細菌的分離培養(yǎng)和鑒定

關(guān)于細菌的分離培養(yǎng)和鑒定第1頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三一、細菌的分離1、從混雜微生物中獲得單一菌株純培養(yǎng)的方法稱為分離。

2、分離的目的在于從被檢材料中、或者從污染的眾多雜菌中分離出純的病原菌。第2頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三1)病料采集

病料：疑似細菌性疾病的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物以魚為例，常見癥狀：體色發(fā)黑，體表潰爛、充血、粘液增多，鰓、鰭破損，內(nèi)臟紅腫，腹水，眼球凸出或渾濁，肛門紅腫等等?；铙w病料→應考慮病原在疾病發(fā)展過程中的部位（上述癥狀）病料死后→應立即采集，越早越好第3頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三魚的解剖結(jié)構(gòu)：第4頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三

第5頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三2）無菌操作無菌操作是指在環(huán)境中一切有生命活動的微生物的營養(yǎng)細胞及其芽孢或孢子都不存在的狀態(tài)。微生物研究過程中，既要避免各種外界的微生物進入操作對象又要杜絕操作對象污染周圍環(huán)境的操作技術(shù)。無菌操作是對微生物學工作者最基本的要求，必須經(jīng)過嚴格訓練才能形成無菌操作素養(yǎng)。不論何種情況下，頭腦中都應該有這個概念。無菌操作貫穿于整個分離過程，例如：病料的采集、器材的準備、具體的操作。所用器械及物品均應事先滅菌備用，金屬器具包裝后高壓滅菌或煮沸30min，玻璃器皿可高壓滅菌也可干熱滅菌，膠皮塞、培養(yǎng)基等則要高壓滅菌。第6頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三3）細菌分離工具：接種環(huán)（接種前后都要嚴格過火滅菌）接種環(huán)境：無菌操作臺接種方法：平板劃線*以左手持平板，中指、無名指和小指托著平板底,拇指和食指打開上蓋，使蓋與底成30o角，以便劃線。*右手握接種環(huán)，先滅菌鉑絲部分，待絲燒紅后，再于火焰上滅菌金屬棒部分。把接種環(huán)上的病料涂在培養(yǎng)基一側(cè)，一般作5-8次劃線。將環(huán)上的多余細菌材料燒掉后，從第1次劃線引出第2次劃線；再從第2次劃線引出第3次劃線，如此反復3-4次劃線后，即可把整個平板表面劃滿，注意每一次劃線只能與上一次劃線重疊，這樣就可在最后的1-2次劃線上出現(xiàn)多量的單個菌落，以便進行純培養(yǎng)。第7頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三具體操作：取病料，將體表的泥沙等雜物用清水沖洗干凈取干凈托盤，將病料置于托盤中托盤置于工作臺上，接種前準備好酒精燈、接種環(huán)、酒精棉球、解剖刀、剪刀、鑷子等。事先作好準備工作，把所用的物品器械擺好解剖病料，將接種環(huán)燒紅冷卻后接觸病變部位，平板劃線。如體表創(chuàng)傷潰爛部位，病變內(nèi)臟。腹水可直接涂布平板平板置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察細菌生長狀況（注意：操作臺在使用前后都需要用酒精棉球擦拭臺面，保持操作臺的整潔）第8頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三二、細菌的培養(yǎng)培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是指由人工方法配合而成的，用于微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存菌種用的混合營養(yǎng)制品。培養(yǎng)基的種類①基礎(chǔ)培養(yǎng)基：含有一般細菌生長繁殖需要的基本營養(yǎng)物質(zhì)；可作為一些特殊培養(yǎng)基的基礎(chǔ)成分（普通營養(yǎng)瓊脂）②加富培養(yǎng)基：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入某些特殊營養(yǎng)物質(zhì)（如血液/血清、酵母浸膏或生長因子等）；用以培養(yǎng)對營養(yǎng)要求高的微生物（2216E）③選擇培養(yǎng)基：利用細菌對某種或某些化學物質(zhì)的敏感性不同；在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，利于所需分離的細菌生長，而抑制不需要的細菌生長，從而達到分離某種微生物的目的。（中國科學院海洋研究所專利：一種定量檢測鰻弧菌的選擇性培養(yǎng)基及其制備）【利用鰻弧菌對氨芐青霉素的抗性】④鑒別培養(yǎng)基：是一類含有某種特定化合物或試劑的培養(yǎng)基。某種細菌在這種培養(yǎng)基上培養(yǎng)后，產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，能與這種特定化合物或試劑發(fā)生某種明顯的特征性反應；從而達到區(qū)分不同的微生物。（TCBS）第9頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三

病料在接種培養(yǎng)基后，經(jīng)過一段時間，應檢查其生長狀況。首先用肉眼檢查有無細菌生長；若有，則需進一步檢查菌落是否純一。形態(tài)特征包括：大小、形狀、突起或扁平、凹陷、邊緣（光滑、波形、鋸齒狀、卷發(fā)狀等）、顏色（紅色、灰白色、黃色等）、表面（光滑、粗糙等）、透明度（不透明、半透明、透明等）和粘度等多數(shù)情況下，沿劃線生長較多的菌落，是待檢病原菌的可能性較大；少數(shù)零散分布或不在劃線上生長的菌落，多為雜菌。為慎重起見，可挑選若干個可疑菌落分別進行劃線，進一步純化培養(yǎng)如果需要擴大培養(yǎng)，可挑取單菌落接種至液體培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)第10頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三三、細菌的鑒定一）傳統(tǒng)方法：常規(guī)宏觀菌落形態(tài)學觀察,主要觀察菌落在其適合的培養(yǎng)基上的生長狀況。細菌的個體形態(tài)學觀察,即通過顯微鏡觀察。形態(tài)學鑒定輔以生化試驗在細菌鑒定中具有重要的意義（生化鑒定管、藥敏實驗等）二）儀器的自動化鑒定：VITEK系統(tǒng)、MIDI系統(tǒng)、BIOLOG系統(tǒng)、SENSITITRE系統(tǒng)、AUTOSCEPTOR系統(tǒng)以及MICROSCAN系統(tǒng)等（ATBExpression）三）分子生物學方法:基因測序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(PCR)、GC含量測定等第11頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三生化鑒定管

各種細菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對營養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供鑒別細菌之用第12頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三ATBExpression：自動化微生物鑒定和藥敏分析系統(tǒng)

第13頁，講稿共15頁，2023年5月2日，星期三分子生物學技術(shù)分子生物學鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測技術(shù),包括基因測序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(PC