax，ICE（caspases亞型）雙向調(diào)控基因：c-myc，Bcl-x第三十八頁，共九十一頁。精選ppt一、Caspase是凋亡的執(zhí)行者Caspase(Cysteineaspartaticacicspecificprotease)：在特異的天冬氨酸之后切割靶蛋白的一類進(jìn)化上保守的半胱氨酸蛋白酶。又稱半胱天冬酶（胱冬蛋白酶）。1．Caspase家族特征Caspase通常以酶原（Procaspase）的形式存在，相對(duì)分子質(zhì)量為29-49kD。N末端具有一個(gè)原結(jié)構(gòu)域（Prodomain），C端同源(tónɡyuán)區(qū)存在半胱氨酸激活位點(diǎn)，此激活位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域?yàn)镼ACX(G、Q或R)G。第三十九頁，共九十一頁。精選ppt2.Caspases的分類根據(jù)在細(xì)胞凋亡中起的作用，Caspases分為兩大類：啟始Caspase(Initiator)和效應(yīng)(xiàoyìng)Caspase(Effector)1）啟始Caspases包括-2，-8，-9，-10等，對(duì)細(xì)胞凋亡的刺激信號(hào)作出反應(yīng)，啟動(dòng)細(xì)胞的凋亡過程；2）效應(yīng)Caspases包括-3，-6，-7等，是在細(xì)胞凋亡過程中的具體執(zhí)行者，完成對(duì)特定蛋白底物的水解。第四十頁，共九十一頁。精選pptCaspase活化基本有兩種機(jī)制，即同源(tónɡyuán)活化和異源活化，這兩種活化方式密切相關(guān)，一般來說后者是前者的結(jié)果，發(fā)生同源活化的Caspase又被稱為啟動(dòng)caspase.通常caspase-8,

10,

2介導(dǎo)死亡受體通路的細(xì)胞凋亡，分別被募集到Fas和TNFR1死亡受體復(fù)合物，而Caspase-9參與線粒體通路的細(xì)胞凋亡，則被募集到Cyt

c/d

ATP/Apaf-1組成的凋亡體（apoptosome）。

異源活化（hetero-activation）即由一種caspase活化另一種caspase是凋亡蛋白酶的酶原被活化的經(jīng)典途徑。被異源活化的Caspase又稱為執(zhí)行caspase.執(zhí)行Caspase不象啟動(dòng)Caspase

，不能被募集到或結(jié)合起始活化復(fù)合體，它們必須依賴啟動(dòng)Caspase才能活化。

第四十一頁，共九十一頁。精選ppt圖：ICE家族(jiāzú)成員A：3類caspase：藍(lán)色參與炎癥反應(yīng)，紅色為執(zhí)行者，綠色為啟動(dòng)者；B：caspase-3的結(jié)構(gòu)模型；C：caspase-3的活化過程引自KatjaC.Zimmermann等2001

第四十二頁，共九十一頁。精選ppt3．Caspase激活的機(jī)制非活化(huóhuà)的Procaspase（前體）存在，其激活依賴于以其他的caspase在他的天冬位點(diǎn)裂解（釋放一個(gè)大亞基和一個(gè)小亞基，形成四聚體）活化或自身活化。當(dāng)Caspase-8活化后，他一方面作用于Procaspase－3，另一方面使Bid裂解成兩個(gè)片段，其中含BH3結(jié)構(gòu)域的C-端被運(yùn)送到線粒體，域Bcl-2/Bax的BH3結(jié)構(gòu)域形成復(fù)合物，導(dǎo)致細(xì)胞色素C釋放。Cytc與胞質(zhì)中ced－4同原物Apaf－1結(jié)合并活化Apaf－1，再活化procaspase-9，最后引起凋亡。第四十三頁，共九十一頁。精選pptCaspase以一種有序的的方式(fāngshì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行“破壞”，通過切斷細(xì)胞與周圍的聯(lián)系，拆散細(xì)胞骨架，阻斷細(xì)胞DNA復(fù)制和修復(fù)，干擾mRNA剪切，損傷DNA與核結(jié)構(gòu)，從而使細(xì)胞降解為凋亡小體。因此，可以說Caspase在細(xì)胞凋亡過程中的作用處于中心地位。第四十四頁，共九十一頁。精選pptBcl-2家族、線粒體與細(xì)胞(xìbāo)凋亡Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳動(dòng)物中的同原物，能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合；Bcl-2蛋白(dànbái)羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域，Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)保守的Bcl-2同源區(qū)，及BH1，BH2,BH3.第四十五頁，共九十一頁。精選ppt

二、Bcl-2基因(jīyīn)家族

根據(jù)它們對(duì)細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)作用結(jié)果的不同，可將Bcl-2家族成員分為兩類：

一類能抗細(xì)胞凋亡，如Bcl-2、Bcl-xL、Al、Bcl-w、Mcl-1。在這類分子中，都含有Bcl-2同源區(qū)1-4(Bcl-2homologydomains，BH1-BH4)的結(jié)構(gòu)。另一類能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，有Bax、Bak、Bcl-xS、Bik、Bad、Bid、Hrk。在這類分子中，根據(jù)它們的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，又分為兩個(gè)亞族：①Bax亞族，如Bax、Bak、Bok，都有BH1、BH2和BH3的結(jié)構(gòu)；②BH3-only亞族（只有BH3的結(jié)構(gòu)），如Bik、Bad、Bid、Hrk，。第四十六頁，共九十一頁。精選ppt圖Bcl-2家族(jiāzú)引自KatjaC.Zimmermann等2001第四十七頁，共九十一頁。精選pptBcl-2基因(jīyīn)家族的結(jié)構(gòu)特征抑制細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)所必需促進(jìn)細(xì)胞(xìbāo)凋亡所必需第四十八頁，共九十一頁。精選ppt

summary

Bcl-2家族各成員可以形成(xíngchéng)二聚體，二聚體中的某一單體對(duì)另一單體的功能具有促進(jìn)或抑制作用。因此某一細(xì)胞中抑制因子與激活因子的比例決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。第四十九頁，共九十一頁。精選pptIAP(inhibitorofapoptosisprotein)

為一組具有抑制凋亡作用的蛋白質(zhì)，首先是從桿狀病毒基因組克隆到。在人類中，已發(fā)現(xiàn)IAP至少有五種：c-IAP1、c-IAP2、NIAP、XIAP和Survivin。

1．IAP的特征：

IAP家族是哺乳動(dòng)物體內(nèi)唯一被發(fā)現(xiàn)的Caspase抑制劑。所有的IAP都含有(hányǒu)對(duì)抗凋亡作用非常重要。三、

IAP家族(jiāzú)第五十頁，共九十一頁。精選ppt．IAP的拮抗蛋白果蠅中對(duì)IAP有拮抗作用的蛋白：Reaper,HidandGrim。在哺乳類中,2000年Wang和Vaux領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)分別發(fā)現(xiàn)了Smac和DIABLO。結(jié)果證明為同一蛋白。故稱此蛋白為Smac/DIABLO。Smac/DIABLO在凋亡中的兩個(gè)功能：i）結(jié)合在IAP上，拮抗IAP的作用，促進(jìn)凋亡。ii）促使(cùshǐ)procaspase3從無活性形式切割成成熟形式。研究發(fā)現(xiàn)Smac/DIABLO的N端的7個(gè)氨基酸，對(duì)其激活caspase3的能力是必須的。此7個(gè)氨基酸序列與Reaper,Hid與Grim中的14個(gè)氨基酸的序列是保守的。第五十一頁，共九十一頁。精選ppt

四、P53基因(jīyīn)家族

1．P53基因（分子警察）

p53并非為所有細(xì)胞的凋亡過程所必需，但對(duì)DNA損傷而誘發(fā)的細(xì)胞凋亡卻是必不可少的。1）p53的兩大功能：

使細(xì)胞在G1期停滯。當(dāng)DNA由于各種原因損傷后，p53首先誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1期，抑制細(xì)胞增殖，直至損傷的DNA修復(fù)。一旦DNA不能被修復(fù)，p53就會(huì)活化那些(nàxiē)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的基因轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。野生型P53還可逆轉(zhuǎn)變異細(xì)胞為正常細(xì)胞。第五十二頁，共九十一頁。精選ppt例如caspase-8切割胞質(zhì)促凋亡蛋白Bid。Bid是Bcl-2家族中只包含BH3domain的亞家族中的一員。Bid經(jīng)切割后轉(zhuǎn)移至線粒體膜，和Bad結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞色素c（cytochromec）從線粒體中釋放出來。Cytochromec再依次使Apaf-1激活casepase-9。在多數(shù)情況(qíngkuàng)下這種交叉是少見的，兩條通路一般獨(dú)立發(fā)揮作用。

線粒體和死亡受體凋亡(diāowánɡ)通路緊密結(jié)合第五十三頁，共九十一頁。精選ppt

細(xì)胞(xìbāo)凋亡檢測(cè)

一、AnnexinV-FITC(結(jié)合膜表PS實(shí)驗(yàn)）二、細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性檢測(cè)三、核DNA片段檢測(cè)

1.DNALadder2.Tunel

法（優(yōu)點(diǎn)：原位標(biāo)記，定量分析）四、形態(tài)學(xué)鑒定鏡檢（DNA特異性染料Hochest33342，33258，DAPI)五、細(xì)胞凋亡反應(yīng)核心(héxīn)因子檢測(cè)六、流式細(xì)胞分析（Heochst33342/PI雙染色法）注：AnnexinV-FITC是一種標(biāo)記有熒光素的鈣依賴磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有很高的親和力，可特異性的與磷脂酰絲氨酸結(jié)合。第五十四頁，共九十一頁。精選ppt第五十五頁，共九十一頁。精選ppt第五十六頁，共九十一頁。精選ppt第五十七頁，共九十一頁。精選ppt

流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期時(shí)相實(shí)驗(yàn)(shíyàn)原理

流式細(xì)胞儀（FlowCytometryFCM）的工作原理是將待測(cè)細(xì)胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進(jìn)入充滿鞘液的流動(dòng)室。在鞘液的約束下細(xì)胞排成單列由流動(dòng)室的噴嘴噴出，形成細(xì)胞柱。通過對(duì)流動(dòng)液體中排列成單列的細(xì)胞進(jìn)行逐個(gè)檢測(cè)，得到該細(xì)胞的光散射和熒光指標(biāo)，分析出其體積、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、抗原等物理及化學(xué)特征。細(xì)胞內(nèi)的DNA含量隨細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標(biāo)記的方法(fāngfǎ)，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞內(nèi)DNA的相對(duì)含量進(jìn)行測(cè)定，可分析細(xì)胞周期各時(shí)相的百分比。第五十八頁，共九十一頁。精選ppt神經(jīng)細(xì)胞凋亡（體外培養(yǎng)）的研究模型(móxíng)與應(yīng)用1神經(jīng)營養(yǎng)因子的撤除與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)神經(jīng)生長因子（NGF)，腦源性神經(jīng)生長因子（BDNF）在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中重要作用，維持神經(jīng)元存活(cúnhuó)和功能?？捎脽o生長因子、無血清培養(yǎng)基、或加入生長因子抗體制作誘導(dǎo)凋亡模型。2低鉀引起的細(xì)胞凋亡（培養(yǎng)小腦粒細(xì)胞KCl濃度小于5mmol/l）3一氧化氮與細(xì)胞凋亡神經(jīng)元、內(nèi)生型皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞損傷后均可產(chǎn)生iNOS（誘生型一氧化氮合酶）。缺血性損傷可激活NO合酶。加入NO供體（如硝普納）可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第五十九頁，共九十一頁。精選ppt第六十頁，共九十一頁。精選ppt4

氧化損傷與神經(jīng)細(xì)胞凋亡原理同前，過量活性氧（reactiveoxygensppeciesROS）包括氧自由基和過氧化氫(ɡuòyǎnɡhuàqīnɡ)，引起氧化應(yīng)急損傷。腦組織對(duì)氧化損傷尤為敏感。神經(jīng)細(xì)胞凋亡被證實(shí)是缺血再灌注死亡經(jīng)神主要形式。氧化損傷參與急慢性神經(jīng)退行性疾病發(fā)生發(fā)展過程。AD中A-beta（淀粉樣蛋白）沉積誘導(dǎo)氧自由基形成和氧化損傷。暴露于過量過氧化氫或凋亡。提供NO供體誘導(dǎo)5蛋白磷酸酶和蛋白激酶抑制劑與細(xì)胞凋亡蛋白磷酸酶抑制劑抑制蛋白磷酸化，破壞蛋白功能，細(xì)胞死亡。神經(jīng)細(xì)胞中，藻毒素（OA)可使tau蛋白磷酸化，突觸結(jié)構(gòu)改變。第六十一頁，共九十一頁。精選ppt6DNA損傷制劑與核苷（阿糖胞苷）7鈣離子(lízǐ)的神經(jīng)毒作用線粒體內(nèi)鈣超負(fù)荷，引起線粒體膜通透性改變，細(xì)胞色素C釋放，激活Caspase。8興奮型神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)毒作用谷氨酸濃度過高，神經(jīng)毒作用，機(jī)制可能與鈣離子濃度升高、自由基形成。半胱氨酸蛋白酶（caspase）激活等有關(guān)。9beta－淀粉樣蛋白與神經(jīng)細(xì)胞凋亡10脂類與細(xì)胞凋亡11紫外線照射與細(xì)胞凋亡第六十二頁，共九十一頁。精選ppt神經(jīng)細(xì)胞(shénjīnɡxìbāo)凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)1臺(tái)盼蘭排斥實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞膜完整性臺(tái)盼藍(lán)(TrypanBlue)是檢測(cè)細(xì)胞(xìbāo)膜完整性最常用的生物染色試劑。健康的正常細(xì)胞(xìbāo)能夠排斥臺(tái)盼藍(lán)，而死亡的細(xì)胞(xìbāo)，膜的完整性喪失，通透性增加，細(xì)胞(xìbāo)可被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色。依據(jù)此原理，細(xì)胞(xìbāo)經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，可通過顯微鏡，直接鏡下計(jì)數(shù)或拍照后計(jì)數(shù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞(xìbāo)存活率比較精確的定量分析。第六十三頁，共九十一頁。精選ppt

2細(xì)胞Hoechst染色Hoechst33342是一種(yīzhǒnɡ)可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料，對(duì)細(xì)胞的毒性較低。

正常細(xì)胞膜，Hoechst33342能少許進(jìn)入染上低藍(lán)色。凋亡細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)，進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst33342較正常細(xì)胞多，熒光強(qiáng)度較高。此外，細(xì)胞凋亡后DNA的結(jié)構(gòu)改變使染料更有效地結(jié)合DNA，并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵損傷不能染料排出都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強(qiáng)。而PI染料是不能進(jìn)入細(xì)胞膜完整的正常細(xì)胞和凋亡細(xì)胞中，即活細(xì)胞對(duì)PI染料拒染，而壞死細(xì)胞由于膜完整性在早期即已破損，可被PI染料染色。

第六十四頁，共九十一頁。精選ppt根據(jù)這些特性，用Hoechst33342結(jié)合PI染料對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行雙染色(rǎnsè)，就可在流式細(xì)胞儀上將正常細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞區(qū)別開來。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上，這三群細(xì)胞表現(xiàn)分別為：正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342+/PI+），凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色（Hoechst33342++/PI+），壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色（Hoechst33342+/PI++）。第六十五頁，共九十一頁。精選ppt

熒光染料(rǎnliào)標(biāo)記（Hocest、PI）的凋亡細(xì)胞（染色質(zhì)凝聚）

第六十六頁，共九十一頁。精選ppt3細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的分化染色細(xì)胞核用酸性染料染色，細(xì)胞質(zhì)這用堿性染料著色?？赏瑫r(shí)觀察細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的形態(tài)學(xué)變化。4細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸暴露由于AnnexinV-FITC(fluuoresceinisothiocyanate)也可標(biāo)記壞死細(xì)胞(xìbāo)，不特異。結(jié)合PI區(qū)分壞死及凋亡細(xì)胞。AnnexinV-FITC陽性且PI著色提示為壞死細(xì)胞。AnnexinV-FITC隱性且PI未染色提示為正常細(xì)胞。AnnexinV-FITC陽性且PI無染色提示為凋亡早期細(xì)胞。（AnnexinV-FITC陽性呈細(xì)胞表面綠色熒光，PI染色呈胞漿紅色).5掃描電子顯微鏡觀察方法6透射電鏡觀察方法第六十七頁，共九十一頁。精選ppt原位末端標(biāo)記（TUNEL法）實(shí)驗(yàn)(shíyàn)原理細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是分階段、漸進(jìn)的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段，然后在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，大約30﹪的染色體DNA在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成(xíngchéng)180-200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口即可產(chǎn)生一系列DNA的3’-OH末端。在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物可標(biāo)記到DNA的3’-OH末端，通過酶顯色反應(yīng)來進(jìn)行凋亡細(xì)胞的識(shí)別和檢測(cè)稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNELTdT-mediateddUTPnickendlabeling）第六十八頁，共九十一頁。精選ppt原位細(xì)胞凋亡(diāowánɡ)檢測(cè)（TUNEL法）原理第六十九頁，共九十一頁。精選ppt原位細(xì)胞(xìbāo)凋亡檢測(cè)（TUNEL法）實(shí)驗(yàn)程序第七十頁，共九十一頁。精選ppt第七十一頁，共九十一頁。精選ppt實(shí)驗(yàn)(shíyàn)試劑1．TUNEL-POD試劑盒（Roch公司，批號(hào)(pīhào):11684817910）試劑1:末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（TdT酶）試劑2:含有核苷酸混合液的反應(yīng)液試劑3:酶標(biāo)記抗熒光素抗體2．DAB試劑盒（北京中山金橋公司）試劑Ａ：Tris-HCl緩沖液試劑B：DAB溶液試劑C：過氧化氫溶液3．脫氧核糖核酸酶I（15000USigma公司）第七十二頁，共九十一頁。精選ppt主要(zhǔyào)試劑的配制1．0.2MA液和0.2MB液A液：稱取NaH2PO4·2H2O（分子量136.08）27.6g，雙蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中，加雙蒸水至終刻度。B液：稱取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.628g，雙蒸水溶解后倒入1000ml容量瓶中,加雙蒸水至終刻度。2．0.2mol/LPB液取A液19ml，B液81ml，充分混合，室溫(shìwēn)保存。第七十三頁，共九十一頁。精選ppt3．0.01mol/LPBS緩沖液取NaCl8.5-9g及0.2mol/LPB50ml加入1000ml容量瓶中，加雙蒸水至1000ml充分搖勻，室溫(shìwēn)保存。4．0.1mol/LHCl溶液取0.84ml濃鹽酸（HCl比重1.19，含量37%）加蒸餾水至100ml，充分混合，室溫保存。5．100mmol/LTris-HCl取Tris3.025g（Tris三羥甲基氨基甲烷，分子量為121.14）溶于200ml雙蒸水中充分?jǐn)嚢枞芙?，用濃鹽酸約3ml調(diào)節(jié)pH值至6.4，最后加雙蒸水定容至250ml，棕色瓶裝，室溫保存。第七十四頁，共九十一頁。精選ppt7．0.1%DEPC水1mlDEPC（二乙基焦碳酸酯）原液加入1000ml單蒸水中，間歇?jiǎng)×艺袷?，避光室?shìwēn)靜置12h以上。8．20μg/ml蛋白酶K1mg/ml儲(chǔ)備液：取蛋白酶K1mg加入10mMTris-HCl（pH7.4-8.0）1ml充分混合后，分裝成40份，－20℃儲(chǔ)存，用時(shí)再凍融；20ug/ml工作液（臨用前配制）：取蛋白酶K儲(chǔ)備液5μl加入10mMTris-HCl245μl再次稀釋，混合均勻。9．3%H2O2-甲醇取3%H2O240μl，加入2.0ml甲醇中（按1：50），混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。

第七十五頁，共九十一頁。精選ppt實(shí)驗(yàn)(shíyàn)步驟1．染色前處理

（1)玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進(jìn)行處理。（包被(bāobèi)目的以防止染色中切片脫落）

（2)組織固定：常規(guī)4%多聚甲醛/0.01MPBS(pH7.0-7.6)或10%中性甲醛固定4h以上，石蠟包埋。（目的最大限度保持組織細(xì)胞原有形態(tài)結(jié)構(gòu)）（3)石蠟切片常規(guī)脫蠟入水二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5-10min(脫蠟務(wù)必干凈)，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級(jí)酒精溶液中各3-5min，再放入蒸餾水中3min。第七十六頁，共九十一頁。精選ppt10．TUNEL反應(yīng)液1液1μl；2液9μl，混勻，置于冰上備用(bèiyòng)。11．二氨基聯(lián)苯（DAB）溶液1ml單蒸水中加入A液，B液，C液各一滴（約50μl）混合均勻，避光保存，30min內(nèi)使用完。12．5%牛血清白蛋白（BSA）0.5mg牛血白蛋白加入10ml單蒸水中溶解。注意應(yīng)先加牛血清白蛋白，再加入單蒸水混勻時(shí)避免漩渦混勻，4℃保存。第七十七頁，共九十一頁。精選ppt13．脫氧核糖核酸酶I（DnaseI）將15000U

DnaseI溶解于0.15M氯化鈉溶液（5mg/ml）1ml中，分裝成50份，－80℃保存。每份20μl，每次取20μl加入0.15M氯化鈉溶液中180μl再次(zàicì)稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。第七十八頁，共九十一頁。精選ppt2．每張切片加一滴或50μl新鮮稀釋至20μg/ml的蛋白酶K（10mMTris-HCl147μl加入1mg/ml蛋白酶K3μl），37℃消化30min，0.01MPBS洗5min×3次(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10-60s，新鮮石蠟切片消化5-10min，陳舊石蠟切片消化10-30min)。陽性對(duì)固定過程中照加入DnaseI室溫(shìwēn)孵育10min0.01MPBS洗5min×3次。（目的暴露固定過程中因交聯(lián)作用被遮蔽的蛋白抗原，同時(shí)部分消化細(xì)胞膜利于后續(xù)試劑的進(jìn)入）第七十九頁，共九十一頁。精選ppt3．0.1%DEPC水浸泡，室溫30min。0.01MPBS洗5min×3次。（目的減少消除外源性核酸內(nèi)切酶造成的假陽性）4．標(biāo)記甩去切片上多余液體，標(biāo)本片擦干組織及周邊水分(shuǐfèn)，按每張切片滴加凋亡試劑盒1液和2液（按照1：9比例，在一次性PE手套上配制，多次抽吸，混合均勻）配成TUNEL反應(yīng)混合液（冰上操作）；陰性對(duì)照組只加入試劑2液，而不加1液；標(biāo)本上覆蓋塑料蓋片，置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記1h，4℃過夜（20h以上）。0.01MPBS洗5min×3次。(目的熒光素標(biāo)記的寡核苷酸在TdT酶作用下與凋亡細(xì)胞內(nèi)斷裂的DNA片段結(jié)合）第八十頁，共九十一頁。精選ppt5．新鮮配制3%H2O2-甲醇，室溫孵育15min。0.01MPBS液洗滌5min×3次。（目的封閉內(nèi)源性的過氧化物酶）6．每張切片加5%牛血清白蛋白封閉液50μl，37℃30min，甩掉封閉